نشكر أعضاء Blaschke، جرونوالد، وتوير مختبرات للحصول على المشورة والمساعدة التقنية. ويدعم هذا العمل من قبل مؤسسة PCMC، المعاهد الوطنية للصحة R01 MH092256 وDP2 MH100008، ومارس من الدايمات مؤسسة منحة بحثية # 1-FY13-425، لJLB.

1. إعداد الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تحلل الحمض النووي: 50 ملي بوكل، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.3، 0.3٪ توين 20، 0.3٪ NP40. إضافة جديدة بروتين K إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل في اليوم من استخدام 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأنسجة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للبالغين كليب زعنفة السمك: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأسماك: ضع السمك في 0.004٪ MS-222 (تريكين) حل. الانتظار حتى يبطئ حركة الخيشومية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع السمك على كومة من 5-10 Kimwipes وقطع قطعة صغيرة من زعنفة الذيل، حوالي 2-3 مم، مع شفرة حلاقة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بسرعة الأسماك في خزان المسمى مع المياه العذبة للانتعاش؛ تسمية بعناية كل من خزان وأنبوب المقابلة التي سوف تحتوي على مقطع الزعنفة. تغيير الماء وإطعام الأسماك كل يوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط مقطع زعنفة مع طرف ماصة معقمة وتحويلها في أنبوب مملوء 100 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل غيض ماصة، وتجاهل شفرة حلاقة في وعاء الحادة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمقطع ذيل الجنين: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة في 0.004٪ MS-222 (تريكين) حل. الانتظار 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة من الذيل مع ملقط تشريح تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الذيل في أنبوب المسمى مليئة 30 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين بسرعة في أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب التسمية مع الأجنة وأنابيب ذيل يناظرها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الأنابيب مع الأجنة في 4 درجات مئوية خلال الليل لتثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف ملقط باستخدام المياه الملة، س وKimwipes بين كل جنين للحد من التلوث. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للأجنة كاملة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة في 0.004٪ MS-222 (تريكين) حل. الانتظار 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة 1-5 في أنبوب مملوء 100 ميكرولتر العازلة تحلل الحمض النووي. Dechorionation ليست ضرورية. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهضم الحمض النووي احتضان الأنابيب مع الأنسجة (زعنفة الذيل أو مقاطع أو الأجنة) في 55 ° Cلمدة 4 ساعة تصل إلى 12 ليلة وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبطال نشاط بروتين K أنابيب الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة 12. وينبغي استخدام الحمض النووي لPCR على الفور، أو تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. </li></ol> 2. PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاشعال تصميم إما يدويا أو عن طريق التمهيدي تصميم البرمجيات (مثل Lightscanner التمهيدي تصميم البرمجيات Biofire). المنتجات PCR لHRMA وعادة ما تكون 50-200 سنة مضت ومنتجات PCR للكشف SNP يجب أن تكون أصغر حجما، وعادة 50-80 سنة مضت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تفاعل PCR في 96 جيدا أو جيدا 384 لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 10 ميكرولتر اجمالى حجم: 4 ميكرولتر مزيج الرئيسي LightScanner (0.1 U الساخنة بدء طق-AB البلمرة، العازلة، 0.2 ملي dNTPs، 2 مم كلوريد المغنيسيوم، و 1X الفلورسنت صبغة ملزمة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل)؛ 5 بمول كل التمهيدي، و1 ميكرولتر قالب الحمض النووي الجيني المستخرجة من زعنفة الذيل الكبار أو 3 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني الذيل الجنينية 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الغطاء مع 30 ميكرولتر الزيوت المعدنية. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحة مع ختم لاصقة شفافة بصريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين PCR الدراجات ظروف نموذجية الشروط هي 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 30 دورات من 10 ثانية في 95 درجة مئوية، 25 ثانية في 60 درجة مئوية، و 30 ثانية في 72 درجة مئوية، وتنتهي مع 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وتبريده ل 15 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر PCR لوحات في 4 درجة مئوية أو متابعة مباشرة إلى HRMA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد المنتج PCR لدينا من خلال تحليل حجمه باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام الأولي من خلال التحسين PCR، وإذا أشار، من خلال التسلسل للمنتج PCR. </li></ol></li></ol> 3. HRMA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات الحرارة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في نظام تحليل تذوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج (LightScanner البرامج اتصل-IT 2.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات الحرارة 60-95 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء ملف تخزين البيانات الجديدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات HRMA (الشكل 2). خطوات متعددة للتحليل ممكنة. نعرض مجموعة الأكثر استخداما من البيانات مanipulations. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد فرعية انقر فوق علامة التبويب مجموعة فرعية. حدد الآبار مع العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد علامة التبويب تطبيع في اللوحة اليمنى. للقضاء على التباين مضان، ضع يدويا خط مزدوج موازية في مرحلة ما قبل (الأولي) ومناطق ما بعد (النهائي) تذوب كما هو موضح (الشكل 2C، النصال) وتطبيع premelt ومضان بعد ذوبان الإشارات من جميع العينات إلى 1 و 0 ، على التوالي 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط المواقع من خطوط بحيث المنطقة تذوب في المنطقة بين قبل وبعد ذوبان خطوط، ولكن لم يتم تحديد. بشكل عام، والحد الأدنى والحد الأقصى السفلى السفلى (وأعالي الحد الأدنى والأعلى ماكس) يجب وضع خطوط درجة الحرارة حوالي 1 درجة مئوية عن بعضها البعض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار المناصب درجة الحرارة لتطبيع مثل أن جميع العينات يكون الحد الأقصى أو كاملة (100٪) مضان للمنطقة premelt والحد الأدنى أو لا (0٪) مضان للمنطقة بعد ذوبان (بأفضل ما نقاط البيعإيصال خدمات الإيداع). التطبيع يجب أن يؤدي في خط شبه أفقي في مضان أقصى 1 الذي يمتد حتى تذوب نقطة ثم خط أفقي بالقرب من نقطة ذوبان في الحد الأدنى من مضان 0؛ لا ينبغي أن يكون هناك مستويات مضان (1) أعلاه أو أدناه 0 . على سبيل المثال، في الشكل 2C، وتطبيع منحنيات premelting باستخدام تتراوح درجة الحرارة من 79-80 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع / تجميع تمييز الأنماط الجينية على أساس درجة حرارة انصهارها (الشكل 2C، المربع الأخضر). حدد التجمع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد Autogroup من القائمة اختيار المعايير تحت قسم التجمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عادي أو مرتفع للذوبان الشخصية مع التحولات واحدة أو متعددة التحولات على التوالي من قائمة اختيار حساسية تحت قسم التجمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد حسابمجموعات تحت قسم التجمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى القائمة ملف وانقر فوق حفظ لحفظ النتائج. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>Sander, J. D., Cade, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+gene+targeting+in+zebrafish+using+customized+TALENs.">Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).</li><li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+(HRMA):+more+than+just+sequence+variant+screening.">High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening.</a> Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).</li><li>Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome.">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), (2012).</li><li>Liew, M., Pryor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+of+single-nucleotide+polymorphisms+by+high-resolution+melting+of+small+amplicons.">Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons.</a> Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).</li><li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping:+cross-platform+comparison+of+instruments+and+dyes.">V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes.</a> Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).</li><li>Carrillo, J., Mart&#237;nez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+analysis+for+the+identification+of+novel+mutations+in+DKC1+and+TERT+genes+in+patients+with+dyskeratosis+congenita.">High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita.</a> Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).</li><li>Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melt+analysis+(HRMA);+a+viable+alternative+to+agarose+gel+electrophoresis+for+mouse+genotyping.">High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping.</a> PloS one. 7 (9), (2012).</li><li>Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIK3CA+hotspot+mutation+scanning+by+a+novel+and+highly+sensitive+high-resolution+small+amplicon+melting+analysis+method.">PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method.</a> J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants.">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li><li>Xing, L., Hoshijima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+foxP2+zinc+finger+nuclease+mutant+has+normal+axon+pathfinding.">Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding.</a> PloS one. 7 (8), (2012).</li><li>Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+High+Resolution+Melting+analysis+as+an+alternate+tool+to+screen+for+risk+alleles+associated+with+small+kidneys+in+Indian+newborns.">Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns.</a> BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).</li><li>Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+Expanded+instrument+comparison+of+amplicon+DNA+melting+analysis+for+mutation+scanning+and+genotyping.">V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping.</a> Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).</li><li>Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Genotyping+by+Amplicon+Melting+Analysis+Using+LCGreen.">High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen.</a> Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).</li><li>Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+closed-tube+methylation-sensitive+high+resolution+melting+assay+(MS-HRMA)+for+the+semi-quantitative+determination+of+CST6+promoter+methylation+in+clinical+samples.">A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples.</a> BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).</li><li>Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+two+broad-range+PCR+assays+for+pathogen+detection+in+positive-blood-culture+bottles:+PCR-high-resolution+melting+analysis+versus+PCR-mass+spectrometry.">Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry.</a> J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

PCR جنبا إلى جنب مع HRMA هي تقنية قوية لالتنميط الجيني الزرد. مزايا هذا النهج هي سرعته، متانة، وحساسية للكشف عن الطفرات حتى النقطة. بروتوكول بأكمله، من زعنفة كليب التحليل لتذوب منحنى، لا يمكن أن يؤديها في أقل من ثماني ساعات من قبل فرد واحد. بالإضافة إلى ذلك، والتقنية هي ق?...

