Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.

1. التسليم هيدرودينامي من sRANKL MC الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل ماوس الهيدروديناميكية عبر الوريد الذيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الماوس قبل حقن الوريد الذيل. تمييع sRANKL أو بروتين الفلورية الخضراء (GFP) MC في حل رينغر (قبل دافئ عند 37 درجة مئوية) في إجمالي حجم ~ 10٪ من وزن جسم الفأر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء الماوس في قفص لمدة 10 دقيقة قبل الحقن وذلك لتمدد الأوعية الدموية والأوردة جعل الجانبي (لفس) مرئية. رصد الماوس بعناية لتجنب الجفاف وارتفاع الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم المتوسعة لفس ومرئية، ونقل الماوس إلى كابح وتضاف المكونات بعيدا بما فيه الكفاية في برميل لكبح جماح الحركة. رصد الماوس للنشاط العادي مثل التنفس. ضبط المكونات من كابح إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير منطقة الحقن 3/4 من غيض من الذيل مع الكحول مسح. استخدام إبرة G 27-30 للماوس حقن الوريد الذيل. عقد ذيل بحزم مع يد واحدة وادخال الإبرة فيإلى الوريد الذيل. الضغط على حقنة واستكمال الحقن داخل 5-7 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإبرة من الوريد الذيل والضغط مع كرة القطن على موقع الحقن لوقف النزيف. رصد الماوس ل15-30 دقيقة، ثم نقل الماوس مرة أخرى إلى الحظيرة مرة واحدة يتم خفض معدل التنفس إلى المعدل العادي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد الجهازية ماوس sRANKL التعبير والكمي لنقل ماوس سيروم TRACP5b آخر الجينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء الماوس في قفص لمدة 5-10 دقيقة من أجل تمدد الأوعية الدموية وجعل لفس مرئية. رصد الماوس بعناية لتجنب الجفاف وارتفاع الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير بشفرة إلى ذيل الماوس، في موقع واحد عليها من طرف الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما يقرب من 100 ميكرولتر من الدم في أنابيب فصل المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أنابيب فصل المصل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق وجمع المصل. ستورمصل الإلكترونية في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء sRANKL ELISA والماوس TRACP5b المصل فحص على عينات المصل باستخدام طقم التجارية المتاحة. </li></ol></li></ol> 2. في المختبر الجيل ناقضة العظم من ماوس BMMs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العزلة والتثقيف من BMMs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العزلة من الساق وعظم الفخذ العظام: الموت ببطء الماوس المانحة مع CO 2، وتطهير الساقين مع الايثانول 70٪. تشريح من عظم العانة حتى العظم العقبي، لإزالة عظم الفخذ والظنبوب عظام سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجلد والعضلات بعناية دون الإضرار العظام. وضع عظم الفخذ والساق معالجة العظام في طبق بتري تحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة نخاع العظم: قطع قبالة الطرف على جانب واحد من عظم الفخذ والساق وعظام طرد نخاع العظام في أنبوب 50 مل باستخدام حقنة 1ML مع 25 G إبرة، محملة α-MEM تحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (ناقضة العظم الثقافة متوسطة / OCM). </li><lط&gt; عملية نخاع العظم: مزيج ونقل نخاع العظام التعليق على الجديد 50 مل أنبوب بتمريرها من خلال 70 ميكرومتر الخلية النايلون مصفاة. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج وإعادة تعليق في α-MEM تحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتوميسين و 10٪ FBS (ناقضة العظم الثقافة المتوسطة / OCM (+)). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الضامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو خلية مكافحة التلقائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 1 × 10 6 خلايا لكل بئر لوحة 6 جيدا أو 3 × 10 5 خلايا إلى coverslips الزجاج (5 ملم) أو شرائح عاج وضعها في لوحة 96 جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح كل وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا غير ملتصقة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع OCM الطازجة (+) التي تحتوي على 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح جميع وسائل الإعلام واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع OCM الطازجة (+) وسائل الإعلام التي تحتوي على 25 نانوغرام / مل الماوس M-CSF، و 30 الماوس نانوغرام / مل sRANKL لبدء osteoclastogenesis. تجديد وسائل الاعلام كل 3 أيام كما هو مطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايالحوالي 6-8 أيام لتشكيل خلايا متعددة النووية العملاقة قادرة على resorbing العظام. حالما تظهر خلايا متعددة النوى، نفذ فخ (طرطرات الفوسفاتيز الحمضي مقاومة) تلطيخ استخدام عدة التجارية المتاحة، وعندما نضجت تماما، نفذ المقايسات الفنية. تصور حلقات F-الأكتين coverslips على استخدام وصمة عار phalloidin وصورة تعلق على الخلايا عاج شرائح بواسطة المجهر الإلكتروني (SEM) كما هو موضح سابقا 19. </li></ol></li></ol> 3. في المختبر الجيل ناقضة العظم من PBMCs الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل PBMCs الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من قبل تحسنت Histopaque-1077 في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فارغة تصفية الكريات البيض التي تم الحصول عليها من بنك الدم مع برنامج تلفزيوني العقيمة في أنبوب 50 مل (نسبة 1:1 من الدم مع PBS). طبقة الدم المخفف على حل histopaque ببطء شديد، والتأكد من أن الدم لا يمتزج مع histopaque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة في 18 درجة مئوية. تابعالطرد المركزي جي، عزل بعناية طبقة معطف الشهباء البيضاء التي تحتوي على خلايا الدم البيضاء ونقل إلى أنبوب جديد 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 650 x ج لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف والخلايا resuspend في OCM (-) وسائل الإعلام وعدد الخلايا باستخدام عداد الخلية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطلاء وزراعة PBMCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في OCM (+) وسائل الإعلام وصفيحة 8 × 10 6 خلية / مل لكل بئر في لوحة 6 جيدا أو 1 × 10 6 خلية / مل لكل بئر في لوحة 96 جيدا. خلايا لوحة على coverslips الزجاج (5 ملم) كما هو مطلوب للتصوير المناعي فضلا عن شرائح العظام مناسبة لفحوصات ارتشاف العظم كما هو موضح سابقا 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التغيير سائل الإعلام والثقافة، وتجديد الخلايا مع الإنسان M-CSF كل 2-3 أيام أو حسب الحاجة. ثم انتقل إلى الخطوة التمايز في يوم 5 عن طريق إضافة 30 نانوغرام / مل من sRANKL الإنسان جنبا إلى جنب مع 25 نانوغرام / مل الإنسان M-CSF في OCM (+) وسائل الإعلام لبدء osteoclastogenesهو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لحوالي 14 إلى 21 يوما لتشكيل خلايا متعددة النووية العملاقة. حالما تظهر خلايا متعددة النوى، ويمكن بعد ذلك أن هذه الخلايا مرقوم للشرك، وعندما نضجت تماما، المقايسات الفنية لا يمكن أن يؤديها. يمكن تصور حلقات F-الأكتين coverslips على استخدام phalloidin صمة عار. يمكن فحص مورفولوجيا الخلايا في الخلايا تعلق على عاج شرائح بواسطة SEM. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+of+musculoskeletal+diseases:+impact+of+work+disability+and+functional+decline.">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li><li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast,+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease.">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+(sODF)+exhibit+severe+osteoporosis.">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification.">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., &amp; development. 12, 1260-1268 (1998).</li><li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery:+its+principles+and+applications.">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li><li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton.">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li><li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trabecular+bone+turnover,+bone+marrow+cell+development,+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats.">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li><li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research.">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li><li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+menopausal+transition:+analysis+of+LH,+FSH,+estradiol,+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women.">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li><li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta.">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li><li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenotropic,+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors:+dissociation+from+transcriptional+activity.">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li><li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats.">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li><li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice.">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li><li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+deficiency+and+bone+loss:+an+inflammatory+tale.">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li><li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+function.">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li><li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation.">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li><li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+(ODF)+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures.">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption.">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors.">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., &amp; therapy. 12, (2010).</li><li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis,+osteoporosis,+cancer,+and+infection.">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li><li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts,+rheumatoid+arthritis,+and+osteoimmunology.">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li><li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment.">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo.">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li><li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors.">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo.">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li><li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b:+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption.">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis,+osteoclast+formation,+and+maintenance+of+bone+mass.">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li><li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts.">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li><li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoclast+biology:+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models.">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li><li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids.">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ظروف العضلات والعظام تقود أسباب الاعتلال والعجز وتتألف من أكثر من 150 من الأمراض والمتلازمات؛ التي تؤثر على ما يقرب من 90 مليون أميركي اليوم. التهاب المفاصل وتدمير العظام هي السمات الغالبة من الحالات العضلية الهيكلية، بما في ذلك التهاب المفاصل وهشاشة العظام. هشاشة الع...

