الكتاب نود أن نعترف المنح التالية من المعاهد الوطنية للصحة لدعم هذا البحث: K08DK082783 (AR)، P30DK56465 (BTS)، U01HL099993 (BTS)، T32HL00715036 (SKS)، وK12HL0806406 (SKS)؛ ومؤسسة JP مكارثي (AR).

مكتوبة المستنيرة، كما وافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية لمركز أبحاث السرطان فريد هاتشينسون والأطفال &quot;في مستشفى فيلادلفيا، تم الحصول عليها من المرضى قبل جمع عينات الدم الطرفية. وحظت جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية. جميع التجارب على الحيوانات بما في ذلك توليد MEF و وتمت الموافقة على تشكيل مسخي من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي. 1. Ficoll فصل PBMCS وتوسيع الأرومة الحمراء - اليوم 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الدم المحيطي 1: 1 مع Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS). في 15 مل جولة القاع أنبوب البوليسترين، طبقة بعناية 7 مل من الدم المخفف على 3 مل من درجة حرارة الغرفة Ficoll-Hypaque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينة في 400 x ج لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وPBMCs سيكون قد استقر على واجهة بين البلازما وFicoll-Hypaque، ينظر إليها على أنها طبقة بيضاء غائم. باستخدام ماصة نقل معقمة، وجمع PBالمعلقون في واحدة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تبرزي حجم 10 مل باستخدام DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عدادة الكريات، عد PBMCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 × 10 6 PBMCs إلى 15 مل أنبوب مخروطي منفصل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تدور أسفل الخلايا المتبقية وتجميد بتركيز 2 × 10 6 PBMCs / مل في 90٪ مصل بقري جنيني (FBS) سلفوكسيد / 10٪ ميثيل (DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد التوسع المتوسطة: QBSF-60 مصل المتوسطة مجانا (حماية من الضوء) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪) + حمض الاسكوربيك (50 نانوغرام / مل) + خلية الجذعية عامل (SCF، 50 نانوغرام / مل) + 3 انترلوكين (ايل 3، 10 نانوغرام / مل) + الإريثروبويتين (EPO، 2 U / مل) + الأنسولين مثل عامل النمو 1 (IGF-1، 40 نانوغرام / مل) + ديكساميثازون (1 ميكرومتر، وحماية من الضوء، ذوبان الجليد قسامة جديدة كل وسائل الاعلام تغيير). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend 2 × 10 6 PBMCs في 2 مل من تقدم طازجة متوسطة التوسع ومكان في بئر واحدة من 12 لوحة الثقافة الأنسجة جيد واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع جو من 5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 ويوم 6، يحل محل وسائل الإعلام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا ويغسل جيدا مع 2 مل من QBSF-60 لجمع أي الخلايا المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 2 مل من جديد التوسع المتوسطة وإعادتها إلى نفس 12 لوحة جيدا. </li></ol></li></ol> 2. إعادة برمجة الخلايا من خلال Nucleofection - اليوم 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة البلازميدات إلى إعادة برمجة العقيمة 1.5 مل أنبوب إيبندورف (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحل nucleofection مع الملحق (المزودة من قبل الشركة المصنعة) وماصة في معقم 1.5 مل إيبندورف أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 مل من متوسطة التوسع في بئر واحدة من 12 لوحة جيدا ومكان في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2) للموازنة قبل إضافة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمعالخلايا المستزرعة ويغسل جيدا مع 2 مل من QBSF-60 لجمع الخلايا المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 5 مل من DPBS والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر من حل nucleofection + الملحق، مع الحرص على تجنب الفقاعات تولد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة تعليق الخلية في أنبوب يحتوي على البلازميدات إعادة برمجة، ماصة صعودا وهبوطا مرة واحدة، وماصة العينة إلى أسفل كفيت nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كفيت في الجهاز nucleofection وتشغيل برنامج T-019. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من التوسع prewarmed المتوسطة (من لوحة تحقيق التوازن في الخطوة 2.3) في كفيت nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور جمع العينة كلها وديعة في البئر من قبل تحسنت التوسع المتوسطة. تجنب جمع البيض، وتطفو حطام الخلايا الميتة. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2) للنمو. </li></ol> 3. طلاء الخلايا المغذية - يوم 10 أو 11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 10، وخلايا لوحة المغذية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة واحدة 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة مع الجيلاتين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 م من 0.1٪ الجيلاتين في مخزنة المالحة الحل هانك (HBSS) في كل بئر من لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة قبل الاستخدام، نضح الحل الجيلاتين من لوحة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قارورة واحدة من 2 × 10 6 الخلايا الليفية الماوس الجنينية المشع في 3000 CGY إلى 10 مل من prewarmed MEF الإعلام (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) + FBS (10٪) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. resuspend الخلايا في 12 مل من MEF الإعلام وماصة 2 مل طn لكل بئر من الجيلاتين المغلفة 6 لوحة جيدا. وضع لوحة في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2) حتى يوم 12. </li></ol></li></ol> 4. طلاء الخلايا في الخلايا المغذية وتغيير المتوسطة - اليوم 12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا nucleofected في واحدة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وجمع أي الخلايا المتبقية قبل غسل جيدا مع 2 مل من QBSF-60. الطرد المركزي العينة في 300 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إعادة برمجة المتوسطة: Iscove في التعديل متوسطة Dulbecco و(IMDM) + FBS (10٪) + غير الحيوانية L-الجلوتامين (1 ملم) + غير الاساسيين من الأحماض الأمينية (NEAA، 1٪) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪) + β -mercaptoethanol (0.1 مم) + عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF وأضاف العذبة في التغذية، و 10 نانوغرام / مل) + حمض الأسكوربيك (أضاف طازجة في التغذية، 50 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وطاف resuspend الخلايا في 12 مل من إعادة برمجة متوسطة. ماصة 2 مل لكل بئر من تعليق خلية فيلوحة 6 جيدا من الخلايا المغذية (كما أعدت في القسم 3). أجهزة الطرد المركزي لوحة في 50 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O 2 و 5٪ CO 2، و 90٪ N 2) للنمو. تغيير متوسطة إعادة برمجة كل يوم حتى تبدأ المستعمرات IPSC الظهور (1-2 أسابيع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد HESC المتوسطة: DMEM / F12 1: 1 + خروج المغلوب استبدال المصل (20٪) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪) + NEAA (1٪) + غير الحيوانية L-الجلوتامين (1 ملم) + البيروفات الصوديوم (1٪) + بيكربونات الصوديوم (0.12٪) + β المركابتويثانول (0.1 مم) + bFGF (أضيف جديدا في التغذية، و 10 نانوغرام / مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد مثبطات HDAC: الزبدات الصوديوم (مضافة جديدة في التغذية، و 100 ميكرومتر)، حمض suberanilohydroxamic (SAHA وأضاف العذبة في تغذية، و 200 نيوتن متر). مرة تظهر المستعمرات IPSC، تبدأ تغذية الخلايا مع مثبطات HESC المتوسطة + HDAC، وتغيير المتوسطة كل يوم. ملاحظة: الزبدات الصوديوم هو جزيء صغير يتم كثف لأنابيب بلاستيكية، رherefore تخزينه في أنبوب زجاجي البورسليكات في 4 درجات مئوية. </li></ol> 5. النسخ عزل IPSC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة المستعمرات IPSC هي كبيرة بما يكفي لتكون معزولة (20-25 الخلايا)، اعتقالهما مع ماصة P20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد مثبطات HDAC: الزبدات الصوديوم (مضافة جديدة في التغذية، و 100 ميكرومتر)، SAHA (مضافة جديدة في التغذية، و 200 نانومتر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المستعمرات المعزولة على iMEFs الفردية في 35 ملم الأطباق التي تحتوي على مثبطات HESC المتوسطة + + HDAC الاستنساخ والانتعاش الملحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم بعد حصوله على المستعمرات، وتغيير وسيلة لمثبطات HESC المتوسطة + HDAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير متوسطة كل يوم حتى المستعمرات IPSC جاهزة للالركض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مثبطات HDAC من المتوسط ​​مرة واحدة تستقر في المستعمرات مرور 2-3. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling.">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li><li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors.">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li><li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway.">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells.">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li><li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells.">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes.">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li><li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines.">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li><li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector.">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li><li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines.">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li><li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibitors:+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs.">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li></ol>