الزرد (دانيو rerio) هو نظام نموذجي الفقارية المستخدمة على نطاق واسع لدراسات التنمية والنمذجة المرض. مؤخرا، تم تطوير العديد من التقنيات المعدلة وراثيا وتحور لالزرد. تقنيات نقل الجينات السريع، وعادة ما يعتمد على نظام ينقول Tol2 1، وقد تم جنبا إلى جنب مع تحسين خيارات متعددة لاستنساخ الحمض النووي التجمع جزء 2. وقد استخدمت nucleases الزنك الاصبع (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs) لاستهداف مواضع في كل من الخلايا الجسمية وسلالة الجرثومية في الزرد 3،4. ويمكن لهذه التقنيات بكفاءة توليد الحيوانات المعدلة وراثيا، مع خلق طفرة عالية التردد، ونقل خط الجرثومية 3،4. على الرغم من هذه التطورات، وتقنيات التنميط التقليدي في الزرد لحد من القوة الكاملة للالطفرات ونقل الجينات الأدوات. يتبع PCR بواسطة الكهربائي للهلام، جنبا إلى جنب في بعض الأحيان مع restrictioن انزيم الهضم، ويستخدم على نطاق واسع للكشف عن تعديل الجينوم، ولكن هو مضيعة للوقت وأقل حساسية لتحديد الإدراج أو الحذف صغيرة. المقايسات TaqMan التحقيق ديك التكاليف الأولية عالية وتتطلب حذرا الأمثل. تسلسل المنتجات PCR يمكن أن يستغرق عدة أيام وليس عملية لفحص واسعة النطاق. تقييد جزء طول تعدد الأشكال (RFLP) التحليل يمكن أن تميز فقط تعدد الأشكال التي تؤثر على مجموعة محدودة من المواقع الاعتراف انزيم التقييد. تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA)، مغلقة أنبوب آخر-PCR تحليل الأسلوب، هو طريقة تم تطويرها مؤخرا أن يكون سريعا وحساسة، وغير مكلفة، وقابلة للفحص عدد كبير من العينات. HRMA يمكن استخدامها للكشف عن تعدد الأشكال، والطفرات، والجينات المحورة 5-7. ويستند HRMA على تمسخ الحرارية للسلطات الوطنية المعينة المزدوج تقطعت بهم السبل، ولكل AMPLICON PCR لديه تفارق فريد (تذوب) مميزة 5. عينات يمكن تمييز بسبب رس بهم تكوين مختلف النوكليوتيدات، والمحتوى GC، أو طول، وعادة في تركيبة مع صبغة الفلورسنت التي تربط فقط المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي 8. وبالتالي، يمكن التمييز بين الأنماط الجينية HRMA المختلفة استنادا إلى خصائص مختلفة تذوب منحنى. لأن HRMA يستخدم الكواشف منخفضة التكلفة ويبعد خطوة واحدة بعد PCR العملية، فإنه يمكن استخدامها لاستراتيجيات عالية الإنتاجية. HRMA هو غير تدميري، لذلك بعد تحليل يمكن استخدام amplicons PCR لتطبيقات أخرى. وقد تم تطبيق HRMA في العديد من الكائنات الحية والنظم، بما في ذلك خطوط الخلايا والفئران والبشر 9-11. وقد تم مؤخرا وصفت استخدامه في الزرد للكشف عن الطفرات المستحثة بواسطة nucleases إصبع الزنك (ZFNs) وTALENs 6،12،13. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية تنفيذ HRMA PCR القائم في الزرد الجنينية والكبار (الشكل 1). هذا البروتوكول هو مناسبة للكشف عن تعدد الأشكال، الجينات المحورة، والطفرات، بما في ذلك الاشتراكيةngle التغييرات قاعدة الزوج، والإدراج، أو حذف.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">100 Reaction LightScanner Master Mix</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;">HRLS-ASY-0002</td>
			<td style="width:157px;">www.biofiredx.com</td>
			<td style="width:167px;">Store at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:141px;">HSP9665</td>
			<td>www.bio-rad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Microseal &#39;B&#39; Adhesive Seals</td>
			<td style="width:145px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:141px;">MSB1001</td>
			<td>www.bio-rad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">96-Well LightScanner Instrument</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;">LSCN-ASY-0040</td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">LightScanner Software with Call-IT 2.0</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">High-Resolution Melting Analysis 2.0</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:232px;">LightScanner Primer Design Software</td>
			<td style="width:145px;">BioFire</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.biofiredx.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Vector NTI Software</td>
			<td style="width:145px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>www.invitrogen.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tricaine</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient zebrafish genotyping using pcr with high-resolution melt analysis

