تم تمويل هذه الدراسة جزئيا بالمؤسسة برايتفوكوس (إلى DS).

وافقت على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة بيتسبرغ الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان
1. إعداد الحلول
<ol><li>يعد النمو المتوسطة بالمكملين دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم)، وارتفاع الجلوكوز مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 2.5 مم L-الجلوتامين و 1 الأحماض MEM x الأمينية غير الأساسية. قبل الحارة وسائط الإعلام في حاضنة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.</li>
	<li>إعداد حل العامل الثاني ديسباسي 2 ٪ (wt/المجلد):<ol>
<li>تحضير حلاً أسهم من 100 مغ/مل ديسباسي الثاني بتذويب 30 ملغ ديسباسي الثاني في 300 ميليلتر حبيس مخزنة المالحة (50 مم حبيس/كوه الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم). وحدة التخزين هذه للفئران 3-4، ويمكن زيادتها أو أسفل استناداً إلى العدد الفئران للتجربة). ويمكن تخزين هذا المخزون لمدة أسبوع واحد على الأقل في 4 درجات مئوية.</li>
		<li>إعداد حل العامل ديسباسي 2% بإضافة 300 ميليلتر من 100 مغ/مل ديسباسي الثاني الأسهم إلى 1.2 مل دميم العقيمة والجلوكوز عالية وتصفية الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. وينبغي تنفيذ هذه الخطوة في التدفق الصفحي مجلس الوزراء تحت ظروف معقمة. قبل الحارة ديسباسي استعداد الثاني في حاضنة 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-الحصول على عيون الفأر
<ol><li>Euthanize الماوس باستخدام أي أسلوب المعتمدة ووضعه على منصة ماصة.</li>
	<li>ارتداء القفازات، وضع الإبهام والسبابة حول العين ودفع الجلد بلطف إلى برتوس مقلة العين.</li>
	<li>إدراج غيض مقص الزاوية بين مقلة العين والجلد وقطع بعناية في العين. لتجنب التلوث، بإيجاز وتراجع العين في الإيثانول 70%.</li>
	<li>فورا مكان العين في مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني) في طبق بتري.</li>
	<li>كرر الخطوات من 2.2-2.4 لإزالة العين الثانية.</li>
</ol>3. تشريح العين
<ol><li>بعناية إزالة النسيج الضام من العين تحت مجهر تشريح. يمكن أن يتم ذلك في برنامج تلفزيوني أو في طبق بتري الجافة.<ol>
<li>استخدام الملقط خياطة لرفع الأنسجة الضامة من مقلة العين، وقطع منها باستخدام مقص فاناس. لا تقطع الصلبة العينية لأنه من المستحيل عمليا الحصول على eyecups الخلفي سليمة إذا تم قطع الصلبة العينية.</li>
		<li>بعد تنظيف النسيج الضام، تبقى مقل العيون الناتجة عن ذلك في برنامج تلفزيوني للغسيل والخطوة التالية. ملاحظة: يجب إجراء كافة الخطوات التالية في التدفق الصفحي مجلس الوزراء تحت ظروف معقمة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>غسل العينين مرتين في حرارة قبل 37 درجة مئوية دميم (ارتفاع السكر). نقل مقل العيون في حرارة قبل 37 درجة مئوية دميم (ارتفاع السكر) باستخدام الملقط بعناية. نضح مقل العيون المتوسطة ونقل إلى متوسطة الطازجة في طبق جديد.</li>
	<li>نضح المتوسطة (ارتفاع السكر) دميم واحتضان العيون في الحل العامل الثاني قبل حرارة 2% (wt/المجلد) ديسباسي لمدة 45 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية. ملاحظة: في جميع الخطوات التالية، ضع والتلاعب بعيون أو eyecups في الأجلين المتوسط والنمو، التي سوف تحمي الأنسجة وتوفير وسيلة جيدة للتشريح.</li>
	<li>إزالة الحل الثاني ديسباسي وغسل العينين مرتين في المتوسط النمو يسفط المتوسطة القديمة وإضافة الجديدة المتوسطة النمو قبل حرارة 37 درجة مئوية (الشكل 1a). ملاحظة: بعد الانفصال من جانب ديسباسي الثاني، مقل العيون تصبح لينة.</li>
	<li>عقد العين بالملقط وجعل شق حول سيراتا أورا من كل العين باستخدام مقص فانس تحت مجهر تشريح توضع في التدفق الصفحي مجلس الوزراء.<ol>
