UC Berkeley Dr Kent McDonald iyilik ve cömertlik büyük takdir. Biz çok yararlı önerileri için anonim bir eleştirmen teşekkür ederim. Burch-Smith laboratuvar Tennessee Üniversitesi&#39;nden start-up fonları tarafından desteklenmektedir.

NOT: QFS prosedür kullanıcı tarafından aşırı özen ve dikkat gerektirir ve biz uygulanabilir Dikkatler ve Notlar gibi burada bu güvenlik önlemlerini vurgulayın. HPF Run için 1.Preparation <ol><li> Numune hazırlama başlamadan önce, üreticinin yönergeleri izleyerek yüksek basınçlı dondurucuda açın. NOT: Bu protokolde kullanılan BBA birimi Wohlwend Kompakt 02 ünite (Şekil 1A) ve HPF başlaması için çalışır önce start-up prosedürünün bir-ve-bir buçuk saat yaklaşık bir sürer. <ol><li> Wohlwend Kompakt 02 Yüksek Basınç Dondurucu Açma. <ol><li> &quot;1&quot; den &quot;0&quot; ana şalteri çevirerek aracı çalıştırınız. </li><li> Makineye basınçlı hava bırakın. </li><li> Makineye sıvı nitrojen bırakın. </li><li> Basın &quot;SİSTEM KURU YUKARI&quot; düğmesine basın. </li><li> 30 dakika sonra, &quot;sisteminin gelişmesini basınM KURU YUKARI &quot;butonuna tekrar. </li><li> Basın &quot;ON / OFF&quot; düğmesine enstrüman açmak için. </li><li> &quot;AZOT&quot; düğmesine basın. </li><li> Düğmesinin &quot;IN DRIVE&quot; zaten yaktı olsa bile makine 20 dakika soğumasını bekleyin. </li><li> Yukarı düğmesine ışıkları &quot;IN DRIVE&quot;. </li><li> Düğmesinin &quot;IN SÜRÜCÜ&quot; tuşuna basın. </li><li> &quot;AUTO&quot; tuşuna basınız. </li><li> &quot;SİSTEM HAZIR&quot; düğmesi yanar. </li><li> Basınç odasına, sıcaklık ve basınç sensörünün ve pimle kilitlemek. </li><li> &quot;JET AUTO&quot; düğmesine basın. Arzu edildiği gibi basınç artışı ve sıcaklık azalması olduğunu kontrol eder Bu adım; aslında bir deneme. Sıcaklık ve basınç keskin bir artış gösterdiği keskin damlası (Şekil 1B) beklenmektedir. </li><li> Iki JET döngüleri yürütmek. </li></ol></li></ol></li></ol> Receivi 2. Hazırlıkng Donmuş numuneler <ol><li> Sahipleri tamamen (Şekil 1C) kaplıdır, böylece sıvı nitrojen ile kriyotüpe sahiplerine içeren yalıtılmış kutusu doldurun, (Güvenlik Uyarılarını bakınız). NOT: Sıvı azot tutarken Kullanım KKE cryogloves ve gözlük dahil. </li><li> Sıvı azot (Şekil 1C) olarak alüminyum tüp yuvalarına FS orta içeren flakon uygun sayıda yerleştirin. Dört diskler için bu protokol ile tek bir örnek içeren her bir tek cryovial yerleştirilebilir. NOT: Şişeler elmas uçlu kâtip ve çok yumuşak kurşun kalem gibi keskin bir aletle ile etiketlenmiş olmalıdır. <ol><li> QFS esnasında sabitleyici aseton 9% 1 OsO 4 ve% 0.1 uranil asetat kullanır. Sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve cryovials deposuna 1,5 ml hacimde dağıtılması, büyük hacimde çözelti hazırlayın. NOT: OSO 4 ve Uranil asetat işleme için Güvenlik Uyarılarını izleyin. NOT: OsO 4 </sub&gt; ve Uranil asetat tehlikeli kimyasallar ve kapalı burunlu ayakkabılar, laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek davlumbaz ele alınmalıdır. NOT: QFS için örnek tutmak için kullanılan cryovials tüpler OSO 4 sızmasını önlemek için QFS sırasında mühürlü kalmasını sağlamak için sert bir O-ring olmalıdır. </li></ol></li><li> Hamur pürüzsüz olana kadar bir kürdan veya diğer bir araç ile,% 10 metanol, kabaca eşit hacimde fırıncı mayası karıştırılarak maya hamurunu hazırlayın. Maya macun, hücre dışı bir dondurarak saklama koruyucusu gibi hareket eder ve numune taşıyıcıya numune etrafında alanı doldurmak için kullanılır. Macunun miktarı numune sayısına bağlıdır; 10 numune veya daha az macun (1 mi), bir mikrosantrifüj tüpü içinde karıştırılmıştır de kullanılabilir. </li></ol> Örneklerinin 3. Yüksek basınçlı Donma <ol><li> Bitkinin ilgi çekici bir yaprak (veya başka doku) çıkarın ve yavaşça Denta bir parça üzerine yerleştirinl balmumu veya diğer kesme yüzeyi. Yapraktan dışarı bir