أمراض العضلات والعظام تؤثر على الملايين من الناس في الولايات المتحدة وعواقب وخيمة الحاضر على النظم الصحية الوطنية والمحلية 1. وتتميز هذه الاضطرابات بسبب فقدان العظام وظيفة مشتركة التي تتطلب معالجة مكثفة وفترات طويلة من الانتعاش. عادة، زيادة نسبية في عدد و / أو نشاط الخلايا الآكلة، وخلايا متخصصة ليرتشف العظام، في ترقق العظام والتهاب المفاصل لوحظ 2. في ظل الظروف الفسيولوجية وينظم عدد ونشاط الخلايا الآكلة بواسطة مستقبلات عامل منشط النووية κ-B يجند (RANKL)، الذي تنتجه الخلايا بانية العظم. Osteoprotegerin (OPG)، وينتج مستقبلات شرك لRANKL أيضا بانيات 3 في الجسم الحي النماذج الحيوانية التي تنطوي من overexpression النظامية من sRANKL، أو حذف OPG هي قيمة للغاية في مجال البحوث هشاشة العظام.؛ ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب جيل من الفئران المعدلة وراثيا 4،5. هنا، بديل الروايةيوصف أسلوب overexpressing sRANKL لدراسة الاضطرابات المرتبطة العضلات والعظام. على وجه التحديد، واستخدمت minicircle (MC) تكنولوجيا الحمض النووي وطرق التسليم الهيدروديناميكية لتحقيق نقل الجينات من sRANKL في الجسم الحي وoverexpress الماوس sRANKL جهازيا 6. هذا الأسلوب هو أيضا مكملة للأخرى في الجسم الحي نماذج من ترقق العظام، مثل التشكيل الهرمونية من الآكلة التالية استئصال المبيض 7 والتدخل الغذائي من خلال اتباع نظام غذائي منخفض الكالسيوم 8. هذه النماذج هي مفيدة جدا لدراسة جوانب مختلفة من الاضطرابات العضلية الهيكلية ذات الصلة إلا أنها تتطلب عمليات جراحية ويمكن أن يستغرق فترة تصل الى عدة أشهر، بتكلفة كبيرة 9. مستأصلة المبيض (وفك) نموذج القوارض هو نموذج على حيوانات التجارب حيث إزالة المبايض يؤدي إلى نقص هرمون الاستروجين بعد سن اليأس وهشاشة العظام وبالتالي محاكاة الإنسان 10. الإنسان بهشاشة العظام بعد انقطاع الطمث، شرط فيها هرمون الاستروجين deficiency يؤدي إلى زيادة خطر كسور العظام وهشاشة العظام يؤثر على ما يقرب من ثمانية ملايين امرأة في الولايات المتحدة وحدها. على الرغم من أن نموذج وفك مفيد لهشاشة العظام بعد انقطاع الطمث أنه يوفر مزايا محدودة في دراسة هشاشة العظام بشكل عام. الاستروجين يمنع فقدان العظام، عن طريق حفز ناقضة العظم وتثبيط بناء العظم موت الخلايا المبرمج، وبالتالي في غيابها لوحظ زيادة النشاط ناقضة العظم 10-12. ويلاحظ وجود RANKL-OPG نسبة الخلل الذي يفضل ارتشاف العظام أيضا 13. ومع ذلك، ويرافق نقص هرمون الاستروجين في الجسم الحي أيضا من انخفاض مستويات عامل النمو تحويل β (TGF β)، وزيادة انترلوكين 7 (IL-7) وTNF، IL-1 و IL-6 14،15. لأن هذه السيتوكينات قد عرفت وظائف تغييري إعادة تشكيل العظام مستقلة عن المسار RANKL، فإنه من المستحيل أن ينسب أي تفعيل ناقضة العظم فقط إلى المحور RANKL رتبة. نموذج صفها في هذه الورقة تمكن الباحثون للدراسة في فيفس محور RANKL رتبة في osteoclastogenesis وفقدان العظام دون السيتوكينات الموالية للالتهابات مقارنة نماذج القوارض وفك. بالإضافة إلى ذلك، في المختبر تقنيات osteoclastogenesis هي أدوات أساسية لدراسة تفعيل ناقضة العظم لعلاج العلاجية المحتملة للأمراض العضلات والعظام. وقد أظهرت الدراسات السابقة أيضا أن زراعة نخاع العظم الضامة الماوس المستمدة (BMMs) مع الماوس بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) والماوس sRANKL يمكن أن تؤدي إلى التمايز ناقضة العظم 3،16،17. هنا، يتم وصف البروتوكولات لتوليد الخلايا ناقضة العظم مثل الماوس متعددة النوى من نخاع العظم وكذلك من الخلايا المحيطية وحيدات النوى الإنسان الدم (PBMCs) في المختبر 18. كما وصفها بإيجاز المقايسات خلية مقرها المطلوبة لتحديد ناقضة العظم متباينة عضال وتعمل بكامل طاقتها ناضجة. هذه في المختبر تقنيات تكمل الرواية في الجسم الحي والنهج معا بمثابة عأدوات التحقيق owerful لدراسة التمايز ناقضة العظم والتنشيط. باستخدام هذه الأنظمة، والعلماء قادرون على توليد الخلايا الآكلة في الجسم الحي في المختبر وتحديد المحفزات والإشارات اللازمة لانتشارها وتفعيل وكذلك اختبار فعالية مثبطات الدوائية والبيولوجية.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Human M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Mouse M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Human RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Mouse RANK-Ligand - soluble</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Restrainer for mice</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP assay&amp;nbsp;</td><td>immunodiagnostic systems</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vivo gene transfer technique and in vitro cell based assays for the study of bone loss in musculoskeletal disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