<li>حفظ مقلة العين في الحل، بعناية إزالة القرنية الأمامي بتمديد قص حول محيط سيراتا أورا وسحب القرنية الأمامي بعيداً بعد أن تم القطع كاملة.</li>
		<li>إزالة كبسولة العدسة وظهاره قزحية المرتبطة مصطبغة بلطف سحبهم من فنجان العين مع الملقط التقليديهاستخدام (الشكل 1b، ج 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>احتضان eyecups الخلفي الناتجة في نمو متوسطة لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية لتسهيل انفصال الشبكية العصبية RPE.</li>
	<li>قطع eyecups الخلفي إلى 4 بتلات تحت مجهر تشريح توضع في التدفق الصفحي مجلس الوزراء. التخفيضات التي ينبغي أن تكون طويلة بما يكفي لشد فنجان العين، لكن قصيرة بما فيه الكفاية للاحتفاظ بتلات متصلة (الشكل 1 د).<ol>
<li>تسطيح فنجان العين وإزالة الشبكية العصبية عن طريق سحب بلطف جداً مع الملقط أثناء الضغط المتبقية مجمع RPE-المشيمية-الصلبة مع الملقط آخر (الشكل 1e). بدء سحب من الحواف بدلاً من المركز.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل جميع الأنسجة الذين تم إيواؤهم في طبق ثقافة عقيمة جديدة مليئة بحرارة قبل المتوسطة النمو 37 درجة مئوية.</li>
</ol>4-عزل خلايا RPE أولية
<ol><li>تلة واحدة عقد المجمع RPE-المشيمية-الصلبة الذين تم إيواؤهم مع غرامة سوبر الملقط، تقشر بلطف أوراق سليمة من RPE من الغشاء الركيزة الأساسية (غشاء بروخ 's) باستخدام سكين هلال microsurgical تحت مجهر تشريح وضعت في مجلس الوزراء الاندفاق الصفحي (الشكل 1f).<ol>
<li>نقل الأوراق RPE إلى الطبق ثقافة عقيمة جديدة تحتوي على متوسط النمو باستخدام ميكروبيبيتي P200. عند نقل أوراق RPE، الرطب نصائح ماصة مع متوسط النمو من بيبيتينج عدة مرات لمنع الأنسجة من الخلاف داخل الحافة. RPE سوف يكون واضحا يمكن تمييزها عن المشيمية: RPE تبدو أكثر البنى، بينما المشيمية أغمق وتبدو لزجة ورقيق.</li>
		<li>وبدلاً من ذلك، استخدم الهضم الأنزيمي وتفكك لطيف دون الملقط لفصل RPE من شرويد14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تغسل الأوراق RPE باستخدام 2-3 مرات قبل حرارة 37 درجة مئوية متوسط النمو في الطبق الثقافة العقيمة. بعد كل خطوة الغسيل، بعناية جمع أوراق RPE مع تجنب الأنسجة الأخرى مثل الحطام الشبكية أو المشيمية. في نهاية الغسيل الماضي جمع أوراق RPE مع ميكروبيبيتي P200 ووضعها في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة. ملاحظة: ليس هناك حاجة الطرد المركزي الأوراق RPE: أنهم سوف الرواسب بالجاذبية داخل 1 دقيقة.</li>
	<li>إزالة متوسط نمو إضافي استخدام ميكروبيبيتي P200. ريسوسبيند الخلايا في المتوسطة النمو قبل حرارة جديدة وتريتوراتي عليها باستخدام ميكروبيبيتي P200 لطف. تجنب تشكيل الفقاعات. تعليق خلية واحدة مثالية، ولكن أيضا تجنب الكثير من تريتوريشن، وإلا RPE الخلايا غير قادرة على البقاء على قيد الحياة. ونحن نوصي بلطف جداً تريتوريشن عن 40-50 مرة.</li>
</ol>5-استزراع الخلايا RPE
<ol><li>لوحة الخلايا على طبق من ثقافة.<ol>
<li>إذا تتطلب التطبيقات المتلقين للمعلومات من الخلايا RPE الاحتفاظ بهم القطبية، لوحة RPE الخلايا من الفئران 2 في أحد إدراج غشاء البوليستر 12 مم محملة مسبقاً في لوحات الثقافة 12-جيدا. طلاء الخلايا في الكثافة العالية هو المطلوب لأنه في هذه الحالة قادرة على الحفاظ على الخصائص الأصلية، مثل سداسية الشكل وتصبغ الخلايا RPE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>لا نقل اللوحة أو تغيير متوسط النمو ح 72 الأولى من استزراع. بعد 3 أيام، تحل محل المتوسطة القديمة مع متوسط النمو قبل حرارة الطازجة. بعد ذلك تغيير ثقافة المتوسط كل يوم. وبمجرد الحصول على خلايا RPE كونفلوينسي، تقليل FBS في المتوسطة النمو إلى 2 في المائة. ملاحظة: يمكن تقسيم الخلايا باستخدام التربسين 