עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת באזל, המחלקה ליו, והקרן השוויצרית הלאומית למדע (31003A_141007). מרקוס Saxer סיפק תמיכה טכנית.

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקהילות האירופיות הנחיית המועצה של 22 ספטמבר 2010 (2010/63 / איחוד אירופי) ונסקרו והתיר על ידי הרשויות שוויצרית. .1 הגדרת תרבויות פרוסה Organotypic Entorhino-היפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס (EHOSCs) מגורי 4 עכבר היום (P4) לאחר לידה באמצעות 4,11 שיטת הדגירה סטטי. כאן, להשתמש בעכברי C57BL6 וCB6F1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כ 30 דקות לכל גור עכבר להכנת תרבויות פרוסה, כלומר, 3 שעות להמלטה של 6 גורי עכבר. לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים בזרימה שולחן עבודה מינרית עם מכשירי ניתוח עיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להימנע מהפרעות אפשריות מהעמדה של הפרוסה לאורך ציר septo-זמני, להשתמש רק בהיפוקמפוס פרוסות של חצי במחיצה. אם לא צוין אחרת, לבצע את כל הצעדים על RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את tהוא בראש של גור עכבר P4 עם מספריים כירורגיות. אין הרדמה נדרשת לצעד זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגולגולת סביב המוח ולזהות את הסדק שבין סוף הזנב של אונות המוח והמוח התיכון. מוציא בזהירות את החלק ממקורי המוח אל המוח התיכון, מהגולגולת ולמקם אותו במדיום הכנה קר כקרח בהיקף של MEM השלים עם טופס התייצב של L-גלוטמין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לנתיחה תחת סטראו עם המוח להיות שקוע בבינוני הכנה קרה כקרח. הסר קרומי המוח שנותר מההמיספרות בקליפת המוח. זהה את ההיפוקמפוס במשטח הזנב המדיאלי של האונה ולהפריד אותו יחד עם קליפת entorhinal הסמוכה משאר המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה לרקמת מסוק ולחתוך 400 מיקרומטר פרוסות עבות תחת רוחבי תנאי ספטית לציר septo-הזמני של ההיפוקמפוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפרוסות על ceהתרבות מוסיף ll (כ 6 פרוסות לכל הכנס) ו דגירתם ב6 צלחות גם עם 1 מ&quot;ל לכל טוב של מדיום דגירה (47 מ&quot;ל MEM, 25 מ&quot;ל נשר בינוני, 25 מ&quot;ל סרום סוס, 1 מ&quot;ל Glutamax אני, 1 מ&quot;ל של פתרון סטרילי 10% גלוקוז, pH 7.3) באווירת humidified עם 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לשנות את המדיום למחרת ולאחר מכן בכל יום אחר שלשבוע 1. </li></ol> .2 במבחנה היפוקסיה והחמצן גלוקוז מניעת עם reperfusion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראה טבלת מס &#39;1 ללוח זמנים מדויקים של ההליך. EHOSCs תרבות במשך 5 ימים (DIV5) לפני החשיפה להיפוקסיה או OGD. בנקודה זו בזמן לעבור בינוני ממדיום דגירה המכיל 25% בסרום סוס סרום בינוני חינם עם ההרכב הבא: בינוני Neurobasal עם 2% תוסף B27, Glutamax 1% וגלוקוז 0.1% נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום OGD כמפורט ב7 .the ריכוזים סופיים של רכיבי הפניה יהיה הבא: 0.3מ&quot;מ CaCl 2, 70 mM NaCl, 5.25 מ&quot;מ NaHCO 3, 70 מ&quot;מ KCl, 1.25 סוכרוז מ&quot;מ לאא 2 PO 4, 2 מ&quot;מ MgSO 4, ו10 מ&quot;מ בpH 6.8. הוסף 1 מ&quot;ל של מדיום OGD היטב כל אחד משני לוחות תרבית רקמה 6 היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse בינוני OGD עם N 2 עבור שעה 1 בתא היפוקסיה ואז לאטום ולשמור O / N בחממה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברצועות אנאירובי כאינדיקטורים חוסר חמצן. קחו למשל את המדיום להיות חמצן חופשי כאשר את הצבע של הרצועות השתנה מורוד ללבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאינדוקציה של היפוקסיה, להשתמש בינוני סרום ללא עם גלוקוז במקום בינוני OGD. לפני השימוש, תנקב בינוני עם N 2 בתא היפוקסיה, כמפורט לעיל למדיום OGD. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני פרוסות נחשפות לOGD, תנקב בינוני OGD שוב עם N 2 למשך 30 דקות. הוסף 2 μl של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​propidium יודיד (PI) פתרון לכל טוב (לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לפרוסות למשך 30 דקות ובחררק פרוסות בריאים לניסויים כפי שצוינו על ידי מספרים נמוכים של תאים חיוביים לצרכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלוח הזמנים של חשיפת OGD וreperfusion מצויינים באיור 1. לשלול פרוסות או חמצן בלבד (היפוקסיה) או חמצן וגלוקוז (OGD) במשך 15 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאינדוקציה של היפוקסיה או OGD, להעביר פרוסות לתוך מדיום OGD ולשמור במשך 15 דקות בתא היפוקסיה. ודא שכל הנוזלים שנותרו בצדדים של להכניס אותם להישאף משם כאשר התרבויות עברו ממדיום רגיל עד בינוני OGD ובחזרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היפוקסיה או OGD, להחליף את מדיום OGD עם מדיום סרום ללא מחומצן ותרבויות מותר להתאושש במשך 3, 24 או 48 שעות במדיום סרום ללא בחממה הרגילה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. להוסיף PI שוב לפני קיבוע לקביעת המוות של תאים. </li></ol></li></ol> 3 טיפולים תרופתיים של תרבויות Organotypic Slice Entorhino-היפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CulturEHOSCs דואר במשך 5 ימים (DIV5) במדיום דגירה לפני החשיפה לטיפולים תרופתיים. התחל טיפולים תרופתיים או במהלך OGD או מייד לאחר OGD כאשר פרוסות מועברות למדיום חופשי בסרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים להגנה מפני OGD. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 מיקרומטר 6-Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-דיונה (CNQX) או tetrodotoxin 1 מיקרומטר (TTX) למדיום התרבות במהלך האינדוקציה OGD (ל15 דקות) או מייד אחרי גיוס OGD ל30 דקות. ואז, דגירה במדיום סרום ללא normoxic ל48 שעות לפני הקיבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים לזירוז מות הפעלת יתר רעיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 ימים בתרבויות מתג בינוני דגירה לסרום מדיום חופשי המכיל 100 מיקרומטר (RS) -α-אמינו-3-הידרוקסי 5-methyl-4-isoxazolepropionic חומצה (AMPA) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות המכיל AMPA על ידי שאיפה (דואג להסיר כל מדיום שיורית על מוסיף), ולאחר מכן להעביר את הפרוסות לצלחות טריות עם מדיום סרום נורמלי חופשי ולשמור אותם ל48 שעות עד קיבעון. </li></ol></li></ol> .4 תרבויות Organotypic Slice קיבוע וImmunostaining של Entorhino-היפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יודיד Propidium מכתים (PI). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף PI ל30 דקות למדיום התרבות של פרוסות המתגוררות בריכוז של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל. צפה תרבויות לחיות עם מיקרוסקופ הפוך מצויד באופטיקה הקרינה ובחר פרוסות לטיפולים נוספים. עבור מכתים PI בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, להוסיף פתרון PI 30 דקות לפני הקיבוע של התרבויות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע של הפרוסות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות מצלחת 6 היטב ולהוסיף 3 מ&quot;ל של paraformaldehyde מוכן טרי 4% (PFA) זה טוב. לאחר מכן למקם את צלחת 6 היטב במקרר ולתקן O / N ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון PFA ביום שלמחרת ולשטוף את הפרוסות 3-4 פעמים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת פרוסות מi תרבית תאיםnsert והליך חסימת אימונוהיסטוכימיה סעיפים ריחוף ללא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק בזהירות ולהסיר את הפרוסות מהתרבות מוסיף באמצעות מברשת צבע אמנות של הגודל 0 או קטנים יותר. העבר את כל פרוסה בודדת לתוך באר של צלחת גם 96 מלאות בחסימת מאגר (PBS עם 3% בסרום נורמלי עז (NGS) ו -2% Triton-X100). שמור את הפרוסות במאגר החסימה לשעה 2 ב RT תחת תסיסה המתמדת של שייקר מסלולית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostaining של התרבויות הפרוסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיוג כלי דם להשתמש אנטי laminin polyclonal בדילול של 1: 200 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוירונים תיוג להשתמש אנטי microtubule הקשורים החלבון 2 (MAP2) בדילול של 1: 500 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הפרוסות עם נוגדנים ראשוניים ל48 שעות ב 4 ° C. עם תסיסה מתמדת. לאחר תקופת הדגירה, לשטוף אותם בPBS עם 0.5% Triton-X100 ל3-4 פעמים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדנים משני 1: 500 PBS המכיל NGS 1% ו0.5% Triton-X100. דגירה את הפרוסות לשעה 2 ב RT בחושך עם הנוגדנים משני מצומדות fluorophore Alexa. השתמש נגד הארנב המתאים העז או נוגדנים משני עז אנטי עכבר מצומדת לAlexa 350 או 488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון נוגדנים משני ולשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם שנאגר מלוח טריס (TBS); לעלות אותם על שקופיות זכוכית וcoverslip השקופיות עם Mowiol. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופית של פרוסות המוכתמות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה פרוסות המוכתמות או במיקרוסקופ רגיל עם ציוד epifluorescence או עם מיקרוסקופ confocal. קח תמונות עם מצלמה מתאימה. עבור חלק מתמונות, להפוך את ניגוד הקרינה כדי להניב כלי קדרות צבעוניים על רקע בהיר (איורים 5, 6). </li></ol> .5 קביעת צפיפות כלי אזורית בתרבויות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את vesseצפיפות l מבוססת על מעברי כלי כפי שמתואר בעיון 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפרוסות מוכתמות עבור laminin למדידות אלה. להרכיב תמונות מוקלטות של 10X הגדלה עם רשת 6 × 6, שבו כל רשת שווה לכל מ&quot;ר 100 x 100 מיקרומטר, שדה כולל של 0.25 מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלוש רשתות כיסוי כזה באזור CA1, CA3, DG, וEC (איור 2). לספור את כלי חוצים את הקווים של הרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תוצאות עם רלוונטיות סטטיסטיות טובות, לבצע מדידות בלפחות 3 ניסויים בלתי תלויים, כל נתוני, כולל מ3 גורי עכבר עם 3 פרוסות לגור עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הערך של מעברי כלי הממוצע מרשתות לכל אזור ולבצע ניתוח סטטיסטי על ידי ניתוח שונה עם תיקון Bonferroni כמבחן post hoc (p &lt;0.05 המוגדרים משמעותי כ) באמצעות תוכנה הסטטיסטית מתאימה. </li></ol>

