Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.

1. משלוח הידרודינמית של sRANKL MC-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משלוח הידרודינמית דרך וריד זנב עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את העכבר לפני ההזרקה לוריד זנב. לדלל sRANKL או חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) MC בפתרון של רינגר (טרום חם על 37 מעלות צלזיוס) בהיקף כולל של ~ 10% ממשקל גופו של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את העכבר בכלוב עבור 10 דקות לפני ההזרקה כדי מרחיב את כלי דם ולהפוך את הוורידים לרוחב (LVS) נראים לעין. לנטר את העכבר בזהירות כדי למנוע התייבשות והיפרתרמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהם LVS מורחבים ונראה לעין, להעביר את העכבר לעוצר ולהכניס את התקע רחוק מספיק לתוך החבית לרסן את התנועה. לפקח על העכבר לפעילות רגילה כגון נשימה. התאם את התקע של עוצר במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור ההזרקה 3/4 מקצה הזנב עם אלכוהול לנגב. שימוש במחט G 27-30 להזרקה לוריד זנב עכבר. החזק את הזנב בחוזקה ביד אחת ולהכניס את המחט בלוריד הזנב. להפעיל לחץ על המזרק ולהשלים את הזריקה בתוך 5-7 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט מוריד הזנב ולהפעיל לחץ עם כדור צמר גפן באתר ההזרקה כדי לעצור את הדימום. לפקח על העכבר ל15-30 דקות, ולאחר מכן להעביר את העכבר בחזרה לביבר פעם אחת את קצב הנשימה מצטמצם לשיעור הרגיל שלו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור על ביטוי sRANKL המערכתי מאוס והכימות של העברת עכבר סרום TRACP5b ההודעה ג&#39;ין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את העכבר בכלוב ל5-10 דק כדי מרחיב את כלי דם ולגרום LVS גלוי. לנטר את העכבר בזהירות כדי למנוע התייבשות והיפרתרמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן עם להב לזנבו של העכבר באתר אחד אחורה מקצה הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כ 100 μl דם בצינורות הפרדה בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות הפרדת סרום בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 10,000 XG במשך 5 דקות ולאסוף בסרום. Storסרום דואר ב-80 ° C לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע sRANKL ELISA וassay TRACP5b סרום עכבר על דגימות סרום באמצעות ערכה זמינה מסחרית. </li></ol></li></ol> 2. דור Osteoclast במבחנה מBMMs מאוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד וCulturing של BMMs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של השוקה ועצמות ירך: להרדים את עכבר התורם עם CO 2, ולחטא את הרגליים עם 70% אתנול. לנתח מעצם הערווה עד עצם calcaneus, כדי להסיר את עצמות ירך ושוקה בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור ושרירים בזהירות מבלי לפגוע בעצמות. הנח עצם ירך ועצם שוקה מעובד בצלחת פטרי המכילה בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההסרה של מח עצם: חותכים את הקצה בצד אחד של עצמות הירך ושוקה ולשטוף את מח העצם לתוך צינור 50 מיליליטר באמצעות מזרק 1ml עם מחט 25 G, עמוס α-ממ המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין (Osteoclast התרבות בינונית / OCM). </li><li&gt; מח עצם תהליך: לערבב ולהעביר השעיה מח עצם לצינור מיליליטר 50 חדש על ידי העברתו דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה התאים ב XG 300 מחדש להשעות בα-ממ המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו10% FBS (הבינוני Osteoclast תרבות / OCM (+)). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות של המקרופאגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 1 x 10 6 תאים לכל גם לצלחת 6 היטב או 3 x 10 5 תאים לcoverslips זכוכית (5 מ&quot;מ) או פרוסות הדנטין להציב צלחת 96 היטב ולדגור על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את כל אמצעי התקשורת המכילה תאים שאינם חסיד ודגירת תאים ב 37 ° C עם OCM הטרי (+) המכילה עכבר 25 ng / ml M-CSF ל48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב את כל התקשורת ודגירת תאים ב 37 ° C עם OCM הטרי (+) המכילה M-CSF עכבר 25 ng / ml, ו30 sRANKL עכבר ng / ml ליזום osteoclastogenesis. לחדש את התקשורת בכל 3 ימים, כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאיםכ 6-8 ימים על מנת לייצר תאים רב גרעיניים ענק מסוגלים resorbing עצם. ברגע שהתאים multinucleated מופיעים, לבצע מלכודת (phosphatase חומצה עמיד tartrate) מכתים באמצעות ערכה זמינה מסחרית, וכאשר התבגרו באופן מלא, לבצע מבחני תפקודיים. דמיינו טבעות ה-F-אקטין על coverslips באמצעות כתם phalloidin ותמונה מצורפים לתאים הדנטין פרוסות ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) כפי שתואר לעיל 19. </li></ol></li></ol> 3. דור Osteoclast במבחנה מPBMCs האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של PBMCs האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של Histopaque-1077 מראש חימם לתוך צינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן ויקוציטים ריק המתקבל מבנק דם עם PBS סטרילי לתוך צינור 50 מיליליטר (1:1 יחס של דם עם PBS). שכבת הדם המדולל על פתרון Histopaque לאט מאוד, ולוודא כי הדם לא לערבב עם Histopaque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות XG 1000 עבור 20 דקות ב18 ° C. לעקובing צנטריפוגה, לבודד בזהירות את שכבת מעיל באפי הלבנה המכילה את תאי דם הלבנים ולהעביר לצינור מיליליטר 50 חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תאים עם PBS ו צנטריפוגות שוב ב650 XG במשך 5 דקות כדי לאסוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ותאי resuspend ב OCM (-) תקשורת ולספור תאים באמצעות דלפק תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי וCulturing PBMCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת resuspend תאי OCM (+) וצלחת 8 x 10 6 תאים / מיליליטר לכל טוב בצלחת או 1 6 גם x 10 6 תאים / מיליליטר לכל טוב בצלחת 96 היטב. פלייט תאים על coverslips זכוכית (5 מ&quot;מ), כנדרש להדמית immunofluorescence כמו גם על פרוסות עצם מתאימות עבור מבחני ספיגת עצם כפי שתוארו לעיל 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה שינוי תרבות, חידוש התאים עם M-CSF האנושי כל 2-3 ימים או כפי שנדרש. לאחר מכן להמשיך לשלב בידול ביום 5 על ידי הוספת 30 / מיליליטר ng של sRANKL האנושי יחד עם 25 M-CSF ng / ml אדם בOCM (+) תקשורת ליזום osteoclastogenesהוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים לכ 14-21 ימים על מנת לייצר תאים רב גרעיניים ענק. ברגע שהתאים multinucleated מופיעים, אז יכולים להיות שכותרתו תאים אלה למלכודת, וכשהתבגרו באופן מלא, ניתן לבצע מבחני תפקודיים. ניתן דמיינו טבעות ה-F-אקטין על coverslips באמצעות כתם phalloidin. המורפולוגיה של התאים ניתן לבדוק בתאים מצורפים הדנטין פרוסות ידי SEM. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+of+musculoskeletal+diseases:+impact+of+work+disability+and+functional+decline.">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li><li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteoclast,+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease.">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li><li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li><li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+(sODF)+exhibit+severe+osteoporosis.">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li><li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification.">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., &amp; development. 12, 1260-1268 (1998).</li><li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery:+its+principles+and+applications.">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li><li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton.">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li><li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trabecular+bone+turnover,+bone+marrow+cell+development,+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats.">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li><li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research.">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li><li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+menopausal+transition:+analysis+of+LH,+FSH,+estradiol,+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women.">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li><li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta.">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li><li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenotropic,+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors:+dissociation+from+transcriptional+activity.">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li><li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats.">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li><li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice.">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li><li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+deficiency+and+bone+loss:+an+inflammatory+tale.">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li><li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+osteoclast+function.">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li><li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation.">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li><li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+factor+(ODF)+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures.">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption.">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors.">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., &amp; therapy. 12, (2010).</li><li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis,+osteoporosis,+cancer,+and+infection.">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li><li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclasts,+rheumatoid+arthritis,+and+osteoimmunology.">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li><li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment.">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo.">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li><li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors.">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li><li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo.">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li><li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b:+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption.">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li><li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis,+osteoclast+formation,+and+maintenance+of+bone+mass.">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li><li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+osteoclast+differentiation.">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation.">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li><li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+culture+and+resorption+assays.">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li><li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+(RANK)+receptors.">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li><li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts.">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li><li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+osteoclast+biology:+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models.">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li><li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids.">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