الزرد هو نظام نموذجي الفقاريات قوية لدراسة التنمية، والنمذجة المرض، وإجراء فحص المخدرات. وقد تم مؤخرا عرض مجموعة متنوعة من الأدوات الجينية، بما في ذلك استراتيجيات متعددة لإحداث طفرات وتوليد خطوط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، وفحص واسعة النطاق محدودة بسبب أساليب التنميط الجيني التقليدية، والتي هي مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. نحن هنا وصف تقنية لتحليل الأنماط الجينية الزرد بواسطة PCR جنبا إلى جنب مع تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA). هذا النهج هو سريعة وحساسة، وغير مكلفة، مع خطر أقل من التحف التلوث. التنميط الجيني بواسطة PCR مع HRMA يمكن استخدامها لأجنة الأسماك أو الكبار، بما في ذلك بروتوكولات الفرز الفائق الإنتاجية.

بروتوكول لا يمكن أن يؤديها خلال يوم واحد أو فصل في خطوات على مدى عدة أيام (ويظهر الرسم البياني تدفق العمل في الشكل 1). ويتبع استخراج الحمض النووي من قبل ذوبان وتحليل amplicons PCR. درجات الحرارة للذوبان من AMPLICON تعتمد على حجم وGC-المحتوى، ولكن عموما تبدأ درجات الحرارة ...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis at JoVE.com

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

ويتجلى PCR جنبا إلى جنب مع تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) كوسيلة سريعة وفعالة إلى التركيب الوراثي الزرد.

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

rapid-efficient-zebrafish-genotyping-using-pcr-with-high-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

22.1K Views.  University of Utah School of Medicine.  ويتجلى PCR جنبا إلى جنب مع تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) كوسيلة سريعة وفعالة إلى التركيب الوراثي الزرد. 

Video: Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Rapid PCR Thermocycling using Microscale Thermal Convection

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable concentration level. But the design of conventional PCR thermocycling hardware, predominantly based on massive metal heating blocks whose temperature is regulated by thermoelectric heaters, severely limits the achievable reaction speed1. Considerable electrical power is also required to repeatedly heat and cool the reagent mixture, limiting the ability to deploy these instruments in a portable format.
Thermal convection has emerged as a promising alternative thermocycling approach that has the potential to overcome these limitations2-9. Convective flows are an everyday occurrence in a diverse array of settings ranging from the Earth's atmosphere, oceans, and interior, to decorative and colorful lava lamps. Fluid motion is initiated in the same way in each case: a buoyancy driven instability arises when a confined volume of fluid is subjected to a spatial temperature gradient. These same phenomena offer an attractive way to perform PCR thermocycling. By applying a static temperature gradient across an appropriately designed reactor geometry, a continuous circulatory flow can be established that will repeatedly transport PCR reagents through temperature zones associated with the denaturing, annealing, and extension stages of the reaction (Figure 1). Thermocycling can therefore be actuated in a pseudo-isothermal manner by simply holding two opposing surfaces at fixed temperatures, completely eliminating the need to repeatedly heat and cool the instrument.
One of the main challenges facing design of convective thermocyclers is the need to precisely control the spatial velocity and temperature distributions within the reactor to ensure that the reagents sequentially occupy the correct temperature zones for a sufficient period of time10,11. Here we describe results of our efforts to probe the full 3-D velocity and temperature distributions in microscale convective thermocyclers12. Unexpectedly, we have discovered a subset of complex flow trajectories that are highly favorable for PCR due to a synergistic combination of (1) continuous exchange among flow paths that provides an enhanced opportunity for reagents to sample the full range of optimal temperature profiles, and (2) increased time spent within the extension temperature zone the rate limiting step of PCR. Extremely rapid DNA amplification times (under 10 min) are achievable in reactors designed to generate these flows.

We describe a novel method to perform DNA replication via the polymerase chain reaction (PCR). Thermal convection is harnessed to continuously shuttle reagents between denaturing, annealing, and extension conditions by maintaining opposing surfaces of the reactor at constant temperature. This inherently simple design promises to make rapid PCR more accessible.

PCR Thermocycling السريع باستخدام الحراري الحرارية الميكروسكيل

Many molecular biology assays depend in some way on the polymerase chain reaction (PCR) to amplify an initially dilute target DNA sample to a detectable ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

والطريقة انماط PCR القائم على التمييز بين الأنواع البرية من نوع والزينة لل Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

باستخدام التصوير المقطعي عالي الدقة لتصور البنية الثلاثية وظيفة الأوعية الدموية النباتية

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

ارتفاع القرار جبل بأكمله<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين داخل الأجنة الزرد لدراسة التعبير الجيني وظيفة

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...