وأيد هذه الدراسة من المنح RO1 CA 135561، R01 CA151494، R01 CA174432 وP3013330 من المعاهد الوطنية للصحة. نود أن نشكر ميشيل هيوستن، ايلينا Dhima والدكتورة آنا Velcich للتعليقات القيمة في تطوير بروتوكول سرداب العزلة. كما نشكر التدريب مركز السكري والأبحاث في كلية ألبرت أينشتاين للطب بدعم من المعاهد الوطنية للصحة P60DK20541، والدكتور مايكل والدكتور براونلي شيويه ليانغ دو، الذين يوجهون وتشغيل المرفق فرس البحر، على التوالي.

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاق للتجارب على الحيوانات في كلية ألبرت أينشتاين للطب. 1. القبو العزلة والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الأقبية من الأمعاء الدقيقة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الأقبية الأمعاء من أي نموذج الفئران من الفائدة. الموت ببطء الفئران مع CO 2 تليها خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البطن طوليا وملء الأمعاء الدقيقة (SI) بمحلول ملحي بارد الجليد الفوسفات مخزنة، PBS (-Ca 2+، -Mg 2+) مع 2X للمضادات الحيوية مضاد فطري (مكافحة المضادة). بسرعة عزل الأمعاء الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح دقيق خال من الدهون المساريقي باستخدام مشرط. احرص على عدم خرم الأنسجة - في جميع الأوقات الحفاظ على الأنسجة رطبة مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. فتح الأسواق العالمية ضغطهاستاين طوليا ويغسل جيدا بالماء والثلج البرد PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأمعاء الدقيقة إلى قسمين وتتسطح بها باستخدام تلميح القطن مبللة، بلطف كشط الزوائد باستخدام شريحة تبريد مسبقا. يغسل بقوة في الجليد الباردة PBS عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 3 دقائق في 20 مل 1X PBS في 3 ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) /0.5 ملي dithiothreitol (DTT) لتفارق غير الأنزيمية للأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأنسجة الى قطع صغيرة (2-4 ملم) باستخدام شفرة حلاقة على شريحة تبريد مسبقا. نقل قطع في أنبوب 50 مل تحتوي على 20 مل PBS الباردة الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بلطف صعودا ونزولا 10X باستخدام 10 مل ماصة معقمة المتاح. السماح شظايا الأنسجة الرواسب بفعل الجاذبية. إزالة طاف مع ماصة. كرر ثلاث مرات إضافية؛ التأكد من طاف هو واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني في 2 ملي EDTA. دوامة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هزاز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك رواسب الأنسجة وتجاهل طاف. إضافة 15 مل PBS الجليد البارد وماصةصعودا وهبوطا 5X مع ماصة 10 مل. السماح للشظايا الأنسجة الرواسب وجمع طاف كما الكسر 1 (F1). تكرار جمع F2-F5، كل جزء على حدة المحافظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 مل PBS الجليد الباردة وهذه المرة هزة بقوة باليد لمدة 15 ثانية. جمع F6 وتكرار لF7، F8. إذا قطع الأنسجة تبدأ تطفو، انقر لمساعدتهم على الاستقرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد قسامة من كل جزء تحت المجهر. بركة تلك الكسور التي تحتوي الأقبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير الكسور المجمعة خلال 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة، وجمع الأقبية في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف و resuspend بيليه في 10 مل PBS الجليد الباردة مع 2X أقبية مكافحة معاداة ونقل إلى أنبوب 15 مل. تكرار غسل واحد لمزيد من الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخبايا مرة واحدة مع 10 مل من الجليد البارد ADF، DMEM المتقدم / F-12 (Dulbecco &quot;ليالي التعديل النسر متوسطة / هام&quot; ليالي F-12) - 2X مكافحة المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخبايا مرة واحدة مع 10 مل وDF - 1x أخرى مضادة للمكافحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخبايا باستخدام عدادة الكريات. ضبط مستوى الصوت حل سرداب ونقل إلى أنبوب 1.5 مل بحيث تركز سرداب النهائي عندما معلق سيكون 100-500 الأقبية في 50 ميكرولتر من مزيج هلامي البروتين (Matrigel). الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend الأقبية في خليط من البروتين هلامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 50 ميكرولتر من سرداب - هلامي تعليق خليط من البروتين لكل بئر في لوحة 24-جيدا (منطقة النمو: 2 سم 2)، ووضع بعناية قطرة تعليق في وسط كل بئر. الحفاظ على لوحة في CO 2، 37 ° C حاضنة لل~ 30 دقيقة حتى يتصلب تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر وسائل الإعلام ثقافة الجليد الباردة كاملة (متقدم DMEM / F12 مع 1X المضادة - المعادي، 10 ملم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، 1X GlutaMAX، 1X B27 الملحق، الملحق 1X N2، 1 ملم N-أسيتيل-L-سيستين (NAC)، 50 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي)، و 100 نانوغرام / ملرأس، و 500 نانوغرام / مل R-Spondin). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشكيل عوامل النمو في 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سرداب عضي الثقافة والممر: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرور organoids سرداب 14-21 يوما بعد البذر (أو حسب الحاجة) على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الاعلام كل يوم جمعة والاثنين. يوم الأربعاء، استبدال نصف وسائل الإعلام مع وسائل الاعلام الطازج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت. غسل العينة مرتين مع 500 ميكرولتر PBS في فترات 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وكسر بلطف صعودا وخليط من البروتين هلامي باستخدام ماصة معقمة P1000 الحافة الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل كامل وسائل الإعلام ثقافة لبئر واحد و resuspend organoids في 1 مل سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل بلطف organoids باستخدام P1000 pipetting صعودا وهبوطا 20-30x (فحص تحت المجهر للتفكك عضوي الشكل الصحيح مع تحقيق عائد جيد حتى سرداب تقنية متسقة تم تطويرها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخبايا لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل.الطرد المركزي في 100 x ج في 4 درجات مئوية، 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بيليه مرتين مع 1 مل كامل وسائل الإعلام الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقسام في نسبة 1: 3 أو 1: 6 حسب الحاجة، أقبية إعادة التعليق في 50 ميكرولتر Matrigel لكل بئر. المضي قدما على النحو المبين أعلاه (القسم 1.1.16-18). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سرداب تجميد عضي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت. غسل العينة في 500 ميكرولتر PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريق خليط من البروتين هلامي باستخدام طرف P1000 ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل سائل الإعلام لبئر واحد و resuspend organoids في 1 مل سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر بلطف حتى organoids باستخدام P1000 pipetting صعودا وهبوطا 20-30x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل organoids إلى أنبوب 1.5 مل. الطرد المركزي في 100 x ج في 4 درجات مئوية، 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بيليه مرتين مع 1 مل كامل وسائل الإعلام الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقبية resuspend في 500 ميكرولتر تجميد وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقبية نقل إلى cryotube، ووضع أنبوب في وعاء تجميدها وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية overniGHT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أقبية السائل N 2 خزان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة organoids سرداب المجمدة من قبل ذوبان بسرعة في 37 ° C حمام الماء. يغسل مع 500 ميكرولتر كامل وسائل الإعلام ثقافة واحدة، الطرد المركزي في 100 x ج، 5 دقائق و resuspend في هلامي خليط من البروتين، والثقافة كما هو موضح أعلاه. لاستعادة أفضل، إضافة مثبط ROCK (Y-27632) لوسائل الإعلام التجميد. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. القبو عضي الأيض الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24-الآبار إعداد اللوحة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الأقبية والاعتماد وفقا لبروتوكول (انظر القسم 1.1 لعزل سرداب والقسم 1.2 للسرداب مرور). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في أقبية هلامي خليط من البروتين (100-200 الأقبية في 20 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة-سرداب هلامي خليط من البروتين تعليق في لوحة الفحص 24-جيدا (للتأكد من أن هناك على الأقل ثلاث نسخ لكل عينة) والسماح للتعليق على يصلب عند 37 درجة مئوية في CO 2حاضنة. ثم إضافة 500 ميكرولتر الكامل سائل الإعلام والثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقبية الثقافة (كما هو موضح في القسم 1.1) ونلاحظ تحت المجهر حتى تنمو في أقبية organoids تطويره بالكامل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خارج الخلية الجريان الفحص: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خرطوشة هيدرات بين عشية وضحاها في 2 غير CO (0٪ CO 2)، 37 درجة مئوية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت وغسل organoids مرتين مع 500 DMEM ميكرولتر (بدون: الجلوكوز والجلوتامين L-، البيروفات الصوديوم وبيكربونات الصوديوم، ومع: أحمر الفينول). انتظر 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 675 ميكرولتر لكل المتوسطة الفحص جيدا (DMEM مع 2 مم L-الجلوتامين و 5 ملي مد الجلوكوز) إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق سرداب organoids التشكل المجهري للتأكد من أن organoids وخليط من البروتين هلامي وسليمة بعد يغسل. احتضان 1 ساعة في غير ثاني 2، 37 درجة مئوية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ميكرومتر المركبات عن طريق الحقن (أوليغوميسين، الكربونيل السيانيد-P-trifluoro-ميثوكسي فينيل هيدرازون (FCCP)، صotenone) في مقايسة المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء خرطوشة عن طريق تحميل 75 ميكرولتر من 10 ميكرومتر المركبات عن طريق الحقن في موانئ بالتتابع خرطوشة: ميناء A - أوليغوميسين. ميناء ب - FCCP. وميناء C - روتنون (تركيزات النهائية خلال الفحص سوف يكون 1 ميكرومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خرطوشة 30 دقيقة - 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 2-CO غير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نفس الوقت، تشغيل محلل XF وخلق القالب بروتوكول الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع خرطوشة والمرافق في لوحة XF محلل وتشغيل &quot;معايرة&quot; خرطوشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق organoids سرداب مجهريا للتأكد من أنها هي التي تعلق إلى خليط من البروتين هلامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الثقافة خلية الحمل في بروتوكول أداة فحص وتشغيل. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li><li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer.">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells.">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li><li>Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells.">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC.">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7 (2013).</li><li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+changes+in+histone+modifications,+mRNA+levels,+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832/13+&#946;-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity.">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 &#946;-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li><li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro.">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li></ol>