תנאי השלד והשרירים מובילים גורמים לתחלואה ונכות ומורכבים של מעל 150 מחלות ותסמונות; המשפיע על כ -90 מיליון אמריקאים היום. דלקת מפרקים והרס עצם הם תכונות העיקריות של תנאים שרירי שלד, הכוללים דלקת מפרקים ואוסטאופורוזיס. אוסטאופורוזיס היא מחלה שמחלישה את שלמות עצם, לעתים קרובות מוביל לשברים בעצמות. דלקת פרקים הוא מחלה כרונית, מתישה מחלה המאופיינת בדלקת המפרקים שהפכו נפוח, רך ותנועה נורמלית הגבלה-נוקשה ויכולים לגרום לנכות. למרות פתוגנזה של מחלות שרירים ושלד שונה מאוד אחד מהשני, הרס עצם הוא התכונה משותפת העל. הרס עצם בתנאי השלד והשרירים נגרמת בעיקר על ידי חוסר איזון בין ספיגת עצם ויצירת עצם 21,22. גישה טיפולית אחת היא לנסות ולחסום את היכולת של תאים אלה להרוס את העצם <sעד&gt; 23. הטכניקות ונהלים המפורטים כאן יאפשרו המחקר של osteoclasts גם in vivo ו במבחנה. מודל vivo במתואר כאן משתמש minicircles, שהם וקטורים קטנים episomal ה-DNA (~ 4KB) משוחררים מעמוד השדרה בקטריאלי, המשרתים גם כנשאי transgene 24. Minicircles להביע transgenes 10-1,000 קיפול גבוה אז פלסמידים חיידקים נורמלים עם ביטוי יציב לתקופה של עד מספר חודשים. הגודל המולקולרי הקטן יותר של minicircles תורם לשיעור יעיל יותר transfection וביטוי משמעותי בהשוואה לפלסמידים חיידקים נורמלים 24. לכן, minicircles כעת מיושם באופן נרחב במחקרי העברת גנים טרום קליני 25,26. משלוח הידרודינמית הוא שיטה מפותחת המבוססת על לחץ הידרודינמית בנימים כדי לספק DNA פלסמיד לכל הגוף של עכבר. מסירת גן הידרודינמית לhepatocytes באמצעות הזרקה לוריד זנב בעכברים היא לא מבוסס היטבo להביע transgene ידי פלסמיד דנ&quot;א 6. במחקרים אלה, ביתר עכבר sRANKL בin vivo במודל העכבר מושגת על ידי sRANKL MC ומשלוח הידרודינמית באמצעות זריקות וריד זנב. עכבר sRANKL ELISA יכול לשמש כדי לזהות רמות בסרום של RANKL בעכברים. העלאה משמעותית של TRACP5b עכבר סרום, סמן ספיגת עצם 27, הוא ציין בעכברי העברת גני sRANKL. יש לציין, טכניקה זו אינה מוגבלת לביטוי יתר של sRANKL; זה יכול להיות מיושם גם בהמשך לביטוי יתר חלבונים מופרשים אחרים 28. הקושי הטכני העיקרי בהליך זה הוא המשלוח הידרודינמית דרך וריד הזנב. מלבד הזרקה לוריד זנב רגיל, משלוח הידרודינמית דורש מסירה של minicircles בכמויות גדולות של תמיסה פיזיולוגית לעכברים בתוך 5-7 שניות. לפיכך, טכניקות טיפול והזרקה יציבה הן תנאי הכרחיות להצלחה בהליך זה. יצירת עכברים