<ol>
	<li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection:+navigating+past+failure+to+future+success.">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li><li>Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke.+Part+two:+modeling+cerebral+ischemia.">Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia.</a> Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).</li><li>Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhino-dentate+projections+in+organotypic+slice+cultures:+mode+of+axonal+regrowth+and+effects+of+growth+factors.">Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors.</a> Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).</li><li>Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+entorhinal+fibers+in+mouse+slice+cultures+is+age+dependent+and+can+be+stimulated+by+NT-4,+GDNF,+and+modulators+of+G-proteins+and+protein+kinase.">Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase.</a> C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).</li><li>Rytter, A., Cronberg, T., Aszt&#233;ly, F., Nemali, S., Wieloch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hippocampal+organotypic+tissue+cultures+exposed+to+in+vitro+&#8216;ischemia&#8217;+show+selective+and+delayed+CA1+damage+that+is+aggravated+by+glucose.">Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro &#8216;ischemia&#8217; show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).</li><li>Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+modulates+density+of+blood+vessels+and+preserves+tight+junctions+in+organotypic+cortical+cultures+of+mice:+a+new+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier.">Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier.</a> J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).</li><li>Camenzind, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+transendothelial+glucose+transporter+1+and+P-glycoprotein+transporters+in+a+cortical+slice+culture+model+of+the+blood-brain+barrier.">Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier.</a> Neuroscience. 170, 361-371 (2010).</li><li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment.">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li><li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia.">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li><li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death.">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לקהילות האירופיות הנחיית מועצת יום 24 בנובמבר 1986 (86/609 / EEC) ונסקרו והתירו על ידי הרשויות שוויצרית. יש לי המחברים אין לחשוף.