örnek kesmek için, 2.0 mm ya da istenilen büyüklükte bir zımba kullanarak. Forseps bir çift ile hafifçe örnek Kulp ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde çalışır. </li><li> Bir mikroskop altında çalışarak, A Tipi numune taşıyıcı 0.2 mm yan yaprak disk yerleştirmek ve maya macun tamamen kapsamaktadır. Disk tamamen dolu olduğundan emin olun ve hamur ince bir fırça (Şekil 2) ile macun düzleştirilir tutucunun kenarı ile aynı seviyededir. </li><li> Numune tutucu içindeki taşıyıcı yerleştirin. Tip B numune taşıyıcı, düz bir yüzeye aşağı örnek örtün. NOT: örnek tutucu Kuru ve oda sıcaklığında olmalıdır. </li><li> , Numune tutucu örnek alın makineye takın ve bir veya iki saniye içinde tamamlanacaktır &quot;JET OTO&quot; düğmesine basarak bir donma döngüsü başlatmak. </li><li> Mümkün olduğunca çabuk Çalışma, makineden tutucusunu çıkarın ve samp tutan ucu yerleştirinle HPF makinesinin üzerinde yalıtılmış bir kutu ile sıvı azot içine. Bunların soğuk sıvı azot içinde forseps iki çift ipuçları bırakın. NOT: dondurulduktan sonra, taşıyıcılar sadece sıvı azot soğutmalı forseps ile ele alınmalıdır. Sıcak (oda sıcaklığı) forseps sık cryotechniques başarısızlık nedenidir. </li><li> FS ortamı ihtiva eden bir cryovial açın ve kutunun yan kapağı yerleştirin. Sıvı nitrojen soğutmalı bir çift forseps yardımıyla yavaşça disk sıvı azot ya da buharında sürekliliği garanti altına, örnek tutucudan dışarı diski çıkarın. Sıvı azot buharında çalışan, bir ön-soğutulmuş forseps ile FS tüpü tutmak ve FS flakon tutucu yerleştirmek için diğer kullanın. Geri FS şişenin kapağını takın. Değil kapanı şişe içinde herhangi bir sıvı azot yapın. NOT: QFS için cryovials herhangi bir sıvı azot şişelerde tuzak olduğundan emin olmak için numuneler aktarılması. Sıvı azot ısınma ve herhangi Trappe sırasında 700 kat genişletird sıvı azot, bu süre içinde patlamasına yol açabilir. </li><li> İstenen tüm numuneleri dondurulmamalıdır kadar tekrarlayın 3,1-3,7 adımları. Örneğin aynı türünü içeren birden fazla yaprak diskleri maddesi aynı şişe içinde yerleştirilebilir. Örnek tutucu kurutuldu ve dondurma çalışmalar arasında, oda sıcaklığına getirildi gerektiğini not edin. Hızlı Bunu yapmak için, bir fön makinesi ile ısıtın ve dokunma ile onun sıcaklığını izlemek. </li></ol> Freeze Değişiklik 4. Hazırlık <ol><li> Tamamen 10 dakika boyunca ya da çekirdek kaynama duruncaya kadar sıvı azot içinde alüminyum ısıtıcı blok bırakın. Bu devam ederken, FS odası (Şekil 3) olarak kullanılan kabın alt kuru buz (1-2 cm) &#39;lik bir tabaka yerleştirin. Plastik bir kap veya buz kovası ezilmiş kuru buz veya topaklar ile birlikte, FS için kullanılabilir. </li><li> Hızlı bir şekilde ısıtıcı bloğun orta satırlar halinde sıcaklık probu ile birlikte numuneleri içeren cryovials yerleştirin. Emin olun ki üzerinde kapaklarıFS medya FS sırasında akmaması böylece flakon sıkıca vidalanır. Sıcaklığı kaydetmeye başlarsınız. <ol><li> Bu tüpün alt kısmını ulaşacak şekilde, bir dondurarak saklama viali üst kısmından, bir termokupl yerleştirerek sıcaklık probu olun. Reçine ile tüpün kapağını böylece hiçbir sıvı sızıntısı üzerinden sıkıca kapatın. Her QFS çalışma başında 1.5 ml aseton ile tüp doldurun. </li></ol></li><li> Yalıtımlı cryogloves veya büyük forseps kullanarak, ısıtıcı blok tüm sıvı nitrojen dökmek. Kriyotüplerin dışarı dökmek için değil dikkat edin. NOT: Sıvı azot tutarken Kullanım KKE cryogloves ve gözlük dahil. </li><li> QFS bölmesi içinde kuru buz tabakası üzerine şişeleri içeren blok yerleştirin. Blok tüpler yatay yalan böylece yerleştirilmiş ama hafif yukarı doğru eğim ile emin olun. Doğru cryovials kullanıldığında, herhangi bir sızıntı olmalıdır. </li><li> FS tüpler sahiptir, böylece gerekli olmamasına rağmen, kuru buz ile QFS haznesi paketibloğun üst kapağı. Oda üzerindeki kapağı