وأيد هذا العمل من جانب صناديق من جمعية القلب الأمريكية (AM)، وزارة الدفاع الأمريكية (BC074986)، ومستشفى كلية زمالة التطوير الوظيفي بوسطن للطفولة (TM، AM). الكتاب أشكر أماندا جيانغ جيانغ واليزابيث للحصول على المساعدة الفنية.

ملاحظة: تم تنفيذ في الجسم الحي دراسة أجريت على الحيوانات وفقا صارم مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وجرى استعراض البروتوكول والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام مستشفى بوسطن للأطفال (أرقام البروتوكول: 13-10-2526R، 14-02-2568R). جميع الأدوية المستخدمة في هذا البروتوكول هي الصف الصيدلانية وأعدت هذه الأدوية تحت ظروف معقمة. 1. إعداد الليفين جل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير هلام الليفين الذي يحتوي VEGF وbFGF. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول الأسهم ذوبان الجليد من الفيبرينوجين والثرومبين التي يتم تخزينها في -80 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الثرومبين (تركيز النهائي: 2.5 U / مل)، CaCl 2 (تركيز النهائي: 45 مم)، VEGF (تركيز النهائي: 0-100 نانوغرام / مل)، وbFGF (تركيز النهائي: 0-100 نانوغرام / مل) إلى الفيبرينوجين الحل (تركيز النهائي: 12.5 ملغ / مل في 0.9٪ sodiuم محلول كلوريد 43-45) في أنبوب 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من قبل pipetting بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بلطف 200 ميكرولتر من الخليط على طبق بلاستيكية معقمة بطريقة الإفلات من الحكمة استخدام P200 ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان قطرات عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة حتى يصلب. ملاحظة: يمكن الاحتفاظ هلام طدت في طبق من البلاستيك مختوم في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لعدة ساعات قبل الزرع (الشكل 1A). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم هلام الليفين إلى حوالي 3 × 3 × 3 مم باستخدام مكعبات مقص جراحي صغيرة قبل الزرع. </li></ol> 2. إعداد ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس الكبار (8-12 أسابيع) من قبل داخل الصفاق (IP) حقن الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) وتأكيد أن الفأر هو تخدير بشكل كاف عن طريق معسر إصبع القدم من الفأرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البيطري مرهم على العينين من الماوس لمنع جفاف أثناء التجربة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلاقة فوص على الجانب الأيسر من القفص الصدري من الفأرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التنبيب داخل الرغامى من الفأرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على التنبيب يقف الزاوية عند 70 درجة وعقد الماوس في المكان التي ربط القواطع العلوية على الشريط المطاطي صغيرة تقع في الجزء العلوي من هذا الموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع بلطف اللسان لجانب واحد باستخدام ملقط حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الحنجرة بمساعدة المجهر معقوفة إضاءة الألياف الضوئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج القصبة الهوائية قسطرة مرنة (21 G) في القصبة الهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الماوس يتنفس من تلقاء أنفسهم بطريقة سلسة (العادية 100-150 الأنفاس / دقيقة، لا تنفس متناقض أو الضحلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس في موقف المعرضة تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكانيكيا تهوية الماوس باستخدام جهاز التنفس الصناعي القوارض (150 الأنفاس / دقيقة و 7 مل / كغ حجم المد والجزر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الأضلاع لتحديد مساحة وربي بين ال 4 و 5 ال الصدري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء حقل معقمة على المنطقة بذ محو بدقة أسفل مع الكحول وبوفيدون اليود. تغطية الجراحي الميداني على نحو كاف مع ثنى الجراحية المعقمة. </li></ol> 3. جراحة ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن المحلي من 0.25٪ بوبيفاكايين (200 ميكرولتر) في الجلد، وجعل شق الجلد عرضية (حوالي 1 سم طول) عبر الفضاء وربي باستخدام مقص تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن 0.25٪ بوبيفاكايين (200 ميكرولتر) في العضلات الوربية، وجعل شق العضلات بين ال 4 و 5 عشر ضلع باستخدام مقص صغير غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ضام تشريح بين الأضلاع لتصور كامل الرئة