وأيد هذا العمل من قبل جامعة بازل، قسم الطب الحيوي، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_141007). قدم ماركوس Saxer الدعم التقني.

وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا للتوجيهات مجلس الجماعات الأوروبية في 22 سبتمبر 2010 (2010/63 / الاتحاد الأوروبي) وجرى استعراض ويسمح به السلطات السويسرية. 1. إعداد الثقافات شريحة عضوي النمط Entorhino-الحصين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد-entorhino الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط (EHOSCs) من الجراء بعد الولادة يوم 4 (P4) الماوس باستخدام طريقة الحضانة ثابت 4،11. هنا، استخدم C57BL6 وCB6F1 الفئران. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ حوالي 30 دقيقة لكل الماوس الجرو لإعداد الثقافات شريحة، أي 3 ساعة لالقمامة من 6 الجراء الماوس. تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحي طاولة العمل مع الأدوات الجراحية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تجنب أي تداخل محتمل من موقف شريحة على طول المحور septo الزمني، استخدم فقط الحصين شرائح من النصف الحاجز. إذا لم ينص على خلاف ذلك، تنفيذ جميع الخطوات في RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رانه رأس الجرو P4 الفأر مع مقص جراحي. لا يلزم التخدير لهذه الخطوة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجمجمة حول الدماغ وتحديد فجوة بين نهاية الذيلية من نصفي الكرة المخية والمخ الأوسط. إزالة بعناية من جانب منقاري الدماغ إلى الدماغ المتوسط ​​من الجمجمة ووضعه في الجليد الباردة المتوسطة إعداد تتألف من MEM تستكمل مع شكل استقرت من L-الجلوتامين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة تشريح تحت stereomicroscope مع الدماغ يجري مغمورة في الجليد المتوسطة إعداد البارد. إزالة السحايا المتبقية من نصفي الكرة الأرضية القشرية. تحديد الحصين على سطح الذيلية وسطي من نصف الكرة وفصلها مع القشرة المخية الأنفية الداخلية المجاورة عن بقية الدماغ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة إلى المروحية الأنسجة وقطع 400 ميكرون شرائح سميكة تحت ظروف معقمة مستعرضة إلى المحور septo الزمني للالحصين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شرائح على مإدراج الثقافة ليرة لبنانية (حوالي 6 شرائح لكل إدراج)، واحتضان لهم في 6 لوحات جيدة مع 1 مل لكل بئر من الحضانة المتوسطة (47 مل MEM، 25 مل النسر متوسطة، 25 مل مصل الحصان، 1 مل glutamax I، 1 مل من معقم حل 10٪ الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.3) في جو مرطب مع CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة في اليوم التالي وبعد ذلك كل يوم ما يصل إلى 1 في الاسبوع الآخرين. </li></ol> 2. في المختبر نقص الأكسجة والأوكسجين الجلوكوز الحرمان مع إعادة إشباع الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انظر الجدول رقم 1 لجدول زمني دقيق لهذا الإجراء. EHOSCs الثقافة لمدة 5 أيام (DIV5) قبل التعرض لنقص الأكسجين أو OGD. عند هذه النقطة وقت تبديل المتوسطة من الحضانة المتوسطة التي تحتوي على 25٪ مصل الحصان إلى المتوسطة المصل الحرة مع التشكيل التالي: Neurobasal متوسطة مع 2٪ ملحق B27، 1٪ glutamax والإضافي الجلوكوز بنسبة 0.1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة OGD كما هو مفصل في مرجع 7. وتركيزات النهائية من المكونات سوف تكون على النحو التالي: 0.3مم CaCl 2، 70 مم كلوريد الصوديوم، 5.25 مم 3 NaHCO، 70 ملي بوكل، 1.25 ملم ناه 2 ص 4، 2 مم MgSO 4، و 10 ملي السكروز في درجة الحموضة 6.8. إضافة 1 مل من OGD المتوسط ​​إلى كل بئر من اثنين 6 جيدا لوحات زراعة الأنسجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي المتوسط ​​OGD مع N 2 لمدة 1 ساعة في