yerleştirin. </li></ol> 5. Hızlı FS NOT: OSO 4 bir kaçak yanlışlıkla başka önlemlere rağmen meydana durumunda bir davlumbaz QFS çalıştırması yapın. <ol><li> Bir çeker ocak içinde, bir eklemli döner bir karıştırıcı üzerinde QFS odasına yerleştirin ve 120 dakika boyunca 125 rpm&#39;de döndürün. Bu süre boyunca, bloğun sıcaklığı, yaklaşık -80 ° C&#39;ye kadar yavaş yavaş artırmalıdır. Ajitasyon daha FS bileşenlerinin karışma sağlar. NOT: Bir çeker ocak içinde karıştırıcı ve bir davlumbaz kapı pozisyonuna yerleştirilmesi QFS uygulama boyunca numune tutarlı ısınma sağlamak için çalıştıkları her QFS için aynı olmalıdır. </li><li> Odasından kuru buz çıkarın ve bir saat daha çalkalamaya devam edilir. Not: sıcaklığı yaklaşık -15 ° C ila -20 ° C&#39;ye kadar artmalıdır. </li><li> QFS odasından örnekleri ve sıcaklık probu çıkarın ve üzerine yerleştirinBaşka bir 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcı, dek oda sıcaklığına ulaşır. Sıcaklığını Kaydı durdur. </li><li> FS sırasında, HÖF makineyi kapatın. <ol><li> HPF makine nitrojen ile doldurulur esnasında sıvı azot tankın musluğu kapatın. </li><li> &quot;AZOT&quot; düğmesine basın. </li><li> Kırmızı &quot;PİSTON AŞAĞI&quot; ışık sönene kadar bekleyin. </li><li> &quot;ON / OFF&quot; tuşuna basınız. </li><li> Basın &quot;SİSTEM KURU YUKARI&quot; düğmesine basın. </li><li> Makineye basınçlı hava kaynağını kapatmak için kullanılır. </li><li> 12 saat sonra en az, (herhangi bir nem kurumasını sağlamak için) &quot;0&quot;, &quot;1&quot; den ana şalteri çevirerek makineyi kapatın. </li></ol></li></ol> 6. Post FS İşleme <ol><li> Dikkatle zehirli atıklar için uygun bir konteynere plastik transferi pipetler ve yer ile FS ortamı çıkarın. NOT: OsO 4 ve Uranil asetat tehlikeli kimyasallardırkapalı-parmaklı ayakkabı, laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek ve davlumbaz ele alınmalıdır. </li><li> Yıkama numuneler% 100 aseton ile dört kez. İlk iki yıkar toplayın ve zehirli atık konteynerine yerleştirmek. </li><li> Ince forseps kullanarak, sahiplerinden doku örneklerini kaldırmak. Bu yapıldığı gibi aseton ile ıslak örnekleri tutmak ve kırma örnekleri önlemek için çok hafifçe çalışır. NOT: Bu sıradışı değildir ve aslında maya paste bu noktada uzak örneklerinden düşmek için yararlı olabilir. Yaprak dokusu hala yeşil iken maya macun genellikle çok koyu kahverengi. </li><li> Aseton içeren cryovials örnekleri alınmalıdır. Her zamanki protokollere göre TEM için numune hazırlama (infiltrasyon ve gömme) ile devam edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).</li><li>Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+of+soybean+nodules+leads+to+an+improved+preservation+of+ultrastructure.">High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure.</a> Planta. 188, 155-163 (1992).</li><li>Bowers, B. a. M. M., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+2.">Ch 2.</a> Artifacts in Biological Electron Microscopy. 2, 13-42 (1988).</li><li>Mollenhauer, H. H., Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+3.">Ch 3.</a> Artifacts in Biological Electron Microscopy. , 43-64 (1988).</li><li>Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+ultrastructure+of+conventionally+fixed+and+high+pressure+frozen/freeze+substituted+root+tips+of+Nicotiana+and+Arabidopsis.">Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis.</a> Protoplasma. 157, 64-74 (1990).</li><li>Moor, H., Steinbrecht, R. A., Zierold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 175-191 (1987).</li><li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing.">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).</li><li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice.</a> Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).