وقد أيد هذا المشروع جزئيا من خلال منحة للمعاهد الوطنية للصحة NIAID (لAJB وLGA، R01 AI076246). وأيد جمع متحولة السالمونيلا جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (لMM، U01 A152237-05، AI07397-01 R01، R01 R01 AI039557-11 وAI075093-01)، وذلك جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (لHAP، R21 AI083964-01، 1R0 1AI083646-01، 1R56AI077645، R01 AI075093). نشكر ستيفن Prowollik لطلاء طبق الأصل، والتأكيد على المسوخ في المجموعة.

1. الفئران بلعم RAW264.7 خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النمو المنخفض مرور عدد خلايا البلاعم الفئران، RAW264.7 (و® عدد ATCC، TIB-71) في T-75 خلية قارورة الثقافة تنفيس غطاء المرشح في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، و 0.5٪ NaHCO 3، و 1٪ 100X الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) عند 37 درجة مئوية، في 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا مرة واحدة تصل إلى نقطة التقاء 60-80٪ في قارورة، واستخدام مكشطة خلية لحصاد الخلايا، وعدد الخلايا في عدادة الكريات وحساب تركيز الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا ويخفف من تركيز الخلية إلى 2.5 × 10 5 / مل الطازجة DMEM في خلية ثقافة المتوسط. استخدام ماصات متعددة لوحة 200 ميكرولتر من DMEM خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على 5 × 10 4 الخلايا في كل بئر من 96 لوحات جيدا ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة أربعة آبار من كل سلالة السالمونيلا. تشكيل ثلاث لوحات منفصلة لمجموعة واحدةمن أكلة خلايا الغزو الفحص، ووضع علامة عليها مع &quot;جمعية&quot;، &quot;الغزو&quot; و &quot;تكرار&quot;، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات في 5٪ CO 2 الحاضنة عند 37 درجة مئوية على السماح للخلايا البلاعم لنعلق على الجزء السفلي من الآبار. </li></ol> 2. إعداد السالمونيلا من نوع البرية والمسوخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نفس اليوم من إعداد خلايا البلاعم RAW264.7، واختيار واحدة من المستعمرات البرية من نوع (WT) الملهبة السالمونيلا التيفية الفأرية المصلي 14028s، DinvA متحولة، DphoP متحولة، واختبار سلالات متحولة المطلوب، والثقافة لها في لوريا، Bertani ( LB) مرق تستكمل مع المضادات الحيوية حسب الاقتضاء. استخدام كل مجموعة من الخلايا البلعمية المقايسات الغزو لاختبار ما يصل إلى 10 سلالات متحولة (DinvA متحولة وDphoP متحولة لا عيب في غزو الخلايا وتكرارها، على التوالي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو البكتيريا لمدة 14 ساعة عند 37 درجة مئوية مع لياليhaking في 220 دورة في الدقيقة في كل 5 مل من مرق LB في توج فضفاضة 14 مل البولي بروبلين في أنبوب أسفل مستديرة. LB مرق يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة، في حالتنا، فإن معظم سلالات متحولة مقاومة لكاناميسين، 50 ميكروغرام / مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، ثقافة فرعية لكل من على ثقافات سلالات السالمونيلا في سهل 5 مل من مرق LB في نسبة 01:50 ل4 ساعة إضافية مع اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة OD 600 قيم كل ثقافة البكتيرية على طيفي، وكل قراءة أن يتراوح 0،6-1،2 لتحسين السالمونيلا جزيرة المرضية-1 النوع الثالث إفراز نظام (SPI-1 TTSS) التعبير الجيني للغزو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الصيغة من 1 OD 600 = 7.5 × 10 8 خلية / مل لتقدير تركيز البكتيريا، ثم تمييع البكتيريا إلى تركيز 5 × 10 6 خلية / مل في DMEM الطازجة خلية ثقافة المتوسط. </li></ol> 3. الغزو الفحص في 96 لوحة جيدا الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ثلاثة سل 96 جيدلوحات ثقافة لتر من الحاضنة CO 2 ويغسل مرة واحدة كل جيدا مع 200 ميكرولتر من العازلة 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل وإزالة كاملة من برنامج تلفزيوني، إضافة 200 ميكرولتر البكتيريا في DMEM المتوسطة (انظر أعلاه) في كل بئر. هذه النتائج في 1 × 10 6 خلايا السالمونيلا في كل جيدا وتعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 20: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحات في 1،000 x ج في الناقل مغلق لمدة 10 دقيقة، ثم استبدال لوحات (الساعة صفر) في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 30 دقيقة. لكل سلالة، وإنشاء ما لا يقل عن أربعة آبار مكررة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة، وإزالة