이 프로젝트는 (AJB 및 LGA, R01 AI076246에 대한) 건강 NIAID의 국립 연구소에 대한 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 살모넬라 균 돌연변이 수집은 부분적으로 국민 건강 보조금 연구소 (MM를 들어, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 및 R01 AI075093-01) HAP, R21에 대한 부분적으로 건강 보조금의 국립 연구소에 의해, (에 의해 지원되었다 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). 우리는 복제 도금 및 컬렉션의 돌연변이를 확인하기위한 스테 Prowollik 감사합니다.

1 쥐과 대 식세포 RAW264.7 세포 배양 <ol><li> 낮은 통로 번호 뮤린 대식구 세포 성장을 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 T-75 세포 배양 물 플라스크 벤트 필터 모자 RAW264.7 (ATCC ® 번호, TIB-71) (FBS) , 0.5 % 탄산 수소 나트륨, 1 %, 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 100 배 비 필수적인 아미노산 (NEAA). </li><li> 세포를 플라스크에서 60~80% 합류점에 도달하면, 세포를 수확 셀 스크레이퍼를 사용 hemacytometer에서 셀 카운트 및 세포 농도를 계산한다. </li><li> 세포를 재현 탁하고 신선한 세포 DMEM 배지에서 2.5 × 105 / ㎖로 세포 농도를 희석한다. 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 5 × 104 세포를 함유하는 세포 DMEM 배지 200 μl를 플레이트에 다 채널 피펫을 사용한다. </li><li> 각 살모넬라 균주의 네 우물 플레이트. 한 세트에 세 개의 분리 된 판을 설정식세포 침공 분석의, 각각 &quot;협회&quot;, &quot;침략&quot;과 &quot;복제&quot;로 표시합니다. </li><li> 대식 세포가 우물의 바닥에 부착 할 수 있도록 37 ° C ON에서 5 % CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 살모넬라 야생형과 돌연변이의 제조 2 <ol><li> 식세포 RAW264.7 세포를 제조 당일에, (야생형의 단일 콜로니 (WT) 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리엄 14028s, 루리아 - 베르 타니에 DinvA 변이체, DphoP 변이체, 원하는 시험 돌연변이 균주 및 배양들을 골라 LB) 브로스는 적절한 항생제로 보충. 10 돌연변이 균주 (DinvA 돌연변이 및 DphoP 돌연변이가 각각 침략과 세포 내 복제 결함)를 테스트하기 위해 식세포 침입 분석의 각 세트를 사용합니다. </li><li> 의 37 ° C에서 14 시간 동안 박테리아 성장둥근 바닥 튜브에 느슨하게 덮인 14 ㎖의 폴리 프로필렌에 5 ㎖의 LB 액체 배지에 각각 220 rpm에서 haking. LB 국물이 우리의 경우, 돌연변이 균주의 대부분은 카나마이신에 내성 적절한 항생제를 포함, 50 μg / ml의 </li><li> 다음 날, 220 rpm에서 진탕 추가로 4 시간 동안 1시 50분의 비율 LB 브로스의 일반 5ml에 살모넬라 균주의 배양 ON의 각 하위 문화. </li><li> 분광 광도계에 OD 각 세균 배양의 600 값을 읽고, 각 읽기는 살모넬라 균의 병원성 섬 - 1 타입 III 분비 시스템 침공 (SPI-1 TTSS) 유전자 발현을 최적화하기 위해 0.6-1.2 범위해야합니다. </li><li> 한 OD의 수식을 사용하여 (600) = 7.5 × 10 8 CFU 다음, 박테리아의 농도를 추정 신선한 DMEM 세포 배양 배지에서 5 × 106 CFU / ml의 농도로 희석 박테리아 / ㎖. </li></ol> 96 웰 배양 플레이트에서 3 침공 분석 <ol><li> 세 96 웰 CEL 제거리터 문화 CO 2 배양기에서 접시와 씻어 각 웰 1X PBS 버퍼 200 μL로 한 번. </li><li> PBS 세척하고 완전히 제거한 후, 각 웰에 200 ㎕의 균 DMEM 배지 (상기 참조)를 추가한다. 이 감염의 각 웰과 다양성 (20) (MOI)에서 1 × 10 6 살모넬라 균 세포에서 발생 : 1. </li><li> 다음 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 번호판 (0시)를 교체, 10 분 동안 밀폐 된 캐리어에 1,000 XG에 번호판을 원심 분리기. 