0.25%. ومع ذلك، بعد تقسيم قد تفقد الخلايا سداسية الشكل وتصبغ في الفقرات اللاحقة. ونحن لا ننصح بتقسيم الخلايا، ولكن إذا كان مطلوب من قبل تطبيقات المصب الثقافة، ونضع في اعتبارنا أن الخلايا الأولية لا يمكن أن باساجيد إلى أجل غير مسمى: هي معروفة لإزالة التمييز بعد الفقرات 5-7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mart&#237;nez-Morales, J. R., Rodrigo, I., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eye+development:+a+view+from+the+retina+pigmented+epithelium.">Eye development: a view from the retina pigmented epithelium.</a> Bioessays. 26, 766-777 (2004).</li><li>Lehmann, G. L., Benedicto, I., Philp, N. J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+protein+polarity+and+trafficking+in+RPE+cells:+past,+present+and+future.">Plasma membrane protein polarity and trafficking in RPE cells: past, present and future.</a> Exp Eye Res. 126, 5-15 (2014).</li><li>Fronk, A. H., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+retinal+pigment+epithelial+cells:+a+review+of+current+protocols+and+future+recommendations.">Methods for culturing retinal pigment epithelial cells: a review of current protocols and future recommendations.</a> J Tissue Eng. 7, (2016).</li><li>Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+properties+of+cultured+retinal+pigment+epithelium.">Barrier properties of cultured retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 16-26 (2014).</li><li>Lu, F., Yan, D., Zhou, X., Hu, D. N., Qu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+melanin-related+genes+in+cultured+adult+human+retinal+pigment+epithelium+and+uveal+melanoma+cells.">Expression of melanin-related genes in cultured adult human retinal pigment epithelium and uveal melanoma cells.</a> Mol Vis. 13, 2066-2072 (2007).</li><li>Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+melanin+and+lipofuscin+in+RPE+cell+culture+models.">Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models.</a> Exp Eye Res. 126, 61-67 (2014).</li><li>Saini, J. S., Temple, S., Stern, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Retinal+Pigment+Epithelium+Stem+Cell+(RPESC).">Human Retinal Pigment Epithelium Stem Cell (RPESC).</a> Adv Exp Med Biol. 854, 557-562 (2016).</li><li>Akrami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelium+culture;a+potential+source+of+retinal+stem+cells.">Retinal pigment epithelium culture;a potential source of retinal stem cells.</a> J Ophthalmic Vis Res. 4, 134-141 (2009).</li><li>Hu, J., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+studies+of+the+classical+retinoid+visual+cycle+and+retinoid-based+disease+processes.">The use of cultured human fetal retinal pigment epithelium in studies of the classical retinoid visual cycle and retinoid-based disease processes.</a> Exp Eye Res. , 46-50 (2014).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li><li>Reichhart, N., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+and+transporters+of+the+retinal+pigment+epithelium.">Ion channels and transporters of the retinal pigment epithelium.</a> Exp Eye Res. 126, 27-37 (2014).