הטרנסגניים sRANKL היא גישה אחרת לosteoc in vivolastogenesis. עם זאת, רמה גבוהה של sRANKL יכולה להוביל להקטלניות עוברי 4 ויצירת עכברים הטרנסגניים היא גם יקרה וגם גוזל זמן. במודל מכרסם OVX, שני ציטוקינים דלקתיים כגון TNF, IL-1 ו-IL-6 וsRANKL ציטוקינים דלקתי שאינו תורמים לin vivo osteoclastogenesis ואיבוד מסת עצם. מודל העברת גני sRANKL מוביל לביטוי יתר של רק sRANKL ציטוקינים שאינם דלקתי. לכן, מודל העברת גני sRANKL שתואר כאן מציע חוקרים כלי רב עוצמה כדי לבחון את תרומתו של ציר RANKL-RANK בשיפוץ עצם בהעדר הדלקת. שיטת תרבות osteoclast במבחנה, הכוללת תאי מח עצם שיתוף culturing וosteoblasts, הוקמה בסוף 1980s לפני הגילוי של RANKL בסוף 1990 של 29,30. רקומביננטי M-CSF וRANKL להשפיע על התמיינות osteoclast ביעילות במבחנהnd השיטה שתוארה בעבר במחקרים אחרים 3,31. M-CSF ידוע כדי לעורר ביטוי RANK במבשרי osteoclast המוקדמים 32 ולפעול כגורם הישרדות של מבשרי osteoclast וosteoclasts הבוגר 33. RANKL חיוני לבידול osteoclast והפעלת 3. הנה, את השיטה של osteoclastogenesis במבחנה מתוארת. culturing המוצלח והתמיינות של תאים מבשר לosteoclasts דורשים בידוד סטרילי תא וטכניקות ציפוי נכון, כמו גם הבנה מדוקדקת של קציר תא מתוזמן. ציפוי מחושב של התאים הוא חיוני משום שבידול osteoclast דורש היתוך של תאים מבשר osteoclast 34 ומספר מספק של תאים מבשר osteoclast לא יאפשר היתוך והתמיינות של תאים מבשר לosteoclasts. באופן דומה, מספר עודף של תאים מבשר osteoclast, מוביל להיווצרות גוש ומוות של תאי סופו של דבר. להסרת של איחסיד תאים 2 שעות לאחר ציפוי התאים יכולות לעזור לשמור על מספר סלולרי אופטימלי. לבסוף, זמן קציר תא הוא חיוני כosteoclasts הם סופני תאים קצרים ימים הבדיל עם תוחלת חיים של כ 48 שעות 35. לכן, צריכים להיות שנקטפו תאים בתוך 48 שעות לאחר התצפית הראשונה של תאי multinucleated. אז יכולים להיות מאופיינים בתאים אלה על ידי מלכודת וצביעת F-אקטין על ידי אימונוהיסטוכימיה ועצם פעילות ספיגה יכולה להיות מזוהה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM). גישות ניסיוניות אלה מאפשרות הגדרה ברורה של osteoclasts במונחים של הפנוטיפ והתפקוד שלהם. In vivo ו במבחנת הטכניקות המתוארות כאן יקל על הפיתוח של מעכבי osteoclast כיום במחקרים טרום קליניים, שהוביל לאסטרטגיות טיפוליות יעילות עבור מיליוני אוסטיאופורוזיס וחולי דלקת מפרקים ברחבי העולם.