لوحات من الحاضنة ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من 1X PBS لإزالة البكتيريا غير المصاحب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل، حفظ لوحة المسمى مع &quot;جمعية&quot; لمزيد من العلاج. إضافة 200 ميكرولتر من DMEM المتوسط ​​تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين إلى كل بئر من لوحات تحمل علامة &quot;الغزو&quot; و &quot;النسخ&quot; من أجل رس قتل السالمونيلا خارج الخلية. العودة لوحات إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة لساعة إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ بئر واحدة من كل سلالة المصاب لتسجيل عدد خلايا البلاعم، علاج بقية الآبار على لوحة &quot;جمعية&quot; مع 200 ميكرولتر من 1X PBS تحتوي على 1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة. فإن الحل تريتون ليز خلايا البلاعم والافراج عن السالمونيلا المرتبطة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد السالمونيلا من كل بئر ووضعها في أنابيب 1.5 مل إيبندورف. أداء ثلاث التخفيفات المسلسل 10 أضعاف مع 900μl 1X PBS على عينات تحصد من كل بئر، يتم تنفيذ دوامة بين كل التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة التخفيف الثالث، 10 -3، على أي LB (WT) أو LB اساسه (المسوخ) لوحات. تسمية لوحات مع السالمونيلا الاسم المناسب سلالة، عدد التخفيف، وأشر الوقت والتاريخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد vortexing لأنبوب تخفيف الثالث، الاستغناء عينة 10 ميكرولتر على سطح آغار وتكرار وعصرنا لما مجموعه 5 قطرات. تأكد من مساحة قطرات ميكرولتر 10 بالتساوي على خمس لوحات طبق بيتري 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد قطرات نقع في آغار، وتحويل لوحات مرارا واحتضان ليلا 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الآبار حفظها لفرز الضامة مع 150 ميكرولتر 1XPBS تحتوي على 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد trypsinization، الضامة المكان إلى 1.5 مل أنابيب إيبندورف وتعاملهم مع 50 ميكرولتر من FBS لتحييد الحل التربسين / EDTA، وصمة عار الخلايا مع 0.4٪ التريبان الأزرق ويسجل لهم من خلال استخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما انقضت حضانة ساعة واحدة، وإزالة &quot;الغزو&quot; وألواح &quot;التكرار&quot; من حاضنة CO 2، وغسل كل جانب &quot;الخطوة 3.4&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ وحة &quot;الغزو&quot; لمزيد من العلاج &quot;الخطوة 3،6-3،12&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من DMEM المتوسط ​​تحتوي على جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل لو&quot;تكرار&quot; لوحة للحفاظ على إزالة السالمونيلا خارج الخلية في المتوسط. العودة لوحة إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة ل22.5 ساعة إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وإزالة &quot;تكرار&quot; لوحة من 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة، ويغسل كل جانب &quot;الخطوة 3.4&quot; ويعاملهم &quot;الخطوة 3،6-3،12&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، وإزالة لوحات أجار بعد الحضانة بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية ويسجل عدد من المستعمرات البكتيرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يكون توزيع مستعمرة جيد بين 10 و 100 المستعمرات، كل بقعة يحتوي على ما يقرب من 2 إلى 20 المستعمرات، سيكون من الصعب أن يسجل إذا كان هناك أكثر من 20 مستعمرات في بقعة واحدة. إذا كان عدد منخفضة جدا أو مرتفعة جدا، replate العينة مع 10 أضعاف التخفيفات أعلى أو أقل حسب الحاجة. </li></ol> تحليل البيانات 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب (وحدات تشكيل مستعمرة لكل مل) كفو من كل لوحة على أساس الطلاءحجم وعامل التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التأكد من عدد السالمونيلا في البلاعم من خلال عدد خلايا البلاعم المسجلة من كل سلالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب سيلة هندسية من كفو في البلاعم من ثلاثة على الأقل من تجارب مستقلة لجمعية الخلايا، والغزو أو تكرار، على التوالي، وتطبيع أبعد إلى WT للقيمة النسبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات للجمعية، والغزو، والتكرار من قبل الطالب ر -test على التوالي، وذلك بمقارنة كل سلالة لWT، وتحديد الدلالة الإحصائية من قبل القيمة ص. </li></ol>