עם השיטות שהוצגו כאן, ניתן להשתמש בתרבויות פרוסה organotypic היפוקמפוס ככלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה. בעוד תרבויות הפרוסה organotypic היו בשימוש בעבר ללימוד תגובות עצביות לאחר איסכמיה 6, 7 ההיבט החדש של המחקר בו זמני של שינויים בכלי הדם משפר באו?...

מערכת העצבים המרכזית היא רגישה במיוחד לאובדן או הפחתה של חמצן ואספקת הגלוקוז על ידי מערכת כלי הדם. אפילו הפרעה קצרה ולא של אספקת דם למוח יכולה לגרום לאובדן קבוע של תפקוד של אזורי המוח הרלוונטיים מובילים לתסמונות שבץ טיפוסיות. בנוסף לאובדן העצבי באזורים שנפגעו העיקריים, יש בדרך כלל הוא אובדן עצבי המאוחר נוסף באמצעות נזק המשני. לרוע המזל עד עכשיו, אין טיפול נוירו להפחתת מוות עצבי המשני היה זמין 1. מאמצי מחקר לחקר המנגנונים של נזק משני מסתמכים על השימוש במודלים של בעלי החיים של איסכמיה המוחית כמו עורקים התיכון ספיגה מוחין וטכניקות שונות טרומבוטיים חסימה (לסקירה האחרונה לראות 2). במקביל, גם בשל מגבלות וחששות אתיים עם השימוש במודלים של בעלי חיים, התרבות הפרוסה organotypic של רקמות CNS השונות היה בשימוש המאפשר סטהdy של תגובות עצביות לסוג שונים של פציעות 3-5. ללימוד התגובה העצבית בתנאים המחקים פגיעה מוחית איסכמי, מערכת המודל של חסך גלוקוז החמצן (OGD) פותחה. במודל זה, תרבויות פרוסה באופן זמני נחשפו למדיום שחסר גלוקוז וכבר equilibrated עם גז חנקן בהיעדר החמצן. עם טיפול כזה, ניתן לגרום לפגיעה עצבית ואובדן שהוא די דומה לזה שנצפה לאחר פגיעת איסכמית in vivo 6, 7. בהיפוקמפוס, טיפול כזה גורם לאיבוד עצבי במיוחד בCA1, אך לא ב אזור CA3 או gyrus המשונן של ההיפוקמפוס. בניגוד לכך, המחקר של תגובות של כלי דם בתרבויות פרוסה עד כה לא בוצע באופן נרחב. סיבה ברורה היא חוסר זרימת הדם וזלוף כלי דם במודל התרבות הפרוסה. עם זאת, יש לנו הראינו בעבר כי ניתן לשמור בכלי lood במערכת העצבים המרכזית פורסים תרבויות במשך כמה ימים 8, 9. המטרה הכללית של שיטה זו היא לפקח לא רק את גורלם של תאי עצב לאחר OGD אבל להאריך את המחקר לגורל והשיפוץ של כלי הדם שהוא חלק חשוב מהתגובה לפציעה. עד כה מחקרים כאלה דורשים השימוש בניסויים בבעלי חיים (דה יונג et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). בפרוטוקול מובא כאן, אנו פירוט כיצד ניתן לעשות מחקרים כאלה בתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס תיגר גם עם היפוקסיה או על ידי נגעי הפעלת יתר רעילים ואחריו ניתוח של שתי תגובות הישרדות וכלי דם עצביות. פרוטוקול זה מבוסס על מחקר שפורסם בעבר בנושא זה 10 ויכול להיות שימושי עבור כל מעבדה מתעניינת באינטראקציות עצבים וכלי דם במערכת העצבים המרכזית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Minimum Essential Medium MEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11012-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>stabilized form of L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millicell cell culture inserts</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">PICM03050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Basal medium Eagle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Horse serum</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anaerobic strips</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">59886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">AMPA</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td>0169-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CNQX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">0190/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TTX</td>
			<td style="width:71px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">1078/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">polyclonal anti-laminin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:71px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab11267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti mouse 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 350</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa anti rabbit 488</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Statistics software</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">GraphPad Prism</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hypoxia chamber</td>
			<td>Billups-Rothenberg</td>
			<td style="width:119px;">MIC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the analysis of neurovascular remodeling in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures

פגיעה המוחית איסכמי היא בין המצבים השכיחים וההרסניים ביותר להתפשר תפקוד מוח תקין, ולעתים קרובות מובילה למתמידים ליקויים תפקודיים בחולים שנפגעו. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, עדיין אין אפשרות טיפול יעילה זמינה המפחיתה את פגיעה עצבית ומגנה על תאי עצב באזורי איסכמי ממוות שני מעוכב. מחקר בתחום זה בדרך כלל כרוך בשימוש במודלים של בעלי חיים מורכבים ובעייתיים. תרבויות הפרוסה organotypic Entorhino-היפוקמפוס תיגר עם חמצן וקיפוח גלוקוז (OGD) הוקמו במודלים חוץ גופית המחקים איסכמיה מוחית. ההיבט החדשני של מחקר זה הוא ששינויים של כלי דם במוח נלמדים בנוסף לשינויים עצביים ואת התגובה של שניהם תא העצבי וכלי דם התא ניתן להשוות ומתואם. השיטות שהוצגו בפרוטוקול זה באופן משמעותי להרחיב את היישומים הפוטנציאליים של אוגישת התרבות הפרוסה ganotypic. האינדוקציה של OGD או היפוקסיה לבדו יכולה להיות מיושמת על ידי ולא פשוטים בתרבויות פרוסה organotypic ומובילה לנזק לאמין לשחזור ברקמה העצבית. זאת בניגוד מוחלט לניסויים בבעלי החיים מסובכים ובעייתיים גרימת שבץ ואיסכמיה in vivo. על ידי הרחבת הניתוח לכולל את חקר התגובה של כלי הדם יכול לספק דרכים חדשות על איך לשמר ולשחזר תפקודי מוח. גישת התרבות הפרוסה המוצגת כאן עשויה להתפתח לכלי אטרקטיבי וחשוב למחקר של פגיעה המוחית איסכמי ועשויה להיות שימושי לבדיקת אמצעים טיפוליים פוטנציאליים שנועדו neuroprotection.

קיפוח גלוקוז חמצן וחוסר חמצן גורמים למוות עצבי וירידה של כלי דם באופן ספציפי באזור CA1 בהיפוקמפוס. OGD או חמצן קיפוח לבד במשך 15 דקות מושרה אינדוקציה חזקה של מוות של תאים כפי שהם נראים על ידי מכתים יודיד propidium במיוחד באזור CA1 של ההיפוקמפוס (איור 3) הדומה כפ...

Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

the-analysis-neurovascular-remodeling-entorhino-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K Views.  University of Basel.  פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה. 

Video: The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...