تعلن المؤلفون أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

لتوليد IPSC الناجح عند استخدام هذا البروتوكول، وهناك العديد من المحاذير المهمة التي ينبغي النظر فيها. خلال مرحلة التوسع أرومة الحمراء، ينبغي اتباع الجدول الزمني للتغيير وسائل الإعلام بدقة، والانحرافات قد يؤدي إلى تحفيز فعال من السكان خلية سلفية الهدف وكفاءة أقل من ج?...

وتستمد iPSCs من الأنسجة الجسمية عن طريق التعبير خارج الرحم من مجموعة صغيرة من جينات تعدد القدرات. وقد تجلى هذا الأسلوب في البداية من قبل تنبيغ فيروسات من الخلايا الليفية الإنسان مع OCT4، SOX2، KLF4، وcMYC، التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في الدولة المحفزة 1. أعرب عابر هذه &quot;عوامل إعادة برمجة&quot; يغير المشهد جينية والجينات الشخصية التعبير الخلية المستهدفة مماثلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية 2. مرة واحدة تم إنشاؤها، iPSCs يحتمل أن تكون متباينة في أي نوع الأنسجة لمزيد من التحقيق. وبالتالي، فإنها تبشر لاستخدامها في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، وتطبيقات العلاج الجيني. ومع ذلك، وتعطيل الجينات مع فيروسات دمج لديه القدرة على تغيير الجينات الذاتية، تأثير النمط الظاهري الخلوية، والتحيز في نهاية المطاف النتائج العلمية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن التكامل الفيروسية عشوائية تؤدي إلى البريد الخلوية ضارأثر بعض، بما في ذلك إمكانية التحول الخبيث 3 أو إعادة التعبير عن الجينات المحورة أنكجنيك 4. سوف التطبيقات السريرية في المستقبل يتطلب دمج الجيل غير IPSC. Episomes، والتي هي خارج الكروموسومات دائري جزيئات الحمض النووي، وتقدم استراتيجية لتوليد فعالة من حيث التكلفة، وخالية من التكامل iPSCs 5. مزيج من ناقلات episomal هو مبين في الجدول 1 التعبير عن عوامل إعادة برمجة OCT4، SOX2، KLF4، MYCL، وLIN28A. يحتوي pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F البلازميد أيضا البروتين p53 shRNA لقمع مؤقت من TP53 لتعزيز إعادة برمجة الخلايا 6. تكرار نقص pCXWB-EBNA1 ناقلات يعزز التضخيم من عوامل إعادة برمجة وإعادة برمجة زيادة الكفاءة من خلال توفير زيادة عابرة في EBNA1 التعبير 7. ويمكن أن يضاف البلازميد pCXLE_EGFP إلى خليط nucleofection لغرض DETErmining كفاءة ترنسفكأيشن أو لتطبيقات الخلايا الفرز. باستثناء ص CXWB-EBNA1، البلازميدات episomal المستخدمة في هذا البروتوكول تتضمن أصل فيروس ابشتاين بار من تكاثر الفيروس وEBNA1 الجين، الذي توسط التكرار وتقسيم يصبوغ أثناء انقسام الخلية المضيفة 8. يتم فقدان episomes تلقائيا مع التوسع التوالي IPSC 7. استنساخ فرعي وتوصيف iPSCs مع episomal فقدان ناقلات، والتي يمكن استنتاجها من فقدان EGFP التعبير، يمكن أن يؤدي إلى التكامل iPSCs خالية تماما للتطبيقات السريرية في المستقبل. ملازمة لعملية توليد IPSC هو قمع للجينات محددة النسب وتنشيط الجينات المرتبطة تعدد القدرات. تنظيم التعبير الجيني يحدث على مستويات متعددة داخل النواة، بما في ذلك إدخال تعديلات على الحمض النووي والكروماتين للسماح عوامل النسخ، والعناصر التنظيمية DNA، RNA وصول البلمرة لاستهدافالجينات. إعادة تشكيل المشهد جينية عبر تعديلات الكروماتين العالمية عنصرا رئيسيا لإعادة التعبير عن البرنامج الوراثي تعدد القدرات. وهناك تعديل لونين محدد مهم في تنظيم التعبير الجيني هو أستلة من الهستونات خاصة في بقايا يسين، الذي يسمح بالوصول إلى استهداف الجينات من خلال التوتر انخفض لفائف الدنا هيستون. مثبطات HDAC هي عبارة عن جزيئات صغيرة التي ثبت لتعزيز IPSC إعادة برمجة وHESC التجديد الذاتي 9،10، من المحتمل بسبب دعم الدولة الأسيتيل 11. البروتوكول هو موضح أدناه، مقتبسة من منشور مسبق باستخدام lentiviruses دمج 12، يوفر طريقة خطوة بخطوة لتحسين الجيل IPSC من الدم المحيطي باستخدام episomes ومثبطات HDAC. تركيزات مثبط HDAC المستخدمة هنا هي نصف تلك التي وصفها وير، وآخرون. 9، وأدت بشكل روتيني لزيادة بنسبة 2 أضعاف في المستعمرات IPSC إعادة برمجة بالكامل خلال معيارepisomal البروتوكولات دون إعادة برمجة مثبطات HDAC. هذا المستوى من إعادة البرمجة على قدم المساواة مع كفاءة نلاحظ مع أساليب lentiviral. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قد ولدت بكفاءة IPSC من الأفراد قديم 87 سنة من العمر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1100">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:503px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45-001-750</td>
			<td>Store at 4&#176;C. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">DPBS</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-250</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437028</td>
			<td>Store at -20&#176;C until needed. Thaw, aliquot, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">154938</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">QBSF-60 serum-free medium</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-983-234</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td style="width:151px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">VCA-1003</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">2% gelatin solution</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1393</td>
			<td>Store at 4&#176;C, liquify in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Hank&#39;s Balanced Saline Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14175-103</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:329px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12440-061</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">L-glutamine, 200 mM</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td>Aliquot, freeze at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">non-essential amino acids (NEAA), 100X</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140-050</td>