غرفة نقص الأكسجة ثم ختم والحفاظ O / N في حاضنة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شرائط اللاهوائية كمؤشرات ميتة. النظر في المتوسط ​​إلى أن تكون الأكسجين الحر عندما يتغير لون الشرائط من الوردي إلى الأبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحريض نقص الأكسجة، واستخدام المصل المتوسطة الحرة مع الجلوكوز بدلا من OGD المتوسطة. قبل الاستخدام، يروي المتوسطة مع N 2 في غرفة نقص الأكسجة على النحو المفصل أعلاه لOGD المتوسطة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أن يتعرض لشرائح OGD، يروي المتوسط ​​OGD مرة أخرى مع N 2 لمدة 30 دقيقة. إضافة 2 ميكرولتر من 1 ملغ / مل يوديد propidium (PI) حل لكل بئر (لتركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل) إلى شرائح لمدة 30 دقيقة وحددفقط شرائح صحية للتجريب كما يتضح من انخفاض عدد خلايا إيجابية PI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الجدول الزمني للتعرض OGD وضخه هو مبين في الشكل 1. حرمان شرائح إما الأكسجين فقط (نقص الأكسجة) أو الأكسجين والجلوكوز (OGD) لمدة 15 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحريض نقص الأكسجة أو OGD، ونقل إلى شرائح OGD المتوسطة والحفاظ على لمدة 15 دقيقة في غرفة نقص الأكسجة. التأكد من أن جميع السوائل التي تبقى على الجانبين من إدراج ويستنشق بعيدا عندما يتم تبديل الثقافات من المتوسط ​​منتظم لOGD المتوسطة والظهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقص الأكسجين أو OGD، استبدل المتوسطة OGD مع المصل الاوكسيجين المتوسطة مجانا ويسمح الثقافات لاستعادة ل3، 24 أو 48 ساعة في المتوسط ​​المصل مجانا في الحاضنة العادية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. إضافة PI مرة أخرى قبل التثبيت لتحديد موت الخلية. </li></ol></li></ol> 3. العلاجات الدوائية من Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافيهEHOSCs ه لمدة 5 أيام (DIV5) في الحضانة المتوسطة قبل التعرض للعلاجات الدوائية. بدء العلاجات الدوائية إما خلال أو مباشرة بعد OGD OGD عندما يتم نقلها إلى شرائح متوسطة المصل مجانا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاجات للحماية من OGD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرومتر-6-7-سيانو nitroquinoxaline-2،3-ديون (CNQX) أو 1 سم الأسماك الرباعية الأسنان ميكرومتر (TTX) إلى مستنبت خلال OGD التحريض (لمدة 15 دقيقة) أو مباشرة بعد OGD تحريض لمدة 30 دقيقة. ثم، في احتضان normoxic مصل المتوسطة مجانا لمدة 48 ساعة قبل التثبيت. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاجات لتحريض الموت excitotoxic المواد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5 أيام في الحضانة الثقافات المتوسطة التحول إلى المتوسطة المصل الحرة تحتوي على 100 ميكرومتر (RS) -α الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-isoxazolepropionic حمض (أمبا) لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت تحتوي أمبا بواسطة الشفط (الحرص على إزالة أي وسيط المتبقية على إدراج)، ثم نقل إلى شرائح جديدة مع لوحات طبيعية مصل المتوسطة الحرة والاحتفاظ بها لمدة 48 ساعة حتى تثبيت. </li></ol></li></ol> 4. تثبيت والمناعية من Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوديد propidium (PI) تلطيخ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة PI لمدة 30 دقيقة إلى مستنبت من شرائح يعيشون بتركيز 2 ميكروغرام / مل. عرض الثقافات الحية مع مجهر مقلوب مجهزة مضان البصريات وتحديد شرائح لمزيد من العلاج. لتلطيخ PI في تركيبة مع المناعية، إضافة حل PI 30 دقيقة قبل التثبيت من الثقافات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت للشرائح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت من لوحة 6 جيدا وإضافة 3 مل من الطازجة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) إلى كل بئر. ثم ضع لوحة 6 جيدا في الثلاجة وإصلاح O / N في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل PFA في اليوم التالي وتغسل شرائح 3-4 مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شرائح من ط زراعة الخلاياnsert ومنع إجراء المناعية المقاطع التعويم الحر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بعناية وإزالة شرائح من إدراج الثقافة باستخدام فرشاة الطلاء فن حجم 0 أو أصغر. نقل كل شريحة الفردية في بئر من 96 لوحة جيدا مليئة عرقلة العازلة (PBS مع 3٪ مصل الماعز العادي (خ ع) و 2٪ تريتون-X100). الحفاظ على شرائح في المخزن المؤقت حجب لمدة 2 ساعة على RT في إطار التحريض المستمر من قبل شاكر المداري. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناعية من الثقافات شريحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوصفها الأوعية الدموية تستخدم بولكلونل مكافحة laminin في التخفيف من 1: 200 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ NGS و 0.5٪ تريتون-X100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوضع العلامات الخلايا العصبية تستخدم لمكافحة أنيبيب المرتبطة بروتين 2 (MAP2) في التخفيف من 1: 500 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ NGS و 0.5٪ تريتون-X100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شرائح مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية مع التحريض المستمر. بعد فترة الحضانة، وغسلها في برنامج تلفزيوني مع 0.5٪ تريتون-X100 لمدة 3-4 مرات. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأجسام المضادة الثانوية 1: 500 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ NGS و 0.5٪ تريتون-X100. احتضان الشرائح لمدة 2 ساعة في RT في الظلام مع اليكسا fluorophore الأجسام المضادة الثانوية مترافق. استخدام الماعز المضادة للأرنب المناسب أو الماعز لمكافحة فأر الضد الثانوية مترافق لاليكسا 350 أو 488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الضد الثانوية وتغسل شرائح ثلاث مرات مع المالحة تريس مخزنة (TBS). جبل لهم على الشرائح الزجاجية وساترة الشرائح مع Mowiol. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهري للشرائح الملون </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض شرائح الملون إما على المجهر القياسية مع المعدات epifluorescence أو مع المجهر متحد البؤر. التقاط صور مع كاميرا المناسبة. لبعض الصور وعكس النقيض مضان من أجل انتاج السفن غامق ملطخة على خلفية مشرقة (الشكلان 5 و 6). </li></ol> 5. تحديد الكثافة السفينة الإقليمية في الثقافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس vesseكثافة لتر استنادا المعابر السفينة كما هو موضح في مرجع 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شرائح الملون لlaminin لهذه القياسات. ركب الصور المسجلة من 10X التكبير مع شبكة 6 × 6، حيث كل شبكة تساوي 100 × 100 ميكرون لكل متر مربع، الحقل الكلي لل0.25 ملم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب ثلاثة من هذه الشبكات في المنطقة CA1، CA3، DG، وEC (الشكل 2). عد السفن المارة خطوط من الشبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على نتائج ذات أهمية إحصائية جيدة، وجعل القياسات في لا يقل عن 3 تجارب مستقلة، بما في ذلك البيانات كل 3 من الجراء الفأر مع 3 شرائح في الماوس الجرو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد متوسط ​​قيمة المعابر سفينة من الشبكات لكل منطقة وإجراء التحليل الإحصائي بواسطة ANOVA مع تصحيح Bonferroni كما اللاحق اختبار (P &lt;0.05 يعرف أهمية و) باستخدام برنامج إحصاءات المناسب. </li></ol>