각 균주의 경우, 적어도 네 중복 우물을 설정합니다. </li><li> 30 분 후, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 연결되지 않은 박테리아를 제거하는 1X PBS 200 μL로 3 회 씻는다. </li><li> 세척 후, 차후 치료를 위해 &quot;협회&quot;로 표시된 판을 저장합니다. 주문 t의 &quot;침략&quot;과 &quot;복제&quot;로 표시된 플레이트의 각 웰에 100 μg / ml의 겐타 마이신을 함유하는 DMEM 배지 200 μl를 추가오. 세포 외 살모넬라 균을 죽일 추가 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. </li><li> , 대식 세포 수를 기록하기 위해 각 균주로부터 잘 감염을 저장 한 10 분 동안 1 % 트리톤 X-100을 포함하는 1X PBS 200 ㎕를 사용하여 &quot;관련&quot;플레이트에 웰의 나머지 취급. 트리톤 솔루션은 대식 세포를 용해 및 관련 살모넬라 균을 발표 할 예정이다. </li><li> 각 웰에서 수확 살모넬라 및 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 배치합니다. 각 웰에서 수확 된 샘플에 900μl 1X PBS로 3 10 배 희석액을 수행 소용돌이는 각 희석 사이에 수행된다. </li><li> 하나 LB (WT) 또는 LB 칸 (돌연변이) 접시에 세 번째 희석, 10 -3, 플레이트. 적절한 살모넬라 균주 이름, 희석 수, 시각 및 날짜 판을 레이블을 지정합니다. </li><li> 셋째 희석 튜브를 볼 텍싱 한 후, 한천 및 반복 (F)의 표면 상에 10 ㎕의 샘플을 조제5 방울의 총에 대한 우리의 시간. 5 ~ 10 μL은 페트리 접시 플레이트 (7)에 균등하게 떨어진다 공간으로해야합니다. </li><li> 방울 후, 한천에 스며을 통해 판을 켜고 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하룻밤 배양한다. </li><li> 10 분 동안 0.25 % 트립신-EDTA를 포함하는 150 μL의 1XPBS와 대 식세포의 계산을 위해 저장 우물을 처리합니다. </li><li> 트립신 후, 1.5 ml의 에펜 도르프 튜브에 넣습니다 식세포와, 트립신 / EDTA 용액을 중화 FBS의 50 μL로 치료 0.4 % 트리 판 블루와 세포를 염색하고 hemacytometer를 사용을 통해 점수. </li><li> 한 시간 보육이 경과하면 CO 2 배양기에서 &quot;침략&quot;과 &quot;복제&quot;판을 제거하고, &quot;단계 3.4&quot;로 각 잘 씻는다. </li><li> &quot;단계 3.6-3.12&quot;로 추가 처리에 대한 &quot;침략&quot;판을 저장합니다. </li><li> 10 μg / ml의 겐타 마이신을 함유하는 DMEM 배지 200 μl를 추가&quot;복제&quot;플레이트 배지에서 세포 살모넬라의 간극을 유지한다. 추가로 22.5 시간 동안 5 % CO 2 배양기 37 ° C에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 다음 날, 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 &quot;복제&quot;플레이트를 분리하고, 각 씻어 아니라 &quot;3.4 단계&quot;와 &quot;단계 3.6-3.12&quot;로 취급합니다. </li><li> 마지막으로, 37 ° C 배양기에서 하룻밤 배양 한 후 한천 플레이트를 제거하고 세균 콜로니의 수를 점수. </li><li> 좋은 식민지 분포는 식민지 10 ~ 100, 각 지점은 약 2 식민지 20, 그것은 한 자리에서 20 개 이상의 식민지가 있다면 점수 어려울 것 포함해야한다. 필요에 따라 개수가 너무 낮거나 너무 높으면, 시료 replate 높거나 낮은 희석 10 배. </li></ol> (4) 데이터 분석 <ol><li> 도금에 기초하여 각각의 판의 CFU (ML 당 콜로니 형성 단위)를 계산볼륨 및 희석 배수. </li><li> 각 균주로부터 기록 된 대식 세포 수 당 살모넬라 통해 식세포의 개수를 확인. </li><li> 각각 연관 셀, 침윤 또는 복제하기위한 적어도 3 개의 독립적 인 실험에서 대식구 당 CFU의 기하 평균을 계산하고, 상대적인 값을 WT로 더욱 정규화. </li><li> WT에 대한 각각의 변형을 비교하여, 각각의 스튜던트 t -test 의해 협회, 침윤 및 복제에 대한 데이터를 분석하고, P 값에 의해 유의성을 결정한다. </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

We have nothing to disclose.