<ol>
	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).</li><li>Molinari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

We have nothing to disclose.

يتم استخدام الحماية فحص جنتاميسين على نطاق واسع لدراسة الغزو وتكرار مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا داخل الخلية المضيفة، ومن خصوصا أداة البيولوجية الهامة لدراسة مسببات الأمراض مثل السالمونيلا، التي الغزو هي الخطوة شرطا مسبقا لإقامة العدوى 1. يتم تط...

Nontyphoidal السالمونيلا هي الأسباب الهامة للأمراض المعوية في جميع الفقاريات. السالمونيلا في البشر هو من بين أكبر الأمراض التي تنقلها الأغذية البكتيرية 1. ويتحقق توصيف الآليات الجزيئية التي تدعم تفاعلات السالمونيلا مع المضيفين الحيوان بشكل رئيسي من خلال دراسة السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للالمصلي (STM) في نماذج زراعة الأنسجة الحيوانية والعدوى. سوف اكتساب رؤى في التفاعلات STM-المضيف تساعدنا على فهم كيفية السالمونيلا البقاء والنمو داخل الخلايا المضيفة. التحدي الأول في دراسة هذه التفاعلات هو تحديد العديد من العوامل المشاركة ممكن من كل من المضيف والممرض، ولكن يتم عرقلة هذه المساعي إلى حد كبير من قبل صعوبات كبيرة في التعامل مع اثنين من النظم البيولوجية المعقدة المستقلة في وقت واحد، أي المضيف والسالمونيلا، تحت الظروف الفسيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، repert كبيرoire من السالمونيلا والجينات المضيف المحتمل ترميز العوامل التي تدخل في التفاعلات البيولوجية المضيفة تتطلب منصة عالية الإنتاجية لمواجهة هذا التحدي. وتعديل، فحص موحد لجمعية النمط الظاهري السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الضامة مع القدرة الإنتاجية العالية وضعت لدراسة مجموعة كبيرة من الجينات المرجح الانخراط في التفاعلات السالمونيلا -host. وقد وضعت حماية فحص جنتاميسين في عام 1973 2، ولكن لأول مرة وصف دقيق من قبل Elsinghorst في عام 1994 3،4. أصبح الآن هو أداة موحدة لدراسة العديد من مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا خارج الجسم، بما في ذلك السالمونيلا 5،6. تجنب البكتيريا المنضوية التعرض للقتل من قبل بعض المضادات الحيوية، مثل جنتاميسين، التي لا يمكن ان تخترق الخلايا حقيقية النواة 3. من خلال الاستفادة من هذه الظاهرة، وحماية جنتاميسين فحص يقيس بقاء ونمو الخلايا باcterial مسببات الأمراض. ثلاثة أحداث أثناء العدوى، أي ارتباط مع الخلايا حقيقية النواة، والغزو والتكرار، يمكن تقييم لمسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا استنادا إلى الفاصل الزمني بين الإصابة والعلاج جنتاميسين، ومزيد من الحضانة (الشكل 1). خطوط الخلايا حقيقية النواة توفر بيئة الفسيولوجية التي هي أقل تعقيدا من النماذج الحيوانية ذات الصلة للدراسات التفاعل المضيف الممرض. حماية فحص جنتاميسين هو منصة مناسبة لدراسة التفاعلات STM-المضيف، ولكن الفحص القياسية في صحن الثقافة 24 جيدا لديه قدرة منخفضة الإنتاجية. وحدد التحليل الحسابي في الجسم الحي من مجموعات البيانات 149 منتجات السالمونيلا الجين الذي من المتوقع أن تتفاعل مع ما يقرب من 300 منتج