מחלות השלד והשרירים משפיעות על מיליוני אנשים בארצות הברית וההשלכות חמורות בהווה למערכות בריאות מקומיות וארציות 1. הפרעות אלו מתאפיינות באובדן העצם ותפקוד מפרקים הדורשים טיפול מקיף ותקופות של התאוששות ארוכות. בדרך כלל, גידול יחסי במספר ו / או הפעילות של osteoclasts, תאים מתמחים לנספגים שוב עצם, באוסטיאופורוזיס ובדלקת מפרקים שהוא ציין 2. בתנאים פיסיולוגיים במספר ובפעילות של osteoclasts מוסדר על ידי מפעיל הקולטן של הגורם הגרעיני κ-B ליגנד (RANKL), אשר מופק על ידי אוסטאובלסטים. Osteoprotegerin (OPG), קולטן דמה לRANKL מיוצר גם על ידי osteoblasts 3 בvivo מודלים של בעלי חיים הכרוכים בביטוי יתר מערכתי של sRANKL, או מחיקה של OPG יקרים מאוד במחקר באוסטאופורוזיס.; עם זאת, שיטות אלו דורשות הדור של עכברים הטרנסגניים 4,5. כאן, אלטרנטיבה רומןשיטה של ​​overexpressing sRANKL לחקר הפרעות הקשורות לשרירים ושלד מתואר. באופן ספציפי, minicircle (MC) טכנולוגיית ה-DNA ושיטות משלוח הידרודינמית שימשו כדי להשיג העברת גנים של sRANKL in vivo ו overexpress עכבר sRANKL מערכתי 6. שיטה זו היא גם משלימה in vivo מודלים אחרים לאוסטאופורוזיס, כגון אפנון הורמונלי של osteoclasts הבא ovariectomy 7 והתערבות תזונתית על ידי דיאטה דל בסידן 8. מודלים אלה הם מאוד שימושיים כדי ללמוד היבטים שונים של הפרעות הקשורות לשלד ושרירים עם זאת הם דורשים ניתוחים ועשויים להימשך עד מספר חודשים, במחיר משמעותי 9. מודל מכרסם ovariectomized (OVX) הוא מודל חיה ניסיוני שבו הסרת השחלות גורמת למחסור באסטרוגן ובכך מחקה אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר אדם 10. אוסטיאופורוזיס בגיל הבלות אדם, מצב שבו defici אסטרוגןency מוביל לסיכון מוגבר לשברים בעצמות ובריחת סידן משפיעה על כשמונה מיליון נשים בארצות הברית לבדה. למרות שמודל OVX שימושי לאוסטיאופורוזיס בגיל הבלות הוא מציע יתרונות מוגבלים בלימוד אוסטאופורוזיס באופן כללי. אסטרוגן מדכא את איבוד מסת עצם, על ידי גרימת osteoclast ועיכוב אפופטוזיס osteoblast, ולכן בהעדרה פעילות osteoclast המוגבר הוא ציין 10-12. חוסר איזון יחס RANKL-OPG שמעדיף ספיגת עצם הוא ציין גם 13. עם זאת, מחסור באסטרוגן in vivo מלווה גם בירידה ברמות של הפיכת β גורם גדילה (β TGF), גדל אינטרלויקין 7 (IL-7) וTNF, IL-1 ו-IL-6 14,15. כציטוקינים אלה ידועים פונקציות ויסות שיפוץ עצם בלתי תלויות במסלול RANKL, אי אפשר לייחס כל הפעלת osteoclast אך ורק על ציר RANKL-RANK. המודל המתואר במאמר זה מאפשר לחוקרים ללמוד ביוo ציר RANKL-RANK בosteoclastogenesis ואובדן עצם ללא הפרו ציטוקינים דלקתיים בהשוואה למודלים של מכרסמים OVX. בנוסף, טכניקות osteoclastogenesis במבחנה הן כלים חיוניים ללמוד הפעלת osteoclast לטיפולי פוטנציאל טיפוליים של מחלות השלד והשרירים. גם מחקרים קודמים הראו כי culturing מקרופאגים מח עצם עכבר נגזרים (BMMs) עם גורם מקרופאג העכבר מגרה מושבה (M-CSF) והעכבר sRANKL יכול להוביל לבידול osteoclast 3,16,17. הנה, את הפרוטוקולים כדי לייצר תאים כמו osteoclast-multinucleated ממח העצם של עכבר, כמו גם מהתאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) במבחנה 18 מתוארים. מבחני מבוססי התאים נדרשים להגדיר osteoclast הבדיל סופני ומתפקד באופן מלא בשלה גם מתוארים בקצרה. במבחנה טכניקות אלה משלימים את הרומן בגישת vivo ויחד לשמש pכלי החקירה owerful ללמוד בידול osteoclast והפעלה. שימוש במערכות אלה, מדענים מסוגלים לייצר osteoclasts in vivo ו במבחנה ולהגדיר את הגירויים ואותות הנדרשים להפצה וההפעלה שלהם, כמו גם לבחון את היעילות של מעכבים תרופתיים וביולוגיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">alpha-MEM</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12561-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Human M-CSF</td>
			<td style="width:71px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-096-492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Mouse M-CSF</td>
			<td style="width:71px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Human RANK-Ligand - soluble</td>
			<td style="width:71px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Mouse RANK-Ligand - soluble</td>
			<td style="width:71px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tailveiner Restrainer for mice</td>
			<td style="width:71px;">Braintree</td>
			<td style="width:119px;">TV-150 STD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit&#160;</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">MTR00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:320px;">MouseTRAP assay&#160;</td>
			<td style="width:71px;">immunodiagnostic systems</td>
			<td style="width:119px;">SB-TR103</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vivo gene transfer technique and in vitro cell based assays for the study of bone loss in musculoskeletal disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