</li><li>Valapala, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal-mediated+waste+clearance+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+regulated+by+CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin+via+V-ATPase-MTORC1+signaling.">Lysosomal-mediated waste clearance in retinal pigment epithelial cells is regulated by CRYBA1/&#946;A3/A1-crystallin via V-ATPase-MTORC1 signaling.</a> Autophagy. 10, 480-496 (2014).</li><li>Shang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amino+acid+transporter+SLC36A4+regulates+the+amino+acid+pool+in+retinal+pigmented+epithelial+cells+and+mediates+the+mechanistic+target+of+rapamycin,+complex+1+signaling.">The amino acid transporter SLC36A4 regulates the amino acid pool in retinal pigmented epithelial cells and mediates the mechanistic target of rapamycin, complex 1 signaling.</a> Aging Cell. , (2017).</li><li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells.">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11, 1206-1218 (2016).</li><li>Pfeffer, B. A., Philp, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+of+retinal+pigment+epithelium:+Special+Issue.">Cell culture of retinal pigment epithelium: Special Issue.</a> Exp Eye Res. 126, 1-4 (2014).</li><li>Singh, S., Woerly, S., McLaughlin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+and+artificial+substrates+for+retinal+pigment+epithelial+monolayer+transplantation.">Natural and artificial substrates for retinal pigment epithelial monolayer transplantation.</a> Biomaterials. 22, 3337-3343 (2001).</li><li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat Protoc. 4, 662-673 (2009).</li><li>Ho, T. C., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+retinal+pigment+epithelium+following+isolation+with+a+gelatin+matrix+technique.">Tissue culture of retinal pigment epithelium following isolation with a gelatin matrix technique.</a> Experimental eye research. 64, 133-139 (1997).</li><li>Toops, K. A., Tan, L. X., Lakkaraju, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+three-step+protocol+for+live+imaging+of+intracellular+traffic+in+polarized+primary+porcine+RPE+monolayers.">A detailed three-step protocol for live imaging of intracellular traffic in polarized primary porcine RPE monolayers.</a> Exp Eye Res. , 74-85 (2014).</li><li>Gibbs, D., Kitamoto, J., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+phagocytosis+by+retinal+pigmented+epithelium+that+lacks+myosin+VIIa,+the+Usher+syndrome+1B+protein.">Abnormal phagocytosis by retinal pigmented epithelium that lacks myosin VIIa, the Usher syndrome 1B protein.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 6481-6486 (2003).</li><li>Gibbs, D., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigmented+epithelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 533, 347-352 (2003).</li><li>Pitk&#228;nen, L., Ranta, V. P., Moilanen, H., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+retinal+pigment+epithelium:+effects+of+permeant+molecular+weight+and+lipophilicity.">Permeability of retinal pigment epithelium: effects of permeant molecular weight and lipophilicity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 641-646 (2005).</li><li>Mao, Y., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+by+RPE+cells+in+culture.">Analysis of photoreceptor outer segment phagocytosis by RPE cells in culture.</a> Methods Mol Biol. 935, 285-295 (2013).</li></ol>