لا توجد الإفصاحات.

نحن اختبار معدل استهلاك الأوكسجين (OCR)، و سعر تحمض خارج الخلية (ECAR) من الأقبية المعزولة من الفئران البالغة 8 أشهر ونمت لتصبح organoids خارج الحي، وبعد قياس معدل القاعدية، تم تقييم الأيض سرداب بإضافة أوليغوميسين، الكربونيل السيانيد -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) وروتينون، با?...

سرطان القولون (CRC) هو ثالث سبب رئيسي لوفيات السرطان ذات الصلة في الولايات المتحدة. سرطان القولون متفرقة - أي أن تنشأ في وقت لاحق في الحياة (&gt; 50 سنة من العمر) مع وجود عوامل وراثية واضحة المهيئة - حسابات ل~ 80٪ من جميع الحالات، مع حدوث يتأثر بقوة الأنماط الغذائية على المدى الطويل 1،2. هذه الأورام تظهر تحولا الأيض نحو الاعتماد على تحلل الأكسدة، والمعروفة باسم تأثير اربورغ، والتي قد تجعل جزء في تركيزات أعلى من اللبنات الخلوية والطاقة المتوفرة (من خلال glutaminolysis) للسماح وربما دفع معدلات عالية من انتشار الخلايا السرطانية 3-5 . دراسات الإصابة بسرطان القولون وكذلك سرطانات الجهاز الهضمي الأخرى بما في ذلك سرطانات الأمعاء الصغيرة توفر نظرة متبصرة في قضية تشكيل الورم. التحقيق في الخلافات بين الدول الأيض العادية، الموالية للمكون للأورام ومكون للأورام من نظم الجهاز الهضمي قد تساعد ديتermination من الخطر النسبي لتطور الورم، وكذلك الكشف المبكر عن الأورام. وعلاوة على ذلك، فإن فهم عملية الأيض الطاقة البيولوجية التي تنطوي على التنفس الميتوكوندريا وتحلل توفير البصيرة الأساسية في كيفية يشوش فسيولوجيا الخلايا والشيخوخة والمرض حالة توازن الأمعاء. الاستفادة من تكنولوجيا الطاقة الحيوية الفحص لتحليل تدفق خارج الخلية يمكن تقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا وتحلل في وقت واحد في الخلايا نموا في الثقافة في الوقت الحقيقي 6،7. حتى وقت قريب، في الدراسات المختبرية من الأمعاء الدقيقة اقتصرت على خطوط الخلايا المشتقة من الأورام إما حميدة أو خبيثة 8،9 ولا تمثل فسيولوجيا الظهارة المعوية الطبيعية وتأثير المكروية التي يقيمون فيها. في عام 2009، قدم ساتو وآخرون. 10 وخارج الحي نظام الثقافة في النمو ثلاثي الأبعاد (3D) الماوس organoids الظهارية في الأمعاء، أو epithelial &quot;مصغرة الشجاعة&quot;، ومناسبة للالتحقيقات التجريبية والتشخيصية والعلاجية 10،11. وعلاوة على ذلك، الأقبية المعزولة من الفئران مقيدة بالوحدات الحرارية تحافظ على خصائص النمو المتغيرة كما organoids في مثل هذه الثقافات 12. بالمقارنة مع خطوط الخلايا تحولت والثقافات عضي سرداب يمكن استخدامها لتوليد البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية تقديم نموذج أفضل بكثير لفهم الدولة في الجسم الحي. نحن تكييفها تكنولوجيا تحليل الطاقة الحيوية لفحص استقلاب الطاقة من organoids سرداب الأمعاء. كان الفأر organoids سرداب الأمعاء مثقف فيفو السابقين لتطوير الدراسات استقلاب الطاقة عضي سرداب المقدمة. تم قياس معدل استهلاك الأكسجين (OCR)، و سعر تحمض خارج الخلية (ECAR) من organoids سرداب في غياب وجود اثنين من مثبطات مختلفة الأيض (أوليغوميسين، روتينون) وحاملة أيون (الكربونيل السيانيد-P-trifluoromethoxyphenylhydrazone). وORGA سردابوقد عكست استجابة الأيض NOID لهذه المركبات الكيميائية بنجاح من خلال تغيير ECAR والقيم OCR. ودراسات الطاقة البيولوجية الخلوية توضيح التفاعلات المتبادلة بين دولة الأيض ومخاطر المرض والنمط الظاهري في السرطان، والسمنة، والسكري، والاضطرابات الأيضية وأمراض الميتوكوندريا وتساعد أساليب الفحص مسبقة مع آثار مباشرة على الطب متعدية. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لعزل الأقبية الأمعاء الصغيرة وللثقافة organoids سرداب. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم طريقة جديدة لاستخدام الثقافات عضي سرداب لفحوصات الأيض.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1633">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">356231</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">20012-027</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Advanced DMEM/F-12 (1X)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12634-028</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D5030</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Phenol Red sodium salt&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P4758</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) - step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15240-062&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X or 2 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Penicilin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15140-122</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">35050061</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15630-080</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">N-Acetyl-L-Cysteine, 25g</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A9165-25G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">100X N-2 supplement, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">50X B-27&#174; supplement minus Vitamin A, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12587-010</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug</td>
			<td style="width:229px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3474-RS-050&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 500 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine EGF, 100ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">315-09&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 50 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine Noggin, 20ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">250-38</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 100 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; L-glutamine, 200 mM</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">25030-081</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; Glucose powder</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15023-021</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Ambion&#174; 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">AM9260G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">DTT (Dithiothreitol), 1M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P2325</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A2058</td>
			<td style="width:456px;">0.1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">16000-044</td>
			<td style="width:456px;">1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recovery&#8482; Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12648-010</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">ROCK inhibitor (Y-27632)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">Y0503</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">O4876</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C2920</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Rotenone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R8875</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">221465</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 0.1 N in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td>
			<td style="width:229px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