اليسرى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط منطقة صغيرة (1 × 1 مم مربع) من غشاء الجنب الحشوية من مركز الرئة اليسرى باستخدام ملقط غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق ضغط لطيف على المنطقة باستخدام قطعة من القطن المعقمة حتى يتم التحكم تماما نزيف وتسرب الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع كمية صغيرة من خليط جديد من الفيبرينوجين / الثرومبين (الليفين الغراء) (الخطوة 1.1.2 20 &amp; #181؛ ل) على المنطقة باستخدام P200 ماصة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف واحدة هلام الليفين (الخطوة 1.2) باستخدام ملقط صغير فوق المنطقة (الشكل 1B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد أن الجل هو ثابت بشكل جيد على المنطقة خلال الحركات التنفسية في الرئة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن هناك لا تسرب الهواء هائل ولا نزيف من الرئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شقوق وثيقة (العضلات وطبقات الجلد) مع خياطة للامتصاص، والتي لا بد من إزالتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح التجويف الصدري باستخدام إبرة 27 G و 1 مل حقنة لمنع استرواح الصدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء التهوية الميكانيكية. </li></ol> 4. ماوس الانتعاش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الماوس يتنفس من تلقاء أنفسهم بطريقة سلسة (100-150 الأنفاس العادية / دقيقة، لا تنفس متناقض أو الضحلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IP حقن 1 مل من قبل تحسنت بنسبة 0.9٪ كلوريد الصوديوم لمنع الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الماوس لاستعادة على تعميم سادة المياه الدافئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة endotracheآل أنبوب بعد التأكد من أن الفأر لديه مستقر التنفس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن ميلوكسيكام (5 ملغ / كغ، والحقن تحت الجلد (SC)، لمدة 3 أيام كما مسكن بعد العملية الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد تحركات الماوس بعناية في ما لا يقل عن 15 دقيقة فترات حتى يتم القصية (قادرة على لفة على المعدة، وتبقى في وضع مستقيم) واعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الشفاء، والعودة الماوس إلى قفص جديد المعزولة من الفئران من دون جراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد موقع الجراحية لعلامات العدوى (احمرار، تورم والتفريغ)، وظائف البيولوجية الأساسية الحيوان (الغذاء والماء المدخول، والتبول، التبرز، الزيادة في وزن الجسم)، وكذلك العلامات السريرية الشدة (انتصاب الشعر، وانخفاض تنقل) يوميا بعد إجراء العمليات الجراحية. </li></ol> 5. حصاد الرئة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 7 إلى 30 يوما الزرع، الموت ببطء الماوس باستخدام CO 2 عبر مصدر للغاز المضغوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق بين غيض من عملية سيفي الشكل والقصيةالشق (القص متوسط) والحصاد الرئة كاملة مع هلام المزروع للتحليل النسيجي والبيوكيميائية عن طريق قطع القصبة الهوائية وتشريح كافة الاتصالات إلى القلب والرئتين والقصبة الهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح هلام المزروع مع الرئة مع 4٪ محلول بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، تضمين في أكتوبر المجمع، واتخاذ خطوة أقسام المسلسل من 30 ميكرون سمك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء النسيجية (الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ) والتحاليل المناعية (علامة البطانية: CD31، علامة الظهارية: aquaporin (AQP) 5 والسطحي البروتين (SP) -B) باستخدام متحد البؤر المجهر 22،37،40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع أكوام من المقاطع البصرية (30 ميكرون سميكة) لتشكيل صور ثلاثية الأبعاد للالبطانية الرئة والخلايا الظهارية باستخدام صورة 3D تحليل البرمجيات 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المناطق المتوقع من الأوعية الدموية التي شكلت حديثا باستخدام صورة برامج التحليل 46. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

يقدم هذا المقال طريقة جديدة لزرع المواد الحيوية على سطح الرئة المعيشة الماوس الكبار. مع هذا النظام، ولخص الأوعية الدموية المستمدة الرئة في استضافة بنجاح داخل المادة. هذا النظام يسمح للباحثين لاستكشاف الحديث المتبادل بين الخلايا البطانية، وخلايا أخرى (على سبيل ال?...