			<td>Store at 4&#176;C, away from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">DMEM/Ham&#39;s F12, 1:1</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30023.02</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td>Aliquot, freeze at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">sodium pyruvate, 100 mM</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">sodium bicarbonate, 7.5%</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25080094</td>
			<td>Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td style="width:151px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PHG0263</td>
			<td>Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20&#176;C. Once thawed, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">sodium butyrate&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B5887-1G</td>
			<td>Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20&#176;C. Once thawed, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</td>
			<td style="width:151px;">Stemgent</td>
			<td style="width:119px;">01-0014-500</td>
			<td>Store at -20&#176;C until needed. Once thawed, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">ESC-qualified BD matrigel</td>
			<td style="width:151px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">35-4277</td>
			<td>Thaw overnight on ice at 4&#176;C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20&#176;C until needed. Thaw at 4&#176;C, use immediately.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">StemSpan SFEM&#160;</td>
			<td style="width:151px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:119px;">9650</td>
			<td>Aliquot, freeze at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">ascorbic acid, powdered</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4403-100MG</td>
			<td>Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">recombinant human stem cell factor (SCF)</td>
			<td style="width:151px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">255-SC-010</td>
			<td>Make 100 &#956;g/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20&#176;C. Once thawed, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">recombinant human interleukin 3 (IL-3)</td>
			<td style="width:151px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">203-IL-010</td>
			<td>Make 100 &#956;g/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20&#176;C. Once thawed, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">erythropoietin (EPO)</td>
			<td style="width:151px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">287-TC-500</td>
			<td>Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20&#176;C. Once thawed, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:329px;">recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)</td>
			<td style="width:151px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">291-G1-200</td>
			<td>Make 100 &#956;g/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20&#176;C. Once thawed, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7522</td>
			<td>Make 1000X stock (100 mM) in DPBS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:151px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902-25MG</td>
			<td>Make 50X stock (50 &#956;M) in DPBS, sterile filter, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">SAHA (vorinostat)</td>
			<td style="width:151px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:119px;">149647-78-9</td>
			<td>Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20&#176;C. Once thawed, store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">12 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:151px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62553002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">6 well tissue culture plate</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">35 mm tisue culture plates</td>
			<td style="width:151px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">10 mL disposable serological pipettes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-675-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">5 mL disposable serological pipettes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-675-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">2 mL disposable serological pipettes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-675-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">20 &#956;L pipette tips, barrier tips</td>
			<td style="width:151px;">Genessee</td>
			<td style="width:119px;">24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">glass Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">pipette aid</td>
			<td style="width:151px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-681-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td>
			<td style="width:151px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">27077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">pCXLE-hSK</td>
			<td style="width:151px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">27078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">pCXLE-hUL</td>
			<td style="width:151px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">27080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">pCXLE-EGFP</td>
			<td style="width:151px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">27082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:329px;">pCXWB-EBNA1</td>
			<td style="width:151px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">37624</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient ips cell generation from blood using episomes and hdac inhibitors