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا للتوجيهات مجلس الجماعات الأوروبية في 24 نوفمبر 1986 (86/609 / EEC) وكان تاريخ والسماح من قبل السلطات السويسرية. الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

مع الأساليب المعروضة هنا، الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط يمكن استخدام أداة مرنة لدراسة التغيرات البلاستيك في الأنسجة العصبية بعد الإصابة. في حين الثقافات شريحة عضوي النمط وقد استخدمت في الماضي لدراسة ردود الفعل العصبية بعد نقص التروية 6، 7 الجانب الجديد من ا...

الجهاز العصبي المركزي حساس بشكل خاص للخسارة أو تخفيض إمدادات الأكسجين والجلوكوز بواسطة الأوعية الدموية. حتى انقطاع قصير بدلا من إمدادات الدم إلى الدماغ يمكن أن تحدث خسارة دائمة في وظيفة من مناطق الدماغ ذات الصلة مما يؤدي إلى أعراض السكتة الدماغية نموذجية. بالإضافة إلى فقدان الخلايا العصبية في المناطق المتضررة الأولية، هناك عادة إضافية فقدان الخلايا العصبية المتأخرة من خلال الضرر الثانوي. للأسف حتى الآن، كان يوجد علاج اعصاب للحد من موت الخلايا العصبية الثانوي المتاحة 1. الجهود البحثية لدراسة آليات الضرر الثانوي تعتمد على استخدام نماذج حيوانية من نقص التروية الدماغية مثل انسداد الشريان الدماغي الأوسط ومختلف تقنيات انسداد الجلطات (لمراجعة حديثة انظر 2). في موازاة ذلك، أيضا بسبب القيود والمخاوف الأخلاقية مع استخدام النماذج الحيوانية، ثقافة شريحة عضوي النمط من مختلف أنسجة الجهاز العصبي المركزي وقد استخدمت تسمح ستودى من ردود الفعل العصبية إلى نوع مختلف من إصابات 3-5. لدراسة رد فعل الخلايا العصبية في ظل الظروف التي تحاكي إصابات الدماغ الدماغية، وقد تم تطوير النظام النموذجي للحرمان الأكسجين الجلوكوز (OGD). في هذا النموذج، تتعرض الثقافات شريحة مؤقتا إلى المتوسطة التي تفتقر الجلوكوز وتم معايرتها مع غاز النيتروجين في غياب الأكسجين. مع مثل هذا العلاج، فمن الممكن للحث على إصابة الخلايا العصبية وفقدان الذي يشبه إلى حد ما واحد وحظ بعد الإصابة الدماغية في الجسم الحي 6 و 7. في الحصين، فإن مثل هذا العلاج يستحث فقدان الخلايا العصبية وتحديدا في CA1، ولكن ليس في منطقة CA3 أو التلفيف المسنن من الحصين. في المقابل، فإن دراسة التفاعلات الوعائية في الثقافات شريحة لم يجر على نطاق واسع حتى الآن. لسبب واضح هو عدم وجود الدورة الدموية والأوعية الدموية نضح في نموذج الثقافة شريحة. ومع ذلك، لقد أظهرنا سابقا أنه من الممكن للحفاظ على بسفن lood في الجهاز العصبي المركزي شريحة الثقافات لعدة أيام 8 و 9. الهدف العام من هذه الطريقة هو مراقبة ليس فقط مصير الخلايا العصبية بعد OGD بل تمتد الدراسة إلى مصير وإعادة تشكيل الأوعية الدموية التي هي جزء مهم من استجابة الاصابة. حتى الآن قد تتطلب هذه الدراسات استخدام التجارب على الحيوانات (دي يونغ وآخرون، 1999؛ Cavaglia وآخرون، 2001). في قدم بروتوكول هنا، فإننا سوف بالتفصيل كيف يمكن القيام به في مثل هذه الدراسات الثقافات شريحة عضوي النمط-entorhino الحصين تحدى إما مع نقص الأكسجة أو الآفات excitotoxic المواد تليها تحليل كل من البقاء والأوعية الدموية ردود الفعل العصبية. ويستند هذا البروتوكول على دراسة نشرت سابقا حول هذا الموضوع 10 ويمكن أن تكون مفيدة لأي مختبر ترغب في التفاعلات الوعائية العصبية في الجهاز العصبي المركزي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11012-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>stabilized form of L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millicell cell culture inserts</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Basal medium Eagle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anaerobic strips</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">59886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPA</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td>0169-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CNQX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">0190/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TTX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1078/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">polyclonal anti-laminin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Statistics software</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">GraphPad Prism</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td style="width:119px;">MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