هنا، توصف تقنية نقل الجينات الرواية لتمايز الخلايا الآكلة في الجسم الحي والبروتوكولات الثقافة خلية للتمييز بين الخلايا الآكلة في السلائف في المختبر كوسيلة لدراسة آثار السيتوكينات على osteoclastogenesis. في الشكل 1، وأظهرت نتائج ممثل نقل الجينات الناجح لGF...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders at JoVE.com

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

رواية<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تقنيات نقل الجينات و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات وبناء خلية لدراسة فقدان العظام في اضطرابات العضلات والعظام

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

11.6K Views.  University of California, Davis. Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described. 

Video: A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

علاج المخدرات و<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من خلية بناء العظم، تآكل العظام Osteoclast التفاعلات في نموذج الميداكا السمك هشاشة العظام

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Developmental Biology

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

نماذج من الانبثاث العظام

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

تسلسلي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من الخلايا الجذعية المكونة للعظم / السلف خلال اصلاح الكسر

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

جنبا إلى جنب<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; بصري وμCT التصوير لرصد العدوى، التهاب، وتشريح العظام في العدوى زراعة العظام في الفئران

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

تطبيقات<em&gt; في فيفو</em&gt; التجارب الفنية من الفئران قصبة الساق الأمامية لتقييم الأنسجة المهندسة وإصلاح العضلات والهيكل العظمي

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Bioengineering

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

عظم الفخذ نافذة الغرفة نموذج ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تتبع الخلايا في الفئران نخاع العظام