الجين المضيف (بيانات غير منشورة). ليس لديها معيار جنتاميسين الحماية فحص القدرة على النمط الظاهري هذا العدد من المسوخ بكفاءة. في additأيون، وحماية فحص جنتاميسين يمكن كشف نظريا غزو حتى بكتيريا واحد. بسبب هذه الحساسية المتأصلة، البيانات الخام عرضة للالفروق الفنية عندما كرر في أوقات مختلفة. الضوابط الداخلية وعرض البيانات النسبي بعد تطبيع ضرورية لتفسير مغزى النتائج. ونظرا لهذه الاعتبارات، تم وضع تعديل، موحد جنتاميسين الحماية فحص لتعزيز قدرة الاختبار وزيادة الدقة. بروتوكول التالية هي مفصلة وموضحة لإجراء تعديل مقايسة حماية الجنتاميسين باستخدام أطباق ثقافة 96 جيدا والبلاعم RAW264.7 خط الخلية الفئران. مقارنة بروتوكول قياسي في أطباق ثقافة 24 جيدا، وبروتوكول تعديل والمزايا التالية: 1) عن طريق أطباق ثقافة 96 جيد يسمح ما يصل الى 10 سلالات متحولة مختلفة ليتم phenotyped بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية الداخلية مع قوة إحصائية كافية.2) يتم تخفيض التباين في النتائج بشكل كبير، لأنه يتم اختبار سلالات متحولة في صحن الثقافة نفسها وفي نفس الوقت؛ 3) استخدام ماصات متعددة القنوات يزيد الإنتاجية مع تقليل عامل التعب. وأخيرا، مقارنة مع 24 أطباق ثقافة جيدا، والتعامل مع مخاوف من خلايا أقل المضيفة لكل بئر في صحن الثقافة 96 جيدا من خلال تحسين وتوحيد بروتوكول. وباختصار، فإن تعديل، فحص موحد لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو وتكرارها في الخلايا البلعمية يزيد الدقة ويحقق القدرة الإنتاجية العالية مع خفض عامل التعب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

أنواع السالمونيلا ومسببات الأمراض الحيوانية المنشأ والأسباب الرئيسية للأمراض التي تنقلها الأغذية في البشر والماشية 1. فهم الآليات الكامنة وراء التفاعلات السالمونيلا -host تعتبر مهمة لتوضيح المرضية الجزيئي للعدوى السالمونيلا. حماية فحص جنتاميسين إلى النمط الظاهري جمعية السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الخلايا البلعمية تم تكييفها للسماح الفرز الفائق الإنتاجية لتحديد أدوار المسوخ حذف السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للالمصلي في التفاعلات المضيف باستخدام RAW 264.7 الضامة الفئران. بموجب هذا البروتوكول، التباين في القياسات وانخفاض كبير مقارنة مع بروتوكول قياسي، لأنه من النوع البري وسلالات متحولة متعددة يمكن اختبارها في صحن الثقافة ونفس في نفس الوقت. استخدام ماصات متعددة يزيد من الإنتاجية ويحسن الدقة. وعلاوة على ذلك، المخاوف المتعلقة باستخدام أقل حوتمت معالجة خلايا الحادي لكل بئر في صحن الثقافة 96 أيضا. هنا، كان يعمل بروتوكول لتعديل في المختبر باستخدام فحص السالمونيلا غزو الخلايا البلعمية بنجاح إلى النمط الظاهري 38 الفردية المسوخ السالمونيلا الحذف للجمعية، والغزو والتكرار داخل الخلايا. يتم عرض الظواهر في المختبر، وقد أكد بعض منها في وقت لاحق أن يكون في الظواهر الحية في نموذج حيواني. وهكذا، فإن تعديل، فحص موحد لجمعية النمط الظاهري السالمونيلا، والغزو وتكرارها في الضامة يمكن استخدامها مع القدرة الإنتاجية العالية على نطاق أوسع لدراسة التفاعلات البكتيرية المضيفة.