إصابات الدماغ الدماغية هي من بين الشروط الأكثر شيوعا ومدمرة المساومة على وظيفة الدماغ السليم ويؤدي إلى استمرار العجز الوظيفية في المرضى المصابين كثير من الأحيان. على الرغم من الجهود البحثية المكثفة، لا تزال هناك أي خيار العلاج الناجع الذي يقلل الإصابة العصبية ويحمي الخلايا العصبية في المناطق الدماغية من الموت الثانوي تأخير. البحوث في هذا المجال عادة ما ينطوي على استخدام نماذج حيوانية متقنة ومعقدة. وتنشأ الثقافات شريحة عضوي النمط-Entorhino الحصين تحدى مع الأكسجين والحرمان الجلوكوز (OGD) في نماذج المختبر التي تحاكي نقص التروية الدماغية. الجانب الرواية من هذه الدراسة هو أن يتم دراسة التغيرات في الأوعية الدموية في الدماغ بالإضافة إلى التغيرات العصبية وردود الفعل من كل من الخلايا العصبية وحجرة حجرة الأوعية الدموية يمكن مقارنة والمترابطة. الطرق الواردة في هذا البروتوكول توسيع كبير في التطبيقات المحتملة للأوganotypic نهج ثقافة شريحة. تحريض OGD أو نقص الأكسجة وحدها يمكن تطبيقها بوسائل بسيطة إلى حد ما في الثقافات شريحة عضوي النمط ويؤدي إلى الضرر موثوقة وقابلة للتكرار في الأنسجة العصبية. هذا هو في تناقض صارخ مع التجارب على الحيوانات معقدة وإشكالية حمل السكتة الدماغية ونقص التروية في الجسم الحي. من خلال توسيع التحليل ليشمل دراسة رد فعل الأوعية الدموية يمكن أن توفر طرق جديدة حول كيفية حفظ واستعادة وظائف المخ. نهج ثقافة شريحة المقدمة هنا قد تتطور إلى أداة جذابة وهامة لدراسة إصابات الدماغ الدماغية ويمكن أن تكون مفيدة لاختبار التدابير العلاجية المحتملة التي تهدف إلى العصبية.

الحرمان من الجلوكوز والأكسجين نقص الأكسجة لحث على موت الخلايا العصبية والحد من الأوعية الدموية وتحديدا في المنطقة CA1 الحصين. OGD أو الأكسجين الحرمان وحده لمدة 15 دقيقة يسببها التعريفي قوي من موت الخلايا كما يراها يوديد propidium تلطيخ تحديدا في منطقة CA1 من الحصين <st...

Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

بروتوكول للثقافات شريحة عضوي النمط-entorhino الحصين، والذي يسمح استنساخ جوانب كثيرة من إصابات الدماغ الدماغية، ويرد. من خلال دراسة التغيرات في neurovasculature بالإضافة إلى التغييرات في الخلايا العصبية، وهذا البروتوكول هو أداة مرنة لدراسة التغيرات البلاستيك في الأنسجة العصبية بعد الإصابة.

وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Views.  University of Basel.  بروتوكول للثقافات شريحة عضوي النمط-entorhino الحصين، والذي يسمح استنساخ جوانب كثيرة من إصابات الدماغ الدماغية، ويرد. من خلال دراسة التغيرات في neurovasculature بالإضافة إلى التغييرات في الخلايا العصبية، وهذا البروتوكول هو أداة مرنة لدراسة التغيرات ?...

Video: The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

وعضوي النمط الثقافة شريحة الحصين النموذجي لفحص الإصابات متعلق بالخلايا العصبية

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

إعداد شريحة ، التثقيف الأنسجة وتسجيل Luciferase عضوي النمط من النشاط الجيني في نواة ساعة التأقلم

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

تسجيلات صفيف متعدد القطب من الانهيارات الجليدية الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

أورجانوتيبيك شريحة هيبوكامبال الثقافات كنموذج للدراسة نيوروبروتيكتيون واختزاع الخلايا السرطانية

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...