الغشاء المخاطي في الأمعاء الصغيرة يسلك العمارة المتكررة تنظيمها في اثنين من الهياكل الأساسية: الزغب، وإسقاط في لمعة الأمعاء وتتألف من المعوية ناضجة، والخلايا الكأسية والخلايا enteroendocrine. والأقبية، ويقيم الأقرب إلى تحت المخاطية والعضلية، بإيواء الجذعية البالغة والخلايا الاولية والخلايا الناضجة بانيت، وكذلك انسجة والخلايا المناعية للالمكروية سرداب. حتى السنوات القليلة الماضية، في الدراسات المختبرية من الأمعاء الدقيقة اقتصر على خطوط الخلايا المشتقة من الأورام إما حميدة أو خبيثة، ولم تمثل فسيولوجيا الظهارة المعوية الطبيعية وتأثير المكروية التي يقيمون فيها. هنا، ونحن لشرح طريقة مقتبسة من ساتو وآخرون (2009) لزراعة organoids سرداب الماوس المعوية الأولية المستمدة من C57BL / 6 الفئران. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم استخدام الثقافات عضي سرداب لفحص الملف الشخصى الأيض سرداب في الوقت الحقيقي من خلال قياسمنة من استهلاك الأكسجين القاعدية، ومعدل حال السكر، وإنتاج ATP والقدرة التنفسية. Organoids الحفاظ على الخصائص التي حددها مصدرها والاحتفاظ جوانب التكيف الأيض الخاصة التي تعكسها معدلات استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية. في الوقت الحقيقي الدراسات الأيضية في هذا سرداب عضي نظام الثقافة هي أداة قوية لدراسة سرداب استقلاب الطاقة عضوي الشكل، وكيف يمكن التضمين من قبل العوامل الغذائية والدوائية.

تم إنشاء organoids سرداب من 8 أشهر من العمر C57BL / 6 الفئران التي غذيت تنقية القوارض الحمية المعهد الأمريكي للتغذية 76A (AIN76A). يمكن زراعتها organoids سرداب الأمعاء في الثقافة لفترات طويلة من سرداب واحد (الشكل 1A، السهم الأحمر واحد). Organoids تنمو خارج هياكل شبيهة سرداب في 18-20 أي?...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures at JoVE.com

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

مثقف organoids سرداب صغير في الأمعاء فيفو السابقين توفير نظام زراعة الأنسجة الذي يلخص نمو أقبية تعتمد على الخلايا الجذعية ومكانها المناسب. أنشأنا طريقة لفحص الملف الشخصى الأيض في الوقت الحقيقي في الماوس الأساسي organoids سرداب. وجدنا organoids الحفاظ على الخصائص الفسيولوجية التي يحددها مصدرها.

تحليل الوقت الحقيقي ايض الملف في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافات ماوس المعوية سرداب عضي

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.1K Views.  Albert Einstein College of Medicine.  مثقف organoids سرداب صغير في الأمعاء فيفو السابقين توفير نظام زراعة الأنسجة الذي يلخص نمو أقبية تعتمد على الخلايا الجذعية ومكانها المناسب. أنشأنا طريقة لفحص الملف الشخصى الأيض في الوقت الحقيقي في الماوس الأساسي organoids سرداب. وجدنا organoids ال?...

Video: Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

حقيقية النواة التحليل الشخصي Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

بروتوكول الفيديو من عدوى فيروسات الرجعية في الابتدائية المعوية عضي الثقافة

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

الثقافات الابتدائية المختلطة الفئران الأمعاء الدقيقة المعدة للدراسة غوت هرمون إفراز ولايف التصوير خلية من خلايا Enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

في الوقت الحقيقي في فيفو تسجيل إشارات الكالسيوم أعطيت خلال تغذية الحشرة باستخدام بيوسينسور نيون

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult mice for in vivo longitudinal real-time monitoring of thymocytes&#180; dynamics within a vascularized thymus segment. Following the transplantation, laser scanning microscopy (LSM) through the cornea allows in vivo noninvasive repeated imaging at cellular resolution level. Importantly, the approach adds to previous intravital T-cell maturation imaging models the possibility for continuous progenitor cell recruitment and mature T-cell egress recordings in the same animal. Additional advantages of the system are the transparency of the grafted area, permitting macroscopic rapid monitoring of the implanted tissue, and the accessibility to the implant allowing for localized in addition to systemic treatments. The main limitation being the volume of the tissue that fits in the reduced space of the eye chamber which demands for lobe trimming. Organ integrity is maximized by dissecting thymus lobes in patterns previously shown to be functional for mature T-cell production. The technique is potentially suited to interrogate a milieu of medically relevant questions related to thymus function that include autoimmunity, immunodeficiency and central tolerance; processes which remain mechanistically poorly defined. The fine dissection of mechanisms guiding thymocyte migration, differentiation and selection should lead to novel therapeutic strategies targeting developing T cells.

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

The goal of the protocol is to show longitudinal intravital real-time tracking of thymocytes by laser scanning microscopy in thymic implants in the anterior chamber of the mouse eye. The transparency of the cornea and vascularization of the graft allows for continuously recording progenitor cell recruitment and mature T-cell egress.

في الوقت الحقيقي في فيفو تتبع الثيموسيه في الغرفة الأمامية للعين بالليزر الفحص المجهري

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell (EC) proliferation assays using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs) or isolated primary retinal ECs are widely used in vitro models to study retinal angiogenesis. However, isolating pure murine retinal endothelial cells is technically challenging and retinal ECs may have different proliferation responses than choroidal endothelial cells and different cell/cell interactions. A highly reproducible ex vivo choroidal sprouting assay as a model of choroidal microvascular proliferation was developed. This model includes the interaction between choroid vasculature (EC, macrophages, pericytes) and retinal pigment epithelium (RPE). Mouse RPE/choroid/scleral explants are isolated and incubated in growth-factor-reduced basal membrane extract (BME) (day 0). Medium is changed every other day and choroid sprouting is quantified at day 6. The images of individual choroid explant are taken with an inverted phase microscope and the sprouting area is quantified using a semi-automated macro plug-in to the ImageJ software developed in this lab. This reproducible ex vivo choroidal sprouting assay can be used to assess compounds for potential treatment and for microvascular disease research to assess pathways involved in choroidal micro vessel proliferation using wild type and genetically modified mouse tissue.

This protocol presents choroid sprouting assay, an ex vivo model of microvascular proliferation. This assay can be used to assess pathways involved in proliferating choroidal micro vessels and assess drug treatments using wild type and genetically modified mouse tissue.

Ex Vivo Choroid فحص من تكوين الأوعية الأوعية الدموية الدقيقة

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

الطبقة الظهارية الأحادية المشتقة من المواد العضوية: نموذج ذو صلة سريريا في المختبر لوظيفة الحاجز المعوي

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...