رؤية النتائج تمثيلية (الشكل 2) بعد يتم رسم البيانات على أساس تعديل أكلة غزو الخلايا الفحص. وتشمل البيانات خمس سلالات مختلفة، WT، ΔinvA، ΔphoP، متحولة A، B. ومتحولة Δ invA، والمعروف ليكون معيبا للغزو، وΔphoP المعروف أن تكون معيبة للنسخ المتماثل 8، وت...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages at JoVE.com

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

وتم إعداد مقايسة الإنتاجية العالية لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو، وتكرارها في الخلايا البلعمية مع القدرة الإنتاجية العالية. وقد استخدمت طريقة لتقييم السالمونيلا خروج المغلوب الجينات سلالات متحولة للتدخلات في التفاعلات المضيف الممرض.

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.5K Views.  Texas A&M University.  وتم إعداد مقايسة الإنتاجية العالية لفي المختبر النمط الظاهري السالمونيلا أو جمعية البكتيرية الأخرى، والغزو، وتكرارها في الخلايا البلعمية مع القدرة الإنتاجية العالية. وقد استخدمت طريقة لتقييم السالمونيلا خروج المغلوب الجينات سلالات ...

Video: High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus. However, there are two species, six subspecies, and over 2,500 different Salmonella serovars, and not all are equal in their significance to public health. For example, finding S. enterica subspecies IIIa Arizona on a table egg layer farm is insignificant compared to the isolation of S. enterica subspecies I serovar Enteritidis, the leading cause of salmonellosis linked to the consumption of table eggs. Serovars are identified based on antigenic differences in lipopolysaccharide (LPS)(O antigen) and flagellin (H1 and H2 antigens). These antigenic differences are the outward appearance of the diversity of genes and gene alleles associated with this phenotype.
We have developed an allelotyping, multiplex PCR that keys on genetic differences between four major S. enterica subspecies I serovars found in poultry and associated with significant human disease in the US. The PCR primer pairs were targeted to key genes or sequences unique to a specific Salmonella serovar and designed to produce an amplicon with size specific for that gene or allele. Salmonella serovar is assigned to an isolate based on the combination of PCR test results for specific LPS and flagellin gene alleles. The multiplex PCRs described in this article are specific for the detection of S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium.
Here we demonstrate how to use the multiplex PCRs to identify serovar for a Salmonella isolate.

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

We describe a multiplex PCR for the rapid detection of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium. Specific Salmonella serovars can be identified by targeting a multiplex PCR to genes and sequences unique to the O-antigen biosynthesis cluster and flagellin of a given serovar. Serovar is assigned then to a Salmonella isolate based on the appearance of specific, size amplicons (PCR product) corresponding to the target allele.

وPCR لتحديد Allelotyping السالمونيلا enterica serovars الملهبة ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

بروتوكول لتصيب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; مع<em&gt; السالمونيلا التيفية الفأرية</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

الكمي عصاري خلوي مقابل رغوي<em&gt; السالمونيلا</em&gt; في الضامة الابتدائية التي كتبها التفاضلية Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

مقايسة الفائق تقييم وتقدير حجم تشكيل العَدلات فخ خارج الخلية

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...