ويتمثل الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم طريقة لزرع هلام الليفين على سطح الرئة من الماوس الكبار، والذي يسمح للباحثين لتوصيف الآليات الجزيئية من الأوعية الدموية في الرئة والتنمية السنخية، وللاستفادة من هذه المعرفة من أجل تطوير مواد قادرة بيوميمتيك من تلخص الفسيولوجية الأوعية الدموية في الرئة وتشكيل السنخية لعلاج أمراض الرئة المختلفة. أكثر من 35 مليون أميركي يعانون من أمراض الرئة المزمنة بما فيها مرض الانسداد الرئوي المزمن والتليف الرئوي. هذه المرضى الذين لديهم طويلة الأمد أعراض تنفسية مزمنة مثل ضيق في التنفس، وضيق الصدر، والسعال المزعجة، والتعب، التي تعوق بشكل كبير الحياة اليومية 1-3. وعلى الرغم من كمية كبيرة من الجهد لتطوير علاجات فعالة لهذه الأمراض الرئة، وحاليا لا يوجد علاج. وبالتالي، ونوعية الحياة لهؤلاء المرضى والفقراء والاقتصادية والتكاليف البشرية ومرحباGH 4-7. حاليا، زرع الرئة هو السبيل الوحيد لإنقاذ المرضى الذين يعانون من أمراض الرئة المزمنة في نهاية المرحلة. ومع ذلك، بسبب نقص المتبرعين زرع، وارتفاع تكلفة، ومضاعفات خطيرة، وانخفاض معدل البقاء على قيد الحياة 8-11، زرع ليس النهج الأمثل. وقد مكن التقدم السريع الذي حدث مؤخرا في تقنيات هندسة الأنسجة الباحثون إلى مهندس بيولوجي الرئة التي تزرع في الجسم عن طريق إعادة إسكانها الرئة كلها decellularized مع أنواع مختلفة من الخلايا الاصلية أو الجذعية المحفزة (آي بي إس) خلايا 12،13. ومع ذلك، فإن هذه الرئتين الهندسة البيولوجية وظيفية في الحيوانات المضيفة فقط لعدة ساعات بعد زرع 12،14،15. استخدام المواد الحيوية لتجديد الهياكل وظائف معقدة من الرئتين كما تم ناجحة إلى حد ما. قد يكون هذا بسبب العمليات البيولوجية الرئيسية التي تحكم الكبار تجديد الرئة لم تستكشف جيدا. في الرئة، وتشكيل نظام الأوعية الدموية هي واحدة من أقدم وأهم الأحداث الدوريتطوير نانوغرام وتجديد 16-21. شكلت حديثا vasculatures في الرئة يتم تسليم سوى الأكسجين والمغذيات ومكونات الخلية المختلفة اللازمة لتشكيل الجهاز، ولكن أيضا توفير إشارات التنظيمية مفيدة للخلايا المحيطة 22-25. وهكذا، الأوعية الدموية يلعب الأدوار الرئيسية في alveolarization التجدد في الرئتين الكبار 24،26،27. وبالإضافة إلى ذلك، يساهم الأوعية الدموية حررت لأمراض الرئة المزمنة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) 28، وخلل التنسج القصبي الرئوي (برميل يوميا) 21-23، والتليف الرئوي 29. وهكذا، لوضع استراتيجيات أكثر فعالية لهندسة الرئتين أو علاج أمراض الرئة المزمنة، فمن الضروري لفهم الآليات الأساسية لتكوين الأوعية الدموية في الرئة محددة. يعرض كل جهاز الخواص الميكانيكية والكيميائية فريدة من نوعها، والتي قد تختلف بين الظروف الفسيولوجية والمرضية 30-33. هذه microenviron جهاز محددالإدلاء بالبيانات تنظم السلوكيات خلية البطانية والانسجام في تشكيل شبكة الأوعية الدموية في الجهاز بطريقة محددة 24،34-36. وهكذا، لوضع استراتيجيات أكثر كفاءة لتجديد الرئة، والآلية الكامنة وراء تكوين الأوعية الدموية في الرئة محددة يجب أن يكون مفهوما. بينما التقليدية في الجسم الحي المقايسات الأوعية الدموية تحت الجلد مثل هيدروجيل غرس وقد استخدمت على نطاق واسع للأبحاث الأوعية الدموية 37-39، وتلك الأساليب لا ألخص الأوعية الدموية جهاز معين. مؤخرا، تم تطوير طريقة رواية لزرع Matrigel في قالب مرن على الرئة الماوس وأظهرت لتجنيد بنجاح الأوعية الدموية والخلايا الظهارية الرئة في المواد الهلامية 22. وهذا النهج الفريد تسمح للباحثين لاستكشاف آلية تكوين الأوعية الدموية في الرئة محددة وكذلك التفاعلات بين الأوعية الدموية وخلايا الرئة غير الوعائية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. منذ 1) Matrigel ليست مناسبة للالتطبيق السريري. 2) هالعفن lastic المستخدمة للادلاء الجل قد تؤثر على التفاعلات بين الهلاميات المائية وأنسجة الرئة المضيفة و3) قالب مرن على الرئة يحتمل أن يسبب ضعف وظيفة الرئة وألم أثناء التنفس، كنهج ذات الصلة أكثر سريريا، والفيبرين مصفوفة 3D التي تحتوي على العوامل المولدة للأوعية (عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) / الأساسية عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF)) تم زرعها على الرئة الماوس دون الصب في قالب مرن، وقد لخص بنجاح المضيف المستمدة الرئة الأوعية الدموية. هلام الليفين، الألياف البوليمر المتولدة من-المشقوق ثرومبين الفيبرينوجين، ومن المعروف إلى اعتراض مجموعة متنوعة من العوامل عائية مثل bFGF وVEGF لتسريع تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي 40،41. بسبب قدرته على التجدد والطبيعة القابلة للتحلل 42، ويستخدم على نطاق واسع جل الليفين في مجال هندسة الأنسجة. يقدم هذا المقال رواية ونهجا فريدا لزرع هلام الليفين على سطح الرئة من أدول الذين يعيشونيوضح ر الماوس والتي تستضيف المستمدة الرئة الأوعية الدموية وتلخيصها داخل المواد الهلامية في الجسم الحي. هذه الطريقة، والتي تمكن الباحثين لدراسة الأوعية الدموية في الرئة محددة، من المرجح أن يؤدي إلى تطوير طرق علاجية جديدة لأنواع مختلفة من أمراض الرئة ودفع كثيرا من جهود لتجديد الرئة الكبار بنجاح.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:289px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fibrinogen from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4883</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9549</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse VEGF 164</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>493-MV</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3139-FB</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:177px;">Braintree Scientific INC</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fiber-Optic Light Source</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-35</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20G Elastic catheter</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4251652-02</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">MiniVent Ventilator</td>
			<td style="width:177px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">CGS-8009</td>
			<td>For ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Stemi DV4 Steromicroscope</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-070-515</td>
			<td>For surgey</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Absobable suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>PDP304</td>
			<td>Surgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">553370</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against AQP5</td>
			<td style="width:177px;">Abcam</td>
			<td>AB78486</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against SP-B</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td>AB40876</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