وتوضح هذه المخطوطة بروتوكول لخلق بكفاءة من صنع الإنسان خلايا خالية من التكامل الجذعية المحفزة (iPSCs) من الدم المحيطي باستخدام البلازميدات episomal وdeacetylase هيستون (HDAC) مثبطات. مزايا هذا النهج ما يلي: (1) استخدام كمية ضئيلة من الدم المحيطي كمادة المصدر؛ (2) nonintegrating ناقلات إعادة برمجة. (3) وسيلة فعالة من حيث التكلفة لتوليد iPSCs خالية النواقل؛ (4) وترنسفكأيشن واحد؛ و (5) استخدام جزيئات صغيرة لتسهيل إعادة برمجة جينية. باختصار، يتم عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من عينات الفصد الروتينية ومن ثم تربيتها في عوامل نمو محددة لانتاج الكريات الحمر السكان الخلية السلف التكاثري للغاية وقابلة للبرمجة بشكل ملحوظ. Nonintegrating، البلازميدات episomal nontransmissible معربا عن OCT4، SOX2، KLF4، MYCL، LIN28A، والبروتين p53 دبوس الشعر القصير (SH) RNA هي introduدائرة الهندسة المدنية في الأرومة الحمراء المستمدة عبر nucleofection واحد. Cotransfection من يصبوغ التي تعبر عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) يسمح لسهولة تحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. يضاف البلازميد-تكرار نقص منفصل معربا عن ابشتاين بار مستضد النووي (1 EBNA1) أيضا إلى خليط التفاعل لزيادة التعبير عن البروتينات episomal. ثم يتم مطلي الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على طبقة من الخلايا الليفية الفأر الجنينية المشع (iMEFs) لاستمرار إعادة برمجة. حالما تظهر المستعمرات IPSC تشبه في حوالي اثني عشر يوما بعد nucleofection، يتم إضافة مثبطات HDAC إلى المتوسطة لتسهيل إعادة جينية. وقد وجدنا أن إدراج مثبطات HDAC يزيد بشكل روتيني الجيل المستعمرات IPSC برمجتها بالكامل بنسبة 2 أضعاف. مرة واحدة المستعمرات IPSC المعرض نموذجي الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) التشكل، يتم نقلها برفق لiMEF الفردية المغلفة لوحات زراعة الأنسجة لاستمرار النمو والتوسع.