</li><li>McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+preservation+of+high+resolution+fine+structure+and+antigenicity+for+immunolabeling.">High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling.</a> Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).</li><li>Hippe-Sanwald, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freeze+substitution+on+biological+electron+microscopy.">Impact of freeze substitution on biological electron microscopy.</a> Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).</li><li>Kiss, J. Z., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+immunocytochemistry+following+cryofixation+and+freeze+substitution.">Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution.</a> Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).</li><li>Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+of+somatic+cell+plate+formation+in+meristematic+cells+of+Arabidopsis+preserved+by+high-pressure+freezing.">Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing.</a> The Plant cell. 16, 836-856 (2004).</li><li>Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INCREASED+SIZE+EXCLUSION+LIMIT+encodes+a+putative+DEVH+box+RNA+helicase+involved+in+plasmodesmata+function+during+Arabidopsis+embryogenesis.">INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis.</a> The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).</li><li>Austin, J. R., 2nd, L. A., Staehelin, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+grana+and+stroma+thylakoids+of+higher+plants+as+determined+by+electron+tomography.">Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography.</a> Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).</li><li>McDonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+substitution+in+3+hours+or+less.">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).</li><li>Taiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Vacuole.">The Plant Vacuole.</a> The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).</li><li>Wilson, S. M., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+plant+cells+for+transmission+electron+microscopy+to+optimize+immunogold+labeling+of+carbohydrate+and+protein+epitopes.">Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes.</a> Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).</li><li>Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+freeze-substituted+plasmodesmata.">Substructure of freeze-substituted plasmodesmata.</a> Protoplasma. 169, 28-41 (1992).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Embedding+Methods+into+Epoxy+and+LR+White+Resins+for+Morphological+and+Immunological+Analysis+of+Cryofixed+Biological+Specimens.">Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens.</a> Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).</li><li>McDonald, K. L., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing,+cellular+tomography,+and+structural+cell+biology.">High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology.</a> BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).</li><li>Spiegelhalter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+dynamic+live+cell+imaging+to+3D+ultrastructure+novel+integrated+methods+for+high+pressure+freezing+and+correlative+light-electron+microscopy.">From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy.</a> PloS one. 5, e9014 (2010).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan protokolün başarısı kullanıcıya büyük ölçüde bağlıdır. İlk olarak, gelişmiş hazırlık gerekli tüm maddeler kolaylıkla edinilebilir ve bütün bir HPF-QFS çalıştırmak tamamlamak için yeterli miktarda olmasını sağlamak için gereklidir. İkinci olarak, kullanıcı ve böylece doku yerli durumda değişiklikleri en aza indirerek, örnek işlemlerine en aza indiren bir verimli bir şekilde adım-adım için hareket, hızlı bir şekilde çalışmalıdır. Örnekleri dondurulmuş ve...