جعلت تقدما كبيرا مؤخرا في تقنيات أبحاث الخلايا الجذعية والهندسة الحيوية تقدما كبيرا في استخدام المواد الحيوية لتجديد وإصلاح الأضرار في أنسجة بسيطة في مجالات تقويم العظام واللثة. ومع ذلك، فإن محاولات لتجديد هياكل ومهام أكثر تعقيدا ثلاثية الأبعاد (3D) أجهزة مثل الرئتين لم تكن ناجحة جدا لأن العمليات البيولوجية للتجديد الجهاز لم يتم استكشافها بشكل جيد. لقد أصبح من الواضح أن الأوعية الدموية، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة، ويلعب دورا رئيسيا في تجديد الجهاز. شكلت حديثا vasculatures تقديم ليس فقط الأكسجين والمغذيات ومكونات الخلية المختلفة المطلوبة لتجديد الجهاز ولكن أيضا توفير إشارات مفيدة إلى الأنسجة المحلية تجديد. لذلك، لتجديد الرئتين في البالغين بنجاح، فمن الضروري أن ألخص في microenvironments الرئة المحددة التي الأوعية الدموية محركات تجديد أنسجة الرئة المحلية. وإن كانت المشاركةnventional في الجسم الحي المقايسات الأوعية الدموية، مثل زرع تحت الجلد من المصفوفة خارج الخلية (ECM) الغنية الهلاميات المائية (على سبيل المثال، الفيبرين أو الكولاجين والمواد الهلامية أو Matrigel - خليط من البروتين ECM يفرز من قبل خلايا Engelbreth-هولم-سرب الماوس ساركوما)، وتستخدم على نطاق واسع لاستكشاف الآليات العامة من الأوعية الدموية، الأوعية الدموية في الرئة محددة لم تميزت جيدا لأن طرق لزرع مثلي من المواد الحيوية في الرئة لم راسخة. والهدف من هذا البروتوكول هو إدخال طريقة فريدة من نوعها لزرع هلام الليفين على سطح الرئة المعيشة الماوس الكبار، والسماح لخلاصة الناجح لاستضافة المستمدة الرئة الأوعية الدموية داخل الجل. هذا النهج يمكن الباحثين لاستكشاف الآليات التي المكروية الرئة محددة تسيطر الأوعية الدموية وتجديد السنخية في كل الظروف العادية والمرضية. ومنذ إطلاق المواد الحيوية مزروع وتوريد إشارات الفيزيائية والكيميائية إلى l المجاورالأنسجة اونغ، زرع هذه المواد الحيوية على الرئة المريضة يمكن أن يحتمل تطبيع الأنسجة المريضة المجاورة، وتمكين الباحثين لتطوير مناهج علاجية جديدة لأنواع مختلفة من أمراض الرئة.