כאן, בטכניקת העברת גנים חדשים לבידול של osteoclasts in vivo ופרוטוקולי תרבית תאים להפרדת תאים מבשר לosteoclasts במבחנה, כמו שיטה כדי לחקור את ההשפעות של ציטוקינים על osteoclastogenesis מתוארות. באיור 1, תוצאות הנציג של העברת גנים המוצלחת של ה-GFP ועכבר sRANKL MC בעכברים מוצגות. באיור 2, התמונות מייצגות של מח עצם עכבר או תרבויות אנושיות PBMC התמיינות תאים כמובן זמן של תאים מבשר לosteoclasts על ידי מיקרוסקופ שדה הבהיר מוצגות. איור 3, תמונות מייצגות משלוש שיטות עצמאיות לאפיון osteoclasts מקורם במח עצם עכבר מוצגות . נוכחותו של עכבר sRANKL מפעילה את הביטוי של מלכודת (3A דמויות ו-B) והיווצרות של טבעות ה-F-אקטין (3C דמויות ו-D). elec סריקהמיקרוסקופיה טרון (SEM) מגלה כי העכבר sRANKL גורם להיווצרות של תאים ענק מסוגלים resorbing עצם (3E דמויות ו-F). איור 4, באותן שיטות האפיון על PBMC אדם נגזרות osteoclasts מוצג. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. SRANKL in vivo גן ההעברה מובילה לosteoclastogenesis המוגבר. תצוגה קדמית של A, B) explants כבד העכבר וC, D) תמונות של כל גוף של C57BL / 6 עכברי זכרים 12 שבועות ישנים הוזרקו 5 מיקרוגרם של ה-GFP או sRANKL MC-DNA. החץ מצביע על הביטוי של GFP in vivo בעכבר העברת גני ה-GFP. עכברי העברת גני RANKL לשמש אין הקרינה רקע. תמונות שנתפסו על ידי המאסטרו 2 Imager, יום אחד לאחר גן ההעברה (ד האדום והירוקרקע enote וה-GFP, בהתאמה). מפת E) פלסמיד של מבנה sRANKL MC-DNA ורמת F) sRANKL בסרום נותח בבית 1, 5 ו -11 ימי הודעת GFP או רמת TRACP5b סרום העברת גני sRANKL. G) מאוס ניתחה 11 ימים לאחר העברת גן GFP או sRANKL. ברים סולם מצביעים על 5 מ&quot;מ, B ו 10 מ&quot;מ ב-C, ד &#39; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig2highres.jpg" width="500" /> osteoclastogenesis איור 2. במבחנה בשני מערכות תרבית תאים אנושיות בעכבר ו. מיקרוסקופ שדה בהיר של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית בנוכחות 25 ng / ml עכבר M-CSF ו30 sRANKL עכבר ng / ml מראה בידול כמובן זמן בימים), 2 ב &#39;) 5, ו-C) 8. מיקרוסקופ שדה הבהיר של תאים אנושיים מבודדיםמהדם ותרבית בנוכחות של 25 ng / ml M-CSF האדם ו30 sRANKL ng / ml האדם מראה כמובן זמן התמיינות בD ימים), 4 E) 14, ו-F) 21 היקפיים. ברים סולם מצביעים 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. דור ואפיון של osteoclasts עכבר. מכתים TRAP (ורוד) של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית במשך 6 ימים בנוכחות) 25 עכבר ng / ml M-CSF או B) עכבר 25 ng / ml M -CSF ו30 sRANKL עכבר ng / ml. Phalloidin (ירוק) וDAPI מכתים (הכחול) של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית במשך 8 ימים בנוכחות C) ng 25 ng / עכבר M-CSF מיליליטר ו30 25 ng / M-CSF מיליליטר עכבר או D) / מיליליטר עכבר sRANKL מראה את היווצרות פאטבעת ctin בתאי multinucleated. photomicrographs SEM של תאי עכבר בודדו ממח עצם בתרבית במשך 8 ימים בנוכחות ה &#39;) 25 ng / M-CSF עכבר מיליליטר או F) sRANKL 25 ng / עכבר M-CSF מיליליטר ו30 עכבר ng / ml מראה את היווצרות אזורי ספיגה בעצמות כפי שמצוין על ידי החצים. ברים סולם מצביעים 40 מיקרומטר בספירה, ו30 מיקרומטר בE, F. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51810/51810fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. דור ואפיון של osteoclasts האנושי. מכתים TRAP (ורוד) של תאים אנושיים מבודדים מPBMCs ותרבותית ל15 ימים בנוכחות) 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר או B) 25 ng / ml אדם M- CSF ו30 sRANKL אדם ng / ml. Phalloidin (ירוק) וDAPI מכתים (כחולה) של תאים אנושיים מבודדים מPBMC ותרבותי ל19 ימים בנוכחות C) </strong&gt; 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר או D) 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר ו30 ng / sRANKL אדם מיליליטר מראה את היווצרות של טבעות ה-F-אקטין בתאי multinucleated. photomicrographs SEM של תאים אנושיים מבודדים מPBMC ותרבותי ל18 ימים בנוכחות ה &#39;) ng 25 ng / M-CSF אדם מיליליטר ו30 25 ng / M-CSF מיליליטר אדם או F) / sRANKL אדם מיליליטר מראה את היווצרות של ספיגה אזורים על עצם כפי שצוין על ידי החצים. ברים סולם מצביעים 10 מיקרומטר בA, B, 20 מיקרומטר ב-C, 15 D מיקרומטר בE, F.

Watch this Scientific Journal Video about A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders at JoVE.com

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

רומן<em&gt; In vivo</em&gt; טכניקה וין העברה<em&gt; במבחנה</emמבחני תא בהתבסס&gt; לחקר אובדן עצם בפרעות השלד והשרירים

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

11.6K Views.  University of California, Davis. Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described. 

Video: A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher frequency of fractures 1. As these fractures often occur in regions that have lost normal sensory function, the patient is at a greater risk of fracture-dependent pathologies, including death. SCI-dependent loss in both bone mineral density (BMD, grams/cm2) and bone mineral content (BMC, grams) has been attributed to mechanical disuse 2, aberrant neuronal signaling 3 and hormonal changes 4. The use of rodent models of SCI-induced osteoporosis can provide invaluable information regarding the mechanisms underlying the development of osteoporosis following SCI as well as a test environment for the generation of new therapies 5-7 (and reviewed in 8). Mouse models of SCI are of great interest as they permit a reductionist approach to mechanism-based assessment through the use of null and transgenic mice. While such models have provided important data, there is still a need for minimally-invasive, reliable, reproducible, and quantifiable methods in determining the extent of bone loss following SCI, particularly over time and within the same cohort of experimental animals, to improve diagnosis, treatment methods, and/or prevention of SCI-induced osteoporosis.
An ideal method for measuring bone density in rodents would allow multiple, sequential (over time) exposures to low-levels of X-ray radiation. This study describes the use of a new whole-animal scanner, the IVIS Lumina XR (Caliper Instruments) that can be used to provide low-energy (1-3 milligray (mGy)) high-resolution, high-magnification X-ray images of mouse hind limb bones over time following SCI. Significant bone density loss was seen in the tibiae of mice by 10 days post-spinal transection when compared to uninjured, age-matched control (na&iuml;ve) mice (13% decrease, p&lt;0.0005). Loss of bone density in the distal femur was also detectable by day 10 post-SCI, while a loss of density in the proximal femur was not detectable until 40 days post injury (7% decrease, p&lt;0.05). SCI-dependent loss of mouse femur density was confirmed post-mortem through the use of Dual-energy X-ray Absorptiometry (DXA), the current "gold standard" for bone density measurements. We detect a 12% loss of BMC in the femurs of mice at 40 days post-SCI using the IVIS Lumina XR. This compares favorably with a previously reported BMC loss of 13.5% by Picard and colleagues who used DXA analysis on mouse femurs post-mortem 30 days post-SCI 9. Our results suggest that the IVIS Lumina XR provides a novel, high-resolution/high-magnification method for performing long-term, longitudinal measurements of hind limb bone density in the mouse following SCI.

Longitudinal Evaluation of Mouse Hind Limb Bone Loss After Spinal Cord Injury using Novel, in vivo, Methodology

A longitudinal examination of bone loss in the femurs and tibiae of adult mice was performed following spinal cord injury using sequential low-dose X-ray scans. Tibia bone loss was detected throughout the study, while bone loss in the femur was not detected until 40 days post injury.