Hücre ultrastrüktürü bilgilerimiz birkaç nanometre 1 aralığında ayrıntıları çözebilir elektron mikroskobu, ağırlıklı olarak geliyor. Numune hazırlama zaman alıcı ve zahmetli protokolleri gerektirir ve uygulayıcısı bazı uzmanlık gerektirir gibi çözünürlükte TEM kadar güçlü olmasına rağmen, kullanıcı dostu olarak kabul edilmez. Numunelerin Geleneksel tespit reçine içinde yerleştirilmesi ve daha sonra, ağır metaller ile boyanır ultra-ince kesitlerin kesit, dehidratasyon içerir, ilave işlemden önce aldehit ve ozmiyum tetroksit kullanımını birleştirmektedir. Ancak, kimyasal sabitleme sonuçta çeşitli hücresel bölmeleri 2 etkileyecek zarlarında protein toplama ve lipidlerin 1 kaybı ve değişiklikleri içeren eserler üretebilir bilinmektedir. Bu eserler büyük ölçüde oda sıcaklığında 3, 4, 5, fiksasyon ve dehidratasyon yavaş hızı atfedilir. 7. HPF bir azalır, 20 derece, suyun donma noktasını düşüren buz kristallerinin çekirdeklenme ve büyüme yavaşlar ve hücresel bileşen, esasen 6 immobilize edilir, böylece bir biyolojik numunede suyun viskozitesini arttırdığına olduğu milisaniye olarak çok yüksek basınçlı (210 MPa veya 2100 bar) altında sıvı azot edilene numunesinin sıcaklık. Düzgün yapılmazsa HPF hücre ultrastrüktürdeki büyük zarar verebilir büyük buz kristallerinin oluşumunu önler. HPF biyolojik çözünen 7 tipik konsantrasyonları, 100-200 um kalınlığında örnekleri saptamak için kullanılabilir. HPF, örneğin 1, 7, 8 yatan sayısız fizik yorum ve ilkeler vardır. HPF sonra numuneler -90 ve düşük bir sıcaklıkta (-78.5 ° C enkübe edilirGenellikle birkaç gün boyunca osmiyum tetroksit gibi bir organik çözücü içeren sıvı kimyasal tespit, mevcudiyetinde ° C); 176.. Bu düşük sıcaklıkta, numunedeki su, organik bir çözücü, tipik olarak, aseton veya metanol 1, 9 ile değiştirilir. Bu yüzden, bu işlem olarak adlandırılır dondurularak ikamesi (FS) göstermektedir. Numune, daha sonra yavaş yavaş ısıtılır ve bu süre içinde genellikle ozmiyum tetroksit ve uranil asetat 9 ile sabitlenir. Düşük sıcaklıklarda çapraz bağlama molekülleri 1 hareketsiz sabitleme avantajına sahiptir. FS bu yüzden geliştirilmiş bir ince yapı korunmasını sağlar, özellikle oda sıcaklığında, geleneksel kimyasal tespiti ile tespit kıyasla üstün kaliteli, antijenisite daha iyi korunması örneklerini üreten ve bağlanmamış hücre bileşenlerinin 10, 11 kaybının azaltılması. En FS tipik olarak birkaç güne kadar, çok uzun süreler boyunca gerçekleştirilir. Bu durum, özellikle bir trubitkilerin örnekleri 12, 13, 14 e. McDonald ve Webb tarafından geliştirilen yeni bir protokol ölçüde birkaç saat 15 birkaç gün FS süresini azaltır. Süper hızlı FS (SQFS) numuneler 90 dakika içinde işlenirken onların hızlı dondurma ikamesi (QFS) prosedürde, FS, 3 saat boyunca gerçekleştirilir. Bu yöntemlerle üretilen örneklerin kalitesi geleneksel fs protokolleri ile elde edilen değerler ile karşılaştırılabilir olan. Biz HPF sonra bitki örneklerinin sonraki işlemlerde QFS protokolü kabul etmiştir. QFS ve SQFS yerine pahalı piyasada mevcut FS makineleri ortak laboratuvar ekipman kullanımı gibi bu zaman ama para değil, sadece kazanmak için kanıtlanmıştır. Bitki dokusu sık sık TEM hazırlanmak için çok zorlu. Ortalama olarak, bitki hücreleri, bakteri ya da hayvan hücreleri ya da daha büyüktür. Hidrofobik balmumsu üstderi, kalın hücre duvarları, organik asitler, hidrolazlar ve fenolik içeren büyük c suyla doldurulmuş vaküollerin varlığıiyodu olduğu gibi toplam hücre hacmi 16% 90 kadar işgal edebilir ve hava ile temas yerlerin bulunması ciddi sistemin 17 ısı iletkenliği azalır. Bundan başka, bitkilerin durumunda, örnek kalınlığı hemen hemen her zaman 20 um, kimyasal sabitleme amaçlı limiti aşar. Bu kalınlıktaki, suyun düşük ısı iletkenliği, numunenin merkezinde bir dondurma oranı en fazla -10.000 ° C / saniye önler. Bu oran zarar altıgen buz oluşumunu (daha düşük bir yoğunluğa sahip buz kristalleri ve daha büyük 10-15 nm) kaçınmak için gerekli