لفحص ما إذا كان لخص المضيف المستمدة الرئة تشكيل الأوعية الدموية داخل الحيوية وزرع على الرئة، والمواد الهلامية الليفين تستكمل مع رئيسي عائية العوامل VEGF وbFGF (0، 10 و 100 نانوغرام / مل لكل منهما) تم زرعها على سطح يعيشون الرئتين الماوس كما وذكرت باستخدام Matrigel 22. ملفقة ا...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis at JoVE.com

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

زرع الليفين جل في الرئة ماوس لدراسة الأوعية الدموية الرئة محددة

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Views.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

Video: Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

نموذج الفأر من القرنية الفحص جيب للدراسة الأوعية الدموية

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit&#039;s Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

علاج الإصابات العظمية الغضروفية في مفصل الركبة الأرنب عن طريق زرع خيفي الخلايا الجذعية الوسيطة في الجلطات الليفين

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

الأوعية الدموية في الرئة الجرذ الدماغية

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

طريقة بسيطة لتركيب الانبوبة الرئة ماوس

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

موسع داخل الرغامى التنبيب لدراسة علم الأمراض وعلم وظائف الأعضاء من الرئة ماوس

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

شبكية العين مفرزة النموذجي في القوارض بواسطة حقن تحت الشبكية من هيالورونات الصوديوم

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

بوساطة التنبيب داخل الرغامى (IMIT) تقطير: وموسع والرئة محدد نظام تسليم

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

الماوس استئصال الرئة نموذج النمو الرئة التعويضي

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

ورم الابتدائي وMEF عزل الخلايا لدراسة الرئة الانبثاث

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

إنشاء طعم أجنبي نموذج المايلوما المتعددة الإنسان في الدجاج لدراسة نمو الورم والغزو والأوعية الدموية

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...