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Immunology and Infection

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ages. Animal OVCF models are essential to the preclinical development of translational tissue engineering strategies. While a number of models currently exist, this protocol describes an optimized method for inducing multiple highly reproducible vertebral defects in a single nude rat. A novel longitudinal semiautomated microcomputed tomography (&#181;CT)-based quantitative structural analysis of the vertebral defects is also detailed. Briefly, rats were imaged at multiple time points post-op. The day 1 scan was reoriented to a standard position, and a standard volume of interest was defined. Subsequent &#181;CT scans of each rat were automatically registered to the day 1 scan so the same volume of interest was then analyzed to assess for new bone formation. This versatile approach can be adapted to a variety of other models where longitudinal imaging-based analysis could benefit from precise 3D semiautomated alignment. Taken together, this protocol describes a readily quantifiable and easily reproducible system for osteoporosis and bone research. The suggested protocol takes 4 months to induce osteoporosis in nude ovariectomized rats and between 2.7 and 4 h to generate, image, and analyze two vertebral defects, depending on tissue size and equipment.

The goal of this protocol is to generate a nude rat osteoporosis-related vertebral compression fracture model that can be longitudinally evaluated in vivo using a semiautomated microcomputed tomography-based quantitative structural analysis.

سيميوتوماتيد طولية المستندة إلى التصوير المقطعي ميكروكومبوتيد التحليل الكمي لهيكلية نموذج كسر العمود الفقري المتصلة بمرض هشاشة العظام في الفئران عارية

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

<meta charset="utf8"></head><body>التحليل متعدد الوسائط لتكوين العظام باستخدام نماذج الزرع

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous modalities that are currently available for analysis. Here, we propose a workflow for a comprehensive evaluation of new bone formation using a relevant large animal osseous ex vivo explant. A bone defect (diameter = 3.75 mm; depth = 5.0 mm) is created in an explanted sheep femoral head and injected with a macroporous bone substitute loaded with a pro-osteogenic growth factor (bone morphogenetic protein 2 - BMP2). Subsequently, the explant is maintained in culture for a 28-day period, allowing cellular colonization and subsequent bone formation. To evaluate the quality and structure of newly mineralized tissue, the following successive methods are set up: (i) Characterization and high-resolution 3D images of the entire explant using micro-CT, followed by deep learning image analyses to enhance the discrimination of mineralized tissues; (ii) Nano-indentation to determine the mechanical properties of the newly formed tissue; (iii) Histological examinations, such as Hematoxylin/Eosin/Saffron (HES), Goldner's trichrome, and Movat's pentachrome to provide a qualitative assessment of mineralized tissue, particularly with regard to the visualization of the osteoid barrier and the presence of bone cells; (iv) Back-scattering scanning electron microscopy (SEM) mapping with internal reference to quantify the degree of mineralization and provide detailed insights into surface morphology, mineral composition, and bone-biomaterial interface; (v) Raman spectroscopy to characterize the molecular composition of the mineralized matrix and to provide insights into the persistence of BMP2 within the cement through the detection of peptide bonds. This multimodal analysis will provide an effective assessment of newly formed bone and comprehensive qualitative and quantitative insights into mineralized tissues. Through the standardization of these protocols, we aim to facilitate interstudy comparisons and improve the validity and reliability of research findings.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: التقنيات المتقدمة لتوصيف تمعدن الأنسجة في أبحاث تجديد العظام

The proposed protocol entails a global approach to assess bone formation in the context of bone regeneration using multimodal analyses. It aims to provide qualitative and quantitative information on new bone formation, enhancing the rigor and validity of basic and pre-clinical investigations.

رواية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

علاج المخدرات و

نماذج من الانبثاث العظام

تسلسلي

جنبا إلى جنب

تطبيقات

عظم الفخذ نافذة الغرفة نموذج ل

سيميوتوماتيد طولية المستندة إلى التصوير المقطعي ميكروكومبوتيد التحليل الكمي لهيكلية نموذج كسر العمود الفقري المتصلة بمرض هشاشة العظام في الفئران عارية

التوصيف الشامل لتمعدن الأنسجة في نموذج Ex Vivo

التوصيف الشامل لتمعدن الأنسجة في نموذج Ex Vivo

التوصيف الشامل لتمعدن الأنسجة في نموذج Ex Vivo