س تلقي التمويل من الرعاية الصحية باير ف. هوفمان-لاروش، ألمانيا وسويسرا للبحث. يعلن المؤلفون المتبقية لا تضارب المصالح المالية. ويدعم هذا العمل البحوث "منع العمى" (المنح غير مقيد إلى معهد ويلمر العين وجامعة بيتسبرغ).  ويدعم هذا العمل أيضا أموال بدء التشغيل إلى DS من طب العيون، جامعة بيتسبرغ.

يسمح البروتوكول مفصلاً قدم إنشاء موثوق بها الماوس الثقافات RPE الأولية التي تصل إلى كونفلوينسي بعد أسبوع واحد، وعرض الخصائص RPE الرئيسية مثل سداسية الشكل وتصبغ بعد أسبوعين. يمكن استخدام خلايا RPE التي تم الحصول عليها لعدد من التطبيقات المصب مثل فيتامين (أ) الأيض9، البلعمه من قطاع?...

ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هي طبقة واحدة من الخلايا الظهارية الاستقطاب الذي يقع بين الشبكية العصبية والمشيميه في العين. الأداء الوظيفي للخلايا RPE وسلامة أحادي الطبقة RPE حاسمة بالنسبة لرؤية سبب RPE دوراً رئيسيا في عمليات متعددة مثل الحفاظ على حاجز الدم-الشبكية الخارجي، نقل الماء والايونات بين الشبكية شرويد، على ضوء الاستيعاب، الحماية من الأكسدة، والسيطرة على عملية الأيض ريتينويد والبلعمه من الجزء الخارجي من1،فوتوريسيبتورس2. موقع RPE في الجزء الخلفي من العين، فضلا عن وظيفتها حاجز منع المخدرات تدار النظامية من المرور من الدم إلى الزجاجي، تجعل من الصعب على دراسة تعقيد RPE الدالة في فيفو. ومن ثم، هناك حاجة كبيرة لإنشاء RPE الثقافات الخلية لدراسة الخلايا RPE في بيئة مرنة، التي تسيطر عليها3،4.
ويوجد عدد من خطوط الخلايا RPE الراسخة، يوفر طريقة ملائمة وسهولة الحصول عليها وتخزينها في الخلايا؛ ومع ذلك، تحتوي الخلايا باساجيد بعض العيوب مقارنة بالخلايا الأولية2،،من34. أولاً، أنها غالباً ما تتسم بتغييرات في مورفولوجيا الخلايا. على سبيل المثال، لم يعثر أي من خطوط الخلايا الموجودة تكون مناسبة لدراسة موثوقة لخصائص RPE الحاجز بسبب فقدان الخلية القطبية النمط الظاهري واختفاء جزئي تقاطعات ضيق4. بالإضافة إلى فقدان قطبية والسليم خلية إلى خلية اتصالات، خطوط الخلايا RPE سرعان ما يفقد ما تصبغ نظراً للغياب الإنزيمات ميلانوجينيسيس الرئيسية في RPE الكبار5. يمكن استعادة التصبغ، ولكن التحليل الشامل لآلية إعادة تصبغ تشمل مزيجاً من مجهر إلكتروني، الجينات التعبير فحوصات التحليل والمواد الكيميائية للتأكد من وجود الميلانين قد ابدأ وقد أجرى6. القيد أكثر واحد هو أن خطوط الخلايا RPE الحياة الخلية الموسعة (في بعض الأحيان-الخلود) وفي ظل ظروف معينة، يمكن أن تتحول إلى تجديد الذاتي الخلايا الجذعية البالغة multipotent الذي فصل من الركازة وشكل عائم المستعمرات7، 8-هذا القيد يجعل من المستحيل استخدام خطوط الخلية لزرع الأعضاء والتجارب3.
قد RPE الابتدائي خلية الثقافات التي تم الحصول عليها من أنسجة جديدة نظراً لمساوئ خطوط الخلايا RPE المنشأة، بمثابة نموذج ذات صلة أكثر بيولوجيا للدراسة RPE. خلايا أولية RPE قد استخدمت ليس فقط لدراسة مهام محددة RPE مثل الأيض فيتامين (أ)9، البلعمه مستقبله شرائح الخارجي10 وأيون النقل11، ولكن أيضا لدراسة بيولوجيا الخلية الأساسية مثل طلائي قطبية الخلية2 والتوازن الليزوزومية أوتوفاجي،من1213.
في اليومين الماضيين من سنوات كان هناك عدد من المنشورات بشأن إنشاء الأولية RPE الثقافات، مما يشير إلى اهتمام متزايد في هذا المجال من البحوث3،،من1415. البروتوكولات العديدة للخلايا RPE البشرية وغير البشرية RPE الخلايا مثل الخلايا RPE البقر والخنزير وقد نشرت16،17،،من1819. ومع ذلك، أنها أكثر صعوبة في التعامل مع الماوس RPE الخلايا بسبب حجمها أصغر بكثير. على الرغم من أن عددا كبيرا من المنشورات وصف بروتوكولات لعزل الخلايا RPE من الماوس14،،من2021، لا تزال هناك العديد من الباحثين تكافح من أجل عزل الخلايا RPE دون تلوث شرويد الخلايا أو الخلايا من الحطام الشبكية العصبية. وهنا يقدم البروتوكول المتعلق بوضع الماوس الأساسي RPE ثقافة الخلية، بما في ذلك الحصول على العيون من الماوس، وتشريح العيون وعزل الأوراق RPE لإنتاج الخلايا لاستزراع. هذا البروتوكول الفيديو سيكون مفيداً بشكل خاص للباحثين الذين بدأوا العمل مع الماوس الأساسي RPE الثقافات وتحتاج إلى إرشادات بشأن تقنيات التشريح.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;animals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2~3-week old wildtype mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), 1X, pH 7.4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antibody</td><td>A gift from Dr. Michael Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Phalloidin&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Flour 568&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Polyclonal Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;instruments and equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow cabinet</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope (Zoom stereomicroscope)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator with hot air sterilization</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Polyester Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &amp;micro;m, Sterile</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Westcott tenotomy scissors, std blades, sharp</td><td>STEPHENS instruments</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo suturing forceps 0.12mm</td><td>Stroz Ophthalmic Instruments</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Crescent straight knife</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers #5, 11 cm, Straight, 0.1x0.06 mm Tips, Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Scissors, 8 cm, 45&amp;deg; Angle, Standard</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SLGL0250S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Laboratory Microscope&amp;nbsp;Leica DM IL LED</td><td>&amp;nbsp;Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier and non-filtered pipette tips</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium

ظهارة صباغ الشبكية (RPE) هو ظهارة متعددة الوظائف عالية استقطاب الذي يقع بين الشبكية العصبية والمشيميه في العين. أنها ورقة واحدة من الخلايا المصطبغة وجبات هاكسغنلي ومتصلة بواسطة تقاطعات ضيق. تشمل المهام الرئيسية ل RPE امتصاص الضوء، البلعمه من الجزء الخارجي مستقبله تسلط، التخزين المؤقت المكانية من أيونات، ونقل المواد الغذائية والايونات والماء، فضلا عن المشاركة النشطة في دورة البصرية. بهذه المهام الهامة والمتنوعة، أنها ذات أهمية حاسمة لدراسة بيولوجيا الخلايا RPE. وقد تم إنشاء عدد من خطوط الخلايا RPE؛ ومع ذلك، المعروف الخلايا باساجيد ومخلدة سرعان ما يفقد بعض الخصائص المورفولوجية والفسيولوجية الطبيعية RPE الخلايا. وهكذا، الخلايا الأولية أكثر ملاءمة لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا الخلايا RPE والدالة. الماوس الأساسي RPE خلية ثقافة مفيد جداً للباحثين نظراً لنماذج الماوس تستخدم على نطاق واسع في الدراسات البيولوجية، ومع ذلك جمع RPE الخلايا من الماوس أيضا صعبة للغاية بسبب صغر حجمها. نقدم هنا، بروتوكول لإنشاء الماوس الأساسي RPE خلية الثقافات التي تشمل انوكلييشن وتشريح العيون وعزل الأوراق RPE لإنتاج الخلايا لاستزراع. هذا الأسلوب يتيح استعادة كفاءة الخلية. RPE الخلايا التي تم الحصول عليها من اثنين من الفئران يمكن أن تصل إلى كونفلوينسي في أحد إدراج غشاء البوليستر 12 مم محملة مسبقاً في لوحة الثقافة بعد أسبوع واحد من عرض بعض الخصائص الأصلية لحسن النية RPE الخلايا مثل سداسية الشكل وتصبغ بعد سنتين والثقافة أسابيع للثقافة.

الماوس الأساسي RPE ثقافة المنشأة من الفئران 2 في 12 مم غشاء البوليستر إدراج يصل إلى 90-95% كونفلوينسي بعد أسبوع واحد في الثقافة. بعد أسبوعين ثقافة، وصلت إلى 100% كونفلوينسي الخلايا وبدأ بتشكيل فسيفساء خلايا سداسية والمصطبغة والمنبسطة ثنائية. قبل 3 أسابيع ثقافة، والخلايا تابع لت?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

ظهارة صباغ الشبكية (RPE) ظهارة متعدد الوظائف للعين. نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء الثقافات الخلية الأولية المستمدة من RPE مورين.

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

primary-cell-cultures-from-the-mouse-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. ظهارة صباغ الشبكية (RPE) ظهارة متعدد الوظائف للعين. نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء الثقافات الخلية الأولية المستمدة من RPE مورين.

Video: Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

نماذج تجريبية لدراسة فسيولوجيا صبغات الشبكية الظهارية والفيزيولوجيا المرضية

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Neuroscience

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

على المدى الطويل، زراعة خالية من المصل من النباتات الشبكية الماوس Organotypic مع ظهارة صبغة الشبكية سليمة

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

التوصيف والديناميكا المورفولوجية للفأر الأولي المستزرع RPE

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

تسليط الضوء على المؤلف: العزل الفعال للخلايا الظهارية الصبغية الأولية في شبكية العين من الفئران البالغة لأبحاث اعتلال الشبكية

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

الثقافة الأولية للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الخنازير

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

نماذج تجريبية لدراسة فسيولوجيا صبغات الشبكية الظهارية والفيزيولوجيا المرضية

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

على المدى الطويل، زراعة خالية من المصل من النباتات الشبكية الماوس Organotypic مع ظهارة صبغة الشبكية سليمة

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

طريقة مبسطة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية من الفئران البالغة

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

الثقافة الأولية للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الخنازير

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر