تحظى بتقدير كبير من اللطف وكرم الدكتور كينت ماكدونالد من جامعة كاليفورنيا في بيركلي. نشكر لمراجع المجهول اقتراحات مفيدة جدا. ويدعم المختبر بورتش سميث صناديق البدء من جامعة تينيسي.

ملاحظة: الإجراء QFS يتطلب الحذر الشديد والحذر من قبل المستخدم، ونحن تسليط الضوء على هذه احتياطات السلامة هنا كما تنبيهات وملاحظات عند الاقتضاء. 1.Preparation لتشغيل HPF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في إعداد العينات، تشغيل الثلاجة الضغط العالي باتباع تعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: وحدة HPF المستخدمة في هذا البروتوكول هو وحدة مدمجة Wohlwend 02 (الشكل 1A)، ويستغرق حوالي ساعة واحدة إلى واحد ونصف الداخلي البدء قبل ان يفوت HPF يمكن أن تبدأ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل على Wohlwend الاتفاق 02 ارتفاع ضغط الفريزر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الأداة من خلال تحويل التبديل الرئيسي من &quot;0&quot; إلى &quot;1&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن الهواء المضغوط إلى الجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج النيتروجين السائل إلى الجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &quot;SYSTEM تجف&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة، اضغط على &quot;التنفسيM تجف &quot;الزر مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &quot;ON / OFF&quot; للتبديل على الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &quot;النيتروجين&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح الجهاز ليبرد لمدة 20 دقيقة حتى لو كان &quot;محرك الأقراص في&quot; زر ومضاءة بالفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و&quot;محرك الأقراص في&quot; أضواء زر حتى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على &quot;محرك الأقراص في&quot; زر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &quot;AUTO&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;نظام READY&quot; أضواء زر حتى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مسبار درجة الحرارة والضغط داخل غرفة الضغط واقفلها مع دبوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &quot;AUTO JET&quot;. هذه الخطوة الشيكات أن زيادة الضغط وانخفاض درجات الحرارة على النحو المطلوب. أساسا التشغيل التجريبي. ومن المتوقع (الشكل 1B) انخفاض حاد في درجات الحرارة وارتفاع حاد في الضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ اثنين من أكثر دورات JET. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. التحضير لReceiviعينات نانوغرام المجمدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء صندوق معزول يحتوي على أصحاب cryovial مع النيتروجين السائل (انظر تحذيرات السلامة)، بحيث تتم تغطية حاملي تماما (الشكل 1C). ملاحظة: استخدام معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العدد المناسب من قارورة تحتوي على المتوسطة FS إلى أصحاب أنبوب الألمنيوم في النيتروجين السائل (الشكل 1C). مع هذا البروتوكول ما يصل إلى أربعة أقراص تحتوي كل منها على عينة واحدة يمكن وضعها في cryovial واحد. ملاحظة: يجب أن يكون المسمى وقارورة بآلة حادة مثل الكاتب يميل الماس وقلم رصاص لينة جدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتثبيتي خلال QFS استخدام 1٪ أوسو 4 و 0.1٪ خلات اليورانيل في الأسيتون 9. إعداد الحل في حجم كبير، الاستغناء aliquots من 1.5 مل في cryovials وتخزينها مجمدة في النيتروجين السائل. ملاحظة: اتبع تحذيرات السلامة للتعامل مع أوسو 4 وخلات اليورانيل. ملاحظة: أوسو 4 </suب&gt; وخلات اليورانيل هي مواد كيميائية خطيرة ويجب التعامل معها في غطاء الدخان في حين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك الأحذية المغلقة الأصابع، معطف المختبر وقفازات. ملاحظة: cryovials تستخدم لعقد عينات لQFS ينبغي أن يكون من الصعب يا الدائري لضمان أن تظل أنابيب مختومة خلال QFS لتجنب تسرب أوسو 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عجينة عن طريق خلط الخميرة خميرة الخباز مع حجم مساو تقريبا من 10٪ الميثانول مع مسواك أو غيره صك من هذا القبيل حتى عجينة ناعمة. يعمل عجينة الخميرة باعتبارها cryoprotectant خارج الخلية، ويستخدم لملء الفضاء حول العينة في حامل العينة. كمية من معجون يعتمد على عدد من العينات. لمدة 10 عينات أو أقل لصق (1 مل) يمكن أن تكون مختلطة في أنبوب microcentrifuge. </li></ol> تجميد 3. ارتفاع ضغط العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ورقة (أو الأنسجة الأخرى) من الاهتمام من المصنع ووضعه برفق على قطعة من DENTAل الشمع أو غيرها من سطح القطع. استخدام لكمة من 2.0 مم أو الحجم المطلوب لخفض عينة من ورقة. التعامل مع العينة بلطف مع زوج من ملقط والعمل في أسرع وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعمل تحت مجهر تشريح، ضع القرص ورقة في الجانب 0.2 ملم من نوع (أ) الناقل العينة وتغطية تماما في معجون الخميرة. تأكد من أن القرص يمتلئ تماما ولصق هو المستوى مع حافة حامل من خلال تخفيف عجينة مع الفرشاة الجميلة (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الناقل في حامل العينة. تغطية عينة مع نوع B الناقل العينة، سطح مستو أسفل. ملاحظة: يجب أن يكون حامل عينة جاف وعند درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ العينة في حامل العينة، أدخله في الجهاز وبدء دورة التجميد عن طريق الضغط على زر &quot;JET AUTO&quot;، الذي ينبغي أن يتم في ثانية أو اثنتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل في أسرع وقت ممكن، وإزالة حامل من الجهاز ومكان غيض عقد عصيدةلو في النيتروجين السائل في صندوق معزول على رأس الجهاز HPF. تزج نصائح من اثنين من أزواج من الملقط في النيتروجين السائل لفتور لهم. ملاحظة: بعد تجميد، يجب التعامل مع الناقلين فقط مع ملقط تبريد النيتروجين السائل. الدافئة (درجة حرارة الغرفة) ملقط وغالبا ما تكون سبب الفشل في cryotechniques. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح cryovial تحتوي على وسائل الإعلام FS، ووضع غطاء على جانب منطقة الجزاء. مع المعونة من زوج من ملقط تبريد النيتروجين السائل، وإزالة بلطف القرص من صاحب العينة، وضمان أن القرص هو دائما في النتروجين السائل أو البخار. العمل في بخار النيتروجين السائل، عقد أنبوب FS مع واحد ملقط تبرد قبل واستخدام البعض لوضع حامل في القارورة FS. المسمار غطاء القارورة FS مرة أخرى. لا اعتراض أي النيتروجين السائل في القارورة. ملاحظة: عند نقل العينات إلى cryovials لQFS، ضمان عدم وجود النيتروجين السائل محاصرين في قارورة. يوسع النيتروجين السائل 700 أضعاف خلال ارتفاع درجات الحرارة وأي في Trappeد النيتروجين السائل يمكن أن يسبب انفجارات خلال هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،7 حتى يتم تجميد جميع العينات المطلوبة. يمكن وضع أقراص متعددة ورقة تحتوي على نفس نوع العينة في نفس القارورة. لاحظ أن صاحب العينة يحتاج إلى أن تجفف وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة بين أشواط التجمد. للقيام بذلك بسرعة، تسخينها مع مجفف ضربة، ورصد درجة الحرارة عن طريق اللمس. </li></ol> 4. التحضير لتجميد تبديل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما تزج كتلة سخان الألومنيوم في النيتروجين السائل لمدة 10 دقيقة أو حتى يتوقف غليان nucleate. في حين أن هذا يجري، ضع طبقة من الثلج الجاف (1-2 سم) في الجزء السفلي من الحاويات تستخدم غرفة FS (الشكل 3). حاوية الستايروفوم أو دلو الثلج يمكن استخدامها لFS، جنبا إلى جنب مع سحق الثلج الجاف أو الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بسرعة cryovials تحتوي على عينات جنبا إلى جنب مع تحقيق درجة الحرارة في الصفوف الوسطى من كتلة سخان. تأكد من أن أغطية علىوثمل قارورة بإحكام على ذلك أن وسائل الإعلام FS لا يتسرب خلال FS. بدء تسجيل درجات الحرارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التحقيق في درجة الحرارة عن طريق وضع الحرارية من خلال الجزء العلوي من cryovial بحيث تصل إلى أسفل الأنبوب. ختم غطاء أنبوب مع الراتنج بحيث لا تسرب السائل خارج. ملء الأنبوب مع 1.5 مل الأسيتون في بداية كل تشغيل QFS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام cryogloves معزول أو ملقط كبيرة، من اجل الخروج عن النيتروجين السائل من كتلة سخان. والحرص على عدم اجل الخروج من cryovials. ملاحظة: استخدام معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك cryogloves ونظارات واقية عند التعامل مع النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كتلة تحتوي على قوارير على طبقة من الثلج الجاف في غرفة QFS. تأكد من وضع كتلة بحيث أنابيب يكذبون أفقيا ولكن مع الميل الصاعد الطفيف. ينبغي أن يكون هناك أي تسرب إذا تم استخدام cryovials الصحيحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حزمة غرفة QFS مع الثلج الجاف بحيث يتم تغطية الأنابيب FS، على الرغم من أنه ليس من الضروريتغطية الجزء العلوي من كتلة. وضع غطاء على الغرفة. </li></ol> 5. السريع FS ملاحظة: إجراء المدى QFS في غطاء الدخان في حالة أن أي تسرب 4 أوسو يحدث عن غير قصد على الرغم من الاحتياطات الأخرى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غرفة QFS على منصة دوار شاكر في غطاء الدخان وتناوب على 125 دورة في الدقيقة لمدة 120 دقيقة. خلال هذا الوقت درجة حرارة كتلة ينبغي أن تزيد تدريجيا إلى حوالي -80 ° C. التحريض يضمن خلط المكونات لFS أفضل. ملاحظة: وضع شاكر في غطاء الدخان وموقف هود باب الدخان يجب أن تكون هي نفسها في جميع أنحاء الداخلي QFS ولكل QFS تشغيل لضمان الاحترار ثابت من العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الثلج الجاف من غرفة ومواصلة تهتز لمدة ساعة أخرى. ملاحظة: درجة الحرارة يجب أن تزيد إلى حوالي -15 ° C إلى -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العينات ومسبار درجة الحرارة من غرفة QFS وضعها علىشاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة أخرى، حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. إيقاف تسجيل درجات الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال FS، وإيقاف آلة HPF. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الصنبور من خزان النتروجين السائل بينما يتم ملء آلة HPF مع النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &quot;النيتروجين&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار حتى الحمراء &quot;المكبس لأسفل&quot; تطفئ الخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على &quot;ON / OFF&quot; زر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على زر &quot;SYSTEM تجف&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع إمدادات الهواء المضغوط إلى الجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مدة لا تقل عن 12 ساعة (لضمان التجفيف من أي رطوبة)، إيقاف تشغيل الجهاز عن طريق تحويل المفتاح الرئيسي من &quot;1&quot; إلى &quot;0&quot;. </li></ol></li></ol> 6. مشاركة FS معالجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وسائل الإعلام FS مع الماصات البلاستيكية ونقل مكان في الحاوية المناسبة للنفايات السامة. ملاحظة: أوسو 4 وخلات اليورانيل هي مواد كيميائية خطرةوينبغي التعامل معها في غطاء الدخان في حين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك الأحذية المغلقة الأصابع، معطف المختبر وقفازات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات أربع مرات مع 100٪ الأسيتون. جمع يغسل الأولين ووضع في حاوية النفايات السامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط غرامة، وإزالة عينات الأنسجة من أصحاب. الاحتفاظ بعينات الرطب مع الأسيتون كما يتم ذلك، والعمل بلطف شديد لتجنب كسر العينات. ملاحظة: ليس غريبا وأنه قد يكون في الواقع مفيدة لديك عجينة الخميرة تقع بعيدا عن العينات في هذه المرحلة. معجون الخميرة عادة البني الداكن جدا في حين أن الأنسجة ورقة لا تزال خضراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العينات في cryovials تحتوي على الأسيتون. المضي قدما في إعداد العينات (تسلل والتضمين) لTEM وفقا لبروتوكولات المعتادة. </li></ol>

<ol>
	<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).</li><li>Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+of+soybean+nodules+leads+to+an+improved+preservation+of+ultrastructure.">High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure.</a> Planta. 188, 155-163 (1992).</li><li>Bowers, B. a. M. M., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+2.">Ch 2.</a> Artifacts in Biological Electron Microscopy. 2, 13-42 (1988).</li><li>Mollenhauer, H. H., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+3.">Ch 3.</a> Artifacts in Biological Electron Microscopy. , 43-64 (1988).</li><li>Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+ultrastructure+of+conventionally+fixed+and+high+pressure+frozen/freeze+substituted+root+tips+of+Nicotiana+and+Arabidopsis.">Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis.</a> Protoplasma. 157, 64-74 (1990).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing.">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).</li><li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice.</a> Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).</li><li>McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+preservation+of+high+resolution+fine+structure+and+antigenicity+for+immunolabeling.">High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling.</a> Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).</li><li>Hippe-Sanwald, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freeze+substitution+on+biological+electron+microscopy.">Impact of freeze substitution on biological electron microscopy.</a> Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).</li><li>Kiss, J. Z., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+immunocytochemistry+following+cryofixation+and+freeze+substitution.">Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution.</a> Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).</li><li>Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+of+somatic+cell+plate+formation+in+meristematic+cells+of+Arabidopsis+preserved+by+high-pressure+freezing.">Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing.</a> The Plant cell. 16, 836-856 (2004).</li><li>Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INCREASED+SIZE+EXCLUSION+LIMIT+encodes+a+putative+DEVH+box+RNA+helicase+involved+in+plasmodesmata+function+during+Arabidopsis+embryogenesis.">INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis.</a> The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).</li><li>Austin, J. R., 2nd, L. A., Staehelin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+grana+and+stroma+thylakoids+of+higher+plants+as+determined+by+electron+tomography.">Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography.</a> Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).</li><li>McDonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+substitution+in+3+hours+or+less.">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).</li><li>Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Vacuole.">The Plant Vacuole.</a> The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).</li><li>Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+freeze-substituted+plasmodesmata.">Substructure of freeze-substituted plasmodesmata.</a> Protoplasma. 169, 28-41 (1992).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Embedding+Methods+into+Epoxy+and+LR+White+Resins+for+Morphological+and+Immunological+Analysis+of+Cryofixed+Biological+Specimens.">Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens.</a> Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).</li><li>McDonald, K. L., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing,+cellular+tomography,+and+structural+cell+biology.">High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology.</a> BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).</li><li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy.">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PloS one. 5, e9014 (2010).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

نجاح بروتوكول المقدمة هنا يعتمد بشكل كبير على المستخدم. أولا، يتعين إعداد متقدمة لضمان توفير جميع المواد اللازمة متوفرة وبكميات كافية لإكمال كامل المدى HPF-QFS. ثانيا، يجب على المستخدم العمل بسرعة، والانتقال من خطوة إلى خطوة بطريقة فعالة أن يقلل معالجة عينة، وبالتالي ?...

<html> لدينا معرفة التركيب الدقيق خلية تأتي أساسا من المجهر الإلكتروني، والتي يمكن حلها من التفاصيل في حدود بضع نانومتر 1. على الرغم من كونها قوية جدا في قرار TEM لا تعتبر سهلة الاستخدام، وإعداد العينات يتطلب وقتا طويلا وبروتوكولات شاقة، ويتطلب بعض الخبرة من ممارس. تثبيت التقليدي للعينات والجمع بين استخدام الألدهيدات ورباعي أكسيد الأوزميوم قبل مزيد من المعالجة التي تشمل الجفاف، والتضمين في الراتنج ومن ثم باجتزاء لإنتاج المقاطع رقيقة جدا أن يتم بعد ذلك ملطخة المعادن الثقيلة. ومع ذلك، فمن المعروف أن التثبيت الكيميائي يمكن ان تنتج القطع الأثرية بما في ذلك تجميع البروتين وفقدان الدهون 1، والتغيرات في الأغشية التي تؤثر في نهاية المطاف عدة مقصورات الخلوية 2. وتنسب هذه القطع الأثرية إلى حد كبير إلى بطء معدل التثبيت والجفاف في درجة حرارة الغرفة 3 و 4 و 5. &quot;jove_content&quot;&gt; Cryofixation من ارتفاع ضغط التجمد (HPF) يتجنب معظم القطع الأثرية التي تسببها التثبيت الكيميائي. مبدأ cryofixation هو أنه يقلل من درجة التجمد للمياه بنسبة 20 درجة، يبطئ التنوي ونمو بلورات الثلج ويزيد من لزوجة الماء في عينة بيولوجية بحيث المكونات الخلوية ويجمد أساسا 6 و 7. يقلل HPF و درجة حرارة العينة إلى أن من النيتروجين السائل، تحت ضغط عال جدا (210 ميجا باسكال أو 2،100 بار) في ميلي ثانية. عند القيام به بشكل صحيح HPF يمنع تشكيل بلورات الثلج الكبيرة التي يمكن أن تسبب ضررا كبيرا على التركيب الدقيق الخلية. HPF يمكن استخدامها لإصلاح عينات من سمك 100-200 ميكرون في تركيزات نموذجية من المواد المذابة البيولوجية 7. هناك ملاحظات عديدة على الفيزياء والمبادئ الأساسية HPF، على سبيل المثال 1 و 7 و 8. بعد HPF، يتم تحضين العينات في درجة حرارة منخفضة (-78.5 درجة مئوية إلى -90 و# 176؛ C) في وجود المذيبات التي تحتوي على مثبتات الكيميائية العضوية السائلة مثل رباعي أكسيد الأوزميوم، عموما لبضعة أيام. عند هذه الدرجة المنخفضة، يتم استبدال الماء في عينة من المذيبات العضوية، وعادة الأسيتون أو الميثانول 1، 9. وهكذا، وهذا ما يسمى عملية الاستبدال تجميد (FS). ثم يتم تسخين العينة تدريجيا وخلال هذا الوقت هو ثابت، وعادة مع رباعي أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل 9. يشابك في درجات حرارة منخفضة لديه ميزة تحديد الجزيئات التي يتم يجمد 1. لذا FS تنتج عينات عالية الجودة مقارنة بتلك التي تحددها التثبيت الكيميائية التقليدية في درجة حرارة الغرفة، ولا سيما أنه يؤدي إلى تحسين الحفاظ التركيبية، والحفاظ على أفضل استضداد وتقليل فقدان المكونات الخلوية غير منضم 10 و 11. ويتم معظم FS على مدى فترات زمنية طويلة، وعادة ما تصل إلى عدة أيام. هذا هو ترو خاصةالبريد لمحطات عينات 12، 13، 14. بروتوكول الأخيرة التي وضعتها وماكدونالد ويب يقلل بدرجة كبيرة من الوقت لFS من عدة أيام إلى عدة ساعات 15. في هم سريعة الاستبدال تجميد (QFS) الإجراء، يتم FS خروج أكثر من 3 ساعات، بينما في FS السوبر سريعة تتم معالجة عينات (SQFS) في 90 دقيقة. نوعية العينات التي تنتجها هذه الأساليب هي مماثلة لتلك التي حققها بروتوكولات FS التقليدية. لقد اعتمد بروتوكول QFS لالتجهيز النهائي من عينات النبات بعد HPF. وقد ثبت هذا لتوفير الوقت فحسب، بل أيضا المال، كما QFS وSQFS استخدام معدات المختبرات المشتركة بدلا من آلات مكلفة المتاحة تجاريا FS. الأنسجة النباتية غالبا ما تكون صعبة للغاية للتحضير لTEM. في المتوسط، الخلايا النباتية هي أكبر من أي الخلايا البكتيرية أو الحيوانية. وجود مسعور بشرة شمعية، جدران الخلايا سميكة، وفجوات مملوءة بالماء كبيرة تحتوي على الأحماض العضوية، hydrolases والفينول جompounds التي قد تشغل ما يصل إلى 90٪ من حجم الخلية الكلي 16، ووجود فراغات الهوائية يقلل بشدة التوصيل الحراري للنظام 17. علاوة على ذلك، في حالة النباتات، سمك العينة يتجاوز دائما ما يقرب من 20 ميكرون، والحد الأقصى لاستخدام التثبيت الكيميائي. في هذه السماكات، وانخفاض التوصيل الحراري من الماء يمنع معدل تجميد أكثر من -10،000 ° C / ثانية في وسط العينة. مطلوب هذا المعدل لتجنب تشكيل ضررا سداسية الجليد (بلورات الثلج بكثافة أقل وأكبر من 10 إلى 15 نانومتر) 8. معا، وهذه التحديات الحالية على حد سواء تجميد السليم للعينة وFS اللاحقة. ومع ذلك، cryofixation هو أفضل طريقة لتحديد العينات النباتية. هنا يتم تقديم بروتوكول للHPF-QFS من عينات الأنسجة النباتية. وهو يركز على الأنواع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana، ولكن تم أيضا استخدامها مع نيكوتيانا benthamiana. توضح النتائج النموذجية التي HPF-QFS تنتج ساmples من نوعية مماثلة لالتقليدية HPF-FS في جزء من الوقت. مع التعديلات المناسبة، كما يمكن استخدام هذا البروتوكول للعينات البيولوجية سميكة نسبيا الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

منذ 1940s انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) وقد تم توفير علماء الأحياء مع الصور فائقة الدقة من المواد البيولوجية. ومع ذلك، وبسبب البروتوكولات شاقة وتستغرق وقتا طويلا التي تتطلب أيضا خبرة في إعداد العينات خالية من القطع الأثرية، لا يعتبر TEM تقنية سهلة الاستخدام. إعداد نموذج التقليدي للTEM تستخدم مثبتات كيميائية للحفاظ على الهياكل الخلوية. الضغط العالي التجميد هو cryofixation العينات البيولوجية تحت الضغوط العالية لإنتاج معدلات التبريد سريعة جدا، مما يحد تشكيل الجليد، والتي تضر بسلامة التركيب الدقيق الخلوية. تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد حاليا أساليب اختيار لإنتاج أعلى مستوى من الجودة في التشكل أقسام الراتنج لTEM. هذه الأساليب تقلل من القطع الأثرية التي ترتبط عادة مع المعالجة التقليدية للTEM المقاطع رقيقة. بعد cryofixation يتم استبدال المياه المجمدة في العينة مع السائلالمذيبات العضوية في درجات حرارة منخفضة، وتسمى عملية استبدال التجميد. عادة يتم استبدال تجميد على مدى عدة أيام في مخصص، معدات مكلفة. هناك ابتكار مؤخرا يسمح للعملية أن تكتمل في ثلاث ساعات، بدلا من اليومين المعتادة. وعادة ما يعقب ذلك عدة ايام اخرى لإعداد عينة تشمل التسلل وتضمينها في راتنجات الايبوكسي قبل باجتزاء. هنا نقدم بروتوكول الجمع بين تجميد الضغط العالي واستبدال تجميد سريع تمكن مصنع تثبيت العينة التي يتعين إنجازها في غضون ساعات. يمكن بسهولة بروتوكول تكييفها للعمل مع الأنسجة أو الكائنات الحية الأخرى. الأنسجة النباتية هي التي تثير قلقا خاصا بسبب وجود فراغات الهوائية والحويصلات مملوءة بالماء التي تعيق تجميد الخالية من الجليد من المياه. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عملية التثبيت الكيميائية طويلة خاصة في النباتات بسبب جدران الخلايا إعاقة تغلغل المواد الكيميائية إلى أعماق الأنسجة. الأنسجة النباتية هي بالتالي particularly تحديا، ولكن هذا البروتوكول هو موثوق بها وينتج عينات من أعلى مستويات الجودة.

وقد تم الحصول على النتائج المقدمة أدناه باستخدام الاتفاق Wohlwend 02 لHPF (الشكل 1A). واحد الميزة الرئيسية لهذا الصك هو سهولة استخدام ناقلات العينة وحامليها. عند استخدام الأدوات الأخرى، يوصي ماكدونالد أن اثنين من المستخدمين يجب تنفيذ إعداد العينات وHPF، واحدة إعداد ...

Watch this Scientific Journal Video about Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K Views.  University of Tennessee, Knoxville. Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Video: Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

دراسة منظمة Supramolecular من الضوئى الأغشية داخل الأنسجة ورقة بكسر تجميد من قبل كرو مسح الميكروسكوب الالكتروني

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

يغرق التجميد: أداة لدراسات التركيبية وImmunolocalization من خلايا تعليق في نقل المجهر

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

مسح بروتوكولات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لإشكالية النبات، طلائعيات بيضية، وعينات الفطرية

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

فلاش وتجميد: تقنية جديدة لالتقاط غشاء حيوية مع المجهر الإلكتروني

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.