הערכת אורך של עכבר הינד איבוד מסת העצם לימב לאחר פגיעה בחוט השדרה באמצעות רומן, In vivo מתודולוגיה

Spinal cord injury (SCI) is often accompanied by osteoporosis in the sublesional regions of the pelvis and lower extremities, leading to a higher ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Development of an Audio-based Virtual Gaming Environment to Assist with Navigation Skills in the Blind

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio based cues and set within the context of a video game metaphor, users gather relevant spatial information regarding a building's layout. This allows the user to develop an accurate spatial cognitive map of a large-scale three-dimensional space that can be manipulated for the purposes of a real indoor navigation task. After game play, participants are then assessed on their ability to navigate within the target physical building represented in the game. Preliminary results suggest that early blind users were able to acquire relevant information regarding the spatial layout of a previously unfamiliar building as indexed by their performance on a series of navigation tasks. These tasks included path finding through the virtual and physical building, as well as a series of drop off tasks. We find that the immersive and highly interactive nature of the AbES software appears to greatly engage the blind user to actively explore the virtual environment. Applications of this approach may extend to larger populations of visually impaired individuals.

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind.

פיתוח של סביבת משחקים וירטואלית אודיו מבוססות המסייע במיומנויות ניווט בליינד

Audio-based Environment Simulator (AbES) is virtual environment software designed to improve real world navigation skills in the blind. Using only audio ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Novel Application of Musculoskeletal Ultrasound Imaging

Ultrasound is an attractive modality for imaging muscle and tendon motion during dynamic tasks and can provide a complementary methodological approach for biomechanical studies in a clinical or laboratory setting. Towards this goal, methods for quantification of muscle kinematics from ultrasound imagery are being developed based on image processing. The temporal resolution of these methods is typically not sufficient for highly dynamic tasks, such as drop-landing. We propose a new approach that utilizes a Doppler method for quantifying muscle kinematics. We have developed a novel vector tissue Doppler imaging (vTDI) technique that can be used to measure musculoskeletal contraction velocity, strain and strain rate with sub-millisecond temporal resolution during dynamic activities using ultrasound. The goal of this preliminary study was to investigate the repeatability and potential applicability of the vTDI technique in measuring musculoskeletal velocities during a drop-landing task, in healthy subjects. The vTDI measurements can be performed concurrently with other biomechanical techniques, such as 3D motion capture for joint kinematics and kinetics, electromyography for timing of muscle activation and force plates for ground reaction force. Integration of these complementary techniques could lead to a better understanding of dynamic muscle function and dysfunction underlying the pathogenesis and pathophysiology of musculoskeletal disorders.

We describe a new ultrasound-based vector tissue Doppler imaging technique to measure muscle contraction velocity, strain and strain rate with sub-millisecond temporal resolution during dynamic activities. This approach provides complementary measurements of dynamic muscle function and could lead to a better understanding of mechanisms underlying musculoskeletal disorders.

יישום רומן של השלד והשרירים אולטראסאונד הדמיה

Ultrasound is an attractive modality for imaging muscle and tendon  motion during dynamic tasks and can provide a complementary methodological  approach ...

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the prognosis of idiopathic scoliosis in asymptomatic and affected children. The assay consists of the evaluation of the functional status of Gi and Gs proteins in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by cellular dielectric spectroscopy (CDS), using an automated CDS-based instrument, and the classification of children into three functional groups (FG1, FG2, FG3) with respect to the profile of imbalance between the degree of response to Gi and Gs proteins stimulation. The classification is further confirmed by the differential effect of osteopontin (OPN) on response to Gi stimulation among groups and the severe progression of disease is referenced by FG2. Approximately, a volume of 10 ml of blood is required to extract PBMCs by Ficoll-gradient and cells are then stored in liquid nitrogen. The adequate number of PBMCs to perform the assay is obtained after two days of cell culture. Essentially, cells are first incubated with phytohemmaglutinin (PHA). After 24 hr incubation, medium is replaced by a PHA-free culture medium for an additional 24 hr prior to cell seeding and OPN treatment. Cells are then spectroscopically screened for their responses to somatostatin and isoproterenol, which respectively activate Gi and Gs proteins through their cognate receptors. Both somatostatin and isoproterenol are simultaneously injected with an integrated fluidics system and the cells&#39; responses are monitored for 15 min. The assay can be performed with fresh or frozen PBMCs and the procedure is completed within 4 days.

A structured protocol is presented for a cell-based assay as a functional test to predict the prognosis of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy (CDS). The assay can be performed with fresh or frozen peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and the procedure is completed within 4 days.

פרוטוקול assay המבוסס תא לחיזוי הפרוגנוזה של Idiopathic עקמת באמצעות סלולרית דיאלקטרי ספקטרוסקופיה

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...