겐타 마이신 보호 분석법 널리 숙주 세포 내부의 세포 내 박테리아 병원균의 침입 및 복제를 연구하는 데 사용되며, 특히 그 내습 감염 하나를 설정하기위한 필수 공정이다 살모넬라와 같은 병원체를 연구하는데 중요한 생물학적 도구이다. 살모넬라 연구 커뮤니티의 표준 겐타 마이신 보호 분석은 24 웰 배양 접시 5에서 구현된다. 48 또는 96 웰 플레이트의 사용...

Nontyphoidal 살모넬라 균은 모든 척추 동물의 장내 질환의 중요한 원인이됩니다. 인간의 살모넬라증은 최고 세균성 식중독 질병 일 중 하나입니다. 자신의 동물 호스트와 살모넬라 균의 상호 작용을 뒷받침하는 분자 메커니즘의 특성은 주로 감염의 조직 문화와 동물 모델에서 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움 (STM)의 연구를 통해 달성된다. STM-호스트 상호 작용에 대한 통찰력을 확보하는 것은 우리가 살모넬라 균은 생존과 숙주 세포 내부에 성장하는 방법을 이해하는 데 도움이됩니다. 이러한 상호 작용을 연구의 첫 번째 과제는 호스트와 병원체 모두에서 가능한 한 많은 참여 요인을 파악하는 것입니다,하지만, 이러한 노력은 주로, 동시에 두 개의 독립적 인 복잡한 생물학적 시스템 즉, 호스트 및 살모넬라 균을 다루는 중요한 문제로 막혀, 생리 학적 조건 하에서. 또한, 큰 repert살모넬라 균의 oire 잠재적 호스트 상호 작용에 관여하는 요인을 인코딩 호스트 유전자는 이러한 문제를 해결하기 위해 높은 처리량 생물 플랫폼이 필요합니다. 수정, 표준화 된 분석은 가능성이 살모넬라 -host 상호 작용에 관여하는 유전자의 큰 세트를 검사하기 위해 개발 된 높은 처리 용량 대 식세포에서 살모넬라 협회, 침략과 복제를 표현형. 겐타 마이신 보호 분석은 1973이 개발되었지만, 첫째 철저하게 1994 3,4에 Elsinghorst에 의해 설명되었다. 지금은 살모넬라 5,6 포함한 생체 많은 세포 내 세균성 병원체를 공부하기위한 표준 도구가되었습니다. 내면화 된 세균은 진핵 세포 (3)를 통과 할 수 겐타 마이신 등 일부 항생제에 의해 살해되지 않도록. 이 현상을 이용하여, 겐타 마이신 보호 분석법은 세포 (BA)의 생존 및 성장을 측정cterial 병원균. 감염 동안 세 개의 이벤트, 즉 진핵 세포 침윤 및 복제와 관련하여, 감염, 겐타 마이신 처리하고, 또한 배양 (도 1) 사이의 시간 간격에 따라 세포 내 박테리아 병원균에 대해 평가 될 수있다. 진핵 세포주는 호스트 병원체 상호 작용 연구에 대한 중요한 동물 모델보다 덜 복잡하며 생리적 환경을 제공한다. 겐타 마이신 보호 분석은 STM-호스트 상호 작용을 연구하는 적절한 플랫폼이지만, 24 - 웰 배양 접시에있는 표준 분석은 낮은 처리량을 갖는다. 생체 데이터 셋의 전산 분석은 약 300 호스트 유전자 제품 (게시되지 않은 데이터)와 상호 작용 할 것으로 예상되는 149 살모넬라 균의 유전자 산물을 확인했다. 겐타 마이신 표준 보호 분석법 효율적 돌연변이 숫자를 표현형 능력이 없다. 와 T에서이온, 겐타 마이신 보호 분석은 이론적으로도 단일 세균의 침입을 감지 할 수 있습니다. 다른 시간에 반복되면이 때문에 고유 감도, 원시 데이터는 기술적 차이에 민감하다. 내부 통제 및 정상화 후 상대 데이터 프레 젠 테이션 결과의 의미 해석에 필수적이다. 이러한 고려 사항을 감안할 때, 변성 표준화 겐타 마이신 보호 분석은 테스트 능력을 향상하고 정밀도를 높이기 위해 개발되었다. 다음의 상세한 프로토콜은 96 - 웰 배양 접시 및 뮤린 RAW264.7 대 식세포 세포주를 사용하여 개질 겐타 마이신 보호 분석을 수행하기 위해 도시되어있다. 24 웰 배양 접시에서 표준 프로토콜에 비해 수정 된 프로토콜은 다음과 같은 장점이있다 : 1) 96 - 웰 배양 접시를 사용하여 충분한 통계적인 힘을 가진 내부 양성 및 음성 컨트롤을 포함하여 phenotyped 할 10 가지 돌연변이 균주를 허용을;돌연변이 균주가 동일 배양 접시에서 동시에 시험 때문에 2) 결과의 편차가 현저하게 감소된다; 운전자의 피로를 줄이는 동시에 3) 멀티 채널 피펫을 사용하면 처리량을 증가시킨다. 마지막으로, 24 - 웰 배양 접시에 비하여 96 - 웰 배양 접시에 웰당 이하 숙주 세포 우려 프로토콜 최적화 및 표준화를 통해 해결 하였다. 요약하면, 대 식세포에서 체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 복제에 변경됨 표준화 분석은 정밀도 향상과 작업자의 피로를 감소시키면서 높은 처리 능력을 달성한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