بعد ثلاثة أيام nucleofection وقبل طلاء الخلايا nucleofected على iMEFs، ينبغي تقدير كفاءة nucleofection ناجحة بواسطة المجهر مضان لEGFP الشكل 1 يبين تجربة نموذجية nucleofection مع ما يقرب من 5-10٪ من مجموع السكان خلية معربا عن EGFP. وسوف تبدأ المستعمرات IPSC ...

Watch this Scientific Journal Video about Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors at JoVE.com

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان من الدم المحيطي باستخدام استراتيجية إعادة برمجة يصبوغ مقرها ومثبطات deacetylase هيستون.

كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

efficient-ips-cell-generation-from-blood-using-episomes-hdac

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center.  نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان من الدم المحيطي باستخدام استراتيجية إعادة برمجة يصبوغ مقرها ومثبطات deacetylase هيستون. 

Video: Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

كوكتيل من الدم والسرطان حدوة الحصان الأميركي ، الليمول Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

جيل وحيدة الخلية معلقات من الأنسجة العصبية ماوس

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

جيل من صنع الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة الدموية المحيطية باستخدام Lentiviral STEMCCA المتجهات

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

بسرعة وكفاءة توليد الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في تنسيق اللوحة Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Critical to the evaluation of potential therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological assessments of muscle function. Because many pre-clinical trials rely on mouse models for these diseases, isolated muscle function has become one of the standards for Go/NoGo decisions in moving drug candidates forward into patients. We will demonstrate the preparation of the extensor digitorum longus (EDL) and diaphragm muscles for functional testing, which are the predominant muscles utilized for these studies. The EDL muscle geometry is ideal for isolated muscle preparations, with two easily accessible tendons, and a small size that can be supported by superfusion in a bath. The diaphragm exhibits profound progressive pathology in dystrophic animals, and can serve as a platform for evaluating many potential therapies countering fibrosis, and promoting myofiber stability. Protocols for routine testing, including isometric and eccentric contractions, will be shown. Isometric force provides assessment of strength, and eccentric contractions help to evaluate sarcolemma stability, which is disrupted in many types of muscular dystrophies. Comparisons of the expected results between muscles from wildtype and dystrophic muscles will also be provided. These measures can complement morphological and biochemical measurements of tissue homeostasis, as well as whole animal assessments of muscle function.

Muscle function measurements contribute to the evaluation of potential therapeutics for muscle pathology, as well as to the determination of mechanisms underlying physiology of this tissue. We will demonstrate the preparation of the extensor digitorum longus and diaphragm muscles for functional testing. Protocols for isometric and eccentric contractions will be shown, as well as differences in results between dystrophic muscles, representing a pathological state, and wildtype muscles.

متساوي القياس وغريب الأطوار التقييم تكوين القوات من عضلات الهيكل العظمي المعزولة من الفئران نماذج من ضمور العضلات

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...