olan 8. Birlikte, numune ve sonraki FS hem uygun donma bu mevcut sorunlar. Bununla birlikte, cryofixation bitki örneklerinin tespiti için en iyi yöntemdir. İşte bitki doku örneklerinin HPF-QFS için bir protokol sunulmuştur. Bu modeli türleri Arabidopsis thaliana&#39;nın odaklanır, ama aynı zamanda Nicotina benthamiana&#39;nın ile kullanılmıştır. Tipik sonuç HPF-QFS sa ürettiğini göstermektedirzamanın bir kısmını geleneksel HPF-FS karşılaştırılabilir kalitede örnek olarak şunlar verilebilir. Uygun düzenlemeler ile, bu protokol, aynı zamanda, nispeten kalın, diğer biyolojik örnekler için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

1940&#39;larda transmisyon elektron mikroskobu (TEM), biyolojik malzemelerin ultra-yüksek çözünürlüklü görüntüler biyologlara vermektedir beri. Ancak, çünkü aynı zamanda artifakttan ücretsiz numune hazırlama deneyimi talep zahmetli ve zaman alıcı protokoller, TEM kullanıcı dostu bir tekniği olarak kabul edilmez. TEM için numune hazırlanması geleneksel hücresel yapıları korumak için kimyasal tespit kullanılır. Yüksek basınçlı dondurma, bu şekilde selüler genel yapının bütünlüğüne zarar verir buz oluşumunu kısıtlayan çok hızlı soğutma oranlarının, elde etmek için yüksek basınç altında, biyolojik numunelerin cryofixation olan. Yüksek basınçlı dondurma ve dondurularak ikame şu TEM için reçine bölümlerde yüksek kalitede morfolojisini üretmek için tercih edilen yöntemlerdir. Bu yöntemler, genellikle ince kesitlerin TEM için geleneksel işlemler ile bağlantılı etkilerini en aza indirmek. Cryofixation sonra numunenin donmuş suyun sıvı ile değiştirilirDüşük sıcaklıklarda bir organik çözücü, bir ikame olarak adlandırılan bir süreç, dondurularak. Freeze ikame tipik adanmış, pahalı ekipman birkaç gün içinde yapılır. Yeni bir yenilik yerine her zamanki iki gün, işlem üç saat içinde tamamlanması sağlar. Bu, tipik olarak süzülmesini ve kesit önce epoksi reçineleri gömme içeren örnek hazırlama birkaç gün daha fazla takip eder. Burada bitki örneğinin tespit saat içinde gerçekleştirilebilir sağlayan yüksek basınçlı donmayı ve hızlı dondurma ikamesi birleştiren bir protokol mevcut. Protokol kolayca, diğer dokular ya da organizmalar ile çalışmak için adapte edilebilir. Bitki dokuları, çünkü su buzsuz dondurma engel gaz alanları ve suyla doldurulmuş vakuollerin varlığında özel bir endişe vardır. Buna ek olarak, kimyasal sabitleme süreci, doku içinde derine kimyasal maddelerin penetrasyonunu engelleyen hücre duvarları dolayı, bitkiler içerisinde, özellikle uzun. Bitki dokuları, bundan dolayı parçacık halinde olan, taahhüde zorlu, bu protokol, güvenilir ve yüksek kalitede örnekleri üretir ama.

Aşağıda sunulan sonuçlar HPF için bir Wohlwend İlkeler 02 (Şekil 1A) kullanılarak elde edilmiştir. Bu aletin önemli bir avantajı, numune taşıyıcılar ve taşıyıcılarıyla kullanım kolaylığıdır. Diğer aletleri kullanırken, McDonald iki kullanıcı diğer dondurulması yapar ve FS transfer 9 cryovials ederken örneklerini hazırlamakta numune hazırlığı ve HPF, bir yürütmek gerektiğini önerir. Ancak, Wohlwend taşıyıcılar ve tutucu bir tek kullanıcının bağ?...

Watch this Scientific Journal Video about Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K Görüntüleme.  University of Tennessee, Knoxville. Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Video: Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Biyoloji

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Cryo-tarama elektron mikroskobu tarafından Freeze-kırık Yaprak Dokular içinde Fotosentez Membranlarının Supramoleküler organizasyonu incelenmesi

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Sorunlu Tesisi, Oomiçet ve fungal Örnekleri için Elektron Mikroskobu (SEM) Protokoller tarayarak

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flaş-ve-Freeze: Elektron Mikroskobu ile Membran Dinamikler Yakalama Yeni Bir Tekniği

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.