살모넬라 종은 인수 공통 병원균과 인간과 가축 한 식품 매개 질환의 주요 원인이다. 살모넬라 -host 상호 작용을 기본 메커니즘을 이해 살모넬라 감염의 분자 기전을 규명하는 것이 중요하다. 겐타 마이신 보호 분석은 높은 처리량 검사가 RAW 264.7 쥐의 대 식세포를 사용하여 호스트 상호 작용에 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움의 삭제 돌연변이의 역할을 정의 할 수 있도록 적응했다 식세포에서 살모넬라 협회, 침략과 복제를 표현형.이 프로토콜에서 분산을 야생형 및 돌연변이 균주 여러 동일 배양 접시에서 동시에 테스트 할 수 있기 때문에 측정에서 크게, 표준 프로토콜에 비해 감소된다. 멀티 채널 피펫을 사용하면 처리량을 증가시키고, 정밀도를 향상시킨다. 또한, 우려가 적은 호 사용에 관한96 - 웰 배양 접시에 웰당 성 세포를 해결 하였다. 여기서, 대 식세포를 사용하여 시험 관내 변형 된 살모넬라 침윤 분석의 프로토콜이 성공적으로 연관, 침윤 및 세포 내 복제 38 개인 살모넬라 결실 돌연변이 표현형을 사용 하였다. 체외 표현형은 일부는 이후 동물 모델에서 생체 내 표현형에있는 것이 확인되었다되게됩니다. 따라서, 수정 된, 표준화 된 분석은 높은 처리량이 세균 숙주의 상호 작용을 연구하기 위해보다 광범위하게 이용 될 수있는 대 식세포에서 살모넬라 협회, 침윤 및 복제 표현형.

데이터가 수정 된 탐식 세포 침공 분석을 기반으로 꾸몄다 후 대표적인 결과 (그림 2)를 참조하십시오. 데이터 복제 팔에 대한 결함이있는 것으로 알려진 다섯 가지 변종, WT, ΔinvA, ΔphoP, 돌연변이, 그리고 침략에 대한 결함이있는 것으로 알려진 돌연변이 B. Δ INVA, 및 ΔphoP을 포함, 실험 유효성을 평가하기 위해 양성 대조군으로 사용됩니다 . 실제로, 변성 ?...

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 높은 처리량과 식세포에서 복제에 높은 처리량 분석이 개발되었다. 방법은 호스트 병원체 상호 작용에서의 침범 위해 살모넬라 유전자 녹아웃 돌연변이 균주를 평가하기 위해 사용 하였다.

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.5K 조회수.  Texas A&M University.  체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 높은 처리량과 식세포에서 복제에 높은 처리량 분석이 개발되었다. 방법은 호스트 병원체 상호 작용에서의 침범 위해 살모넬라 유전자 녹아웃 돌연변이 균주를 평가하기 위해 사용 하였다. 