이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 보조금 RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 및 P3013330에 의해 지원되었다. 우리는 토굴 격리 프로토콜 개발에 소중한 의견을 미셸 휴스턴, 엘레나 Dhima 박사 안나 Velcich에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 직접 각각 해마 시설을 운영하는 당뇨병 교육 및 NIH P60DK20541 지원 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 연구 센터 박사 마이클 브라운 리 박사와 슈 리앙 뒤를, 감사합니다.

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 의학의 알버트 아인슈타인 대학의 동물 실험 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 크립트의 분리 및 문화 <ol><li> 소장에서 납골당의 분리 : <ol><li> 관심의 마우스 모델에서 장 지하실을 격리 할 것. 자궁 경부 전위 다음 CO 2와 쥐를 안락사. </li><li> 길이 방향으로 복부를 열고 얼음 차가운 인산염 완충 생리 식염수와 소장 (SI)를 작성, PBS (-ca 2 +; -Mg 2+) 2 배 항생제 항진균제 (안티 - 안티)와. 신속 소장을 격리 할 것. </li><li> 철저하게 메스를 사용하여 장간막 지방의 무료 해부. 조직을 관통하지 않도록주의 - 모든 시간은 얼음 차가운 PBS와 촉촉한 조직 유지에. INTE을 엽니 다스타 인 세로 방향으로 얼음 차가운 PBS로 깨끗이 씻어. </li><li> 미리 냉각 슬라이드를 사용하여 융모를 긁어 부드럽게, 두 부분으로 소장을 잘라 젖은면 팁을 사용하여 평평. 얼음처럼 차가운 PBS 여러 번에 적극적으로 씻으십시오. </li><li> 조직의 비 효소 분해에 대해 3mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) /0.5 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) 당 1X PBS 20 ㎖의 3 분 부화. </li><li> 미리 냉각 슬라이드에 면도날을 사용하여 작은 조각 (2-4mm)로 조직을 잘라. 20 ml의 빙냉 PBS를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 조각을 전송. </li><li> 피펫은 위아래로 부드럽게 10 배 10 ml의 멸균 일회용 피펫을 사용하여. 조직 조각이 중력에 의해 침전하자. 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 세 개의 추가 번 반복; 확인 상층 액은 분명합니다. </li><li> 2 mM의 EDTA 당 PBS의 20 ML을 추가합니다. 소용돌이와 부드러운 락을 30 분 동안 4 ° C에서 배양한다. </li><li> 조직 침전물을하자 상층 액을 제거한다. 15 ml의 얼음 차가운 PBS 및 피펫 추가위로 10ml를 피펫으로 5 배 아래로. 조직 파편이 침전물하자 분수 1 (F1)과 상층 액을 수집합니다. F2-F5, 별도로 관리 각 부분을 수집 반복합니다. </li><li> 15 초 동안 손으로 격렬하게 15 ml의 얼음 차가운 PBS이 때 흔들림을 추가합니다. , F8을 F6를 수집하고 F7을 위해 반복합니다. 조직 조각이 떠 시작하면, 그들이 정착하기 위해 누릅니다. </li><li> 현미경 각 부분의 나누어지는을 검사합니다. 지하실을 포함하는 분획 풀. </li><li> 50 ML 튜브에 지하실을 수집, 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 풀링 분수를 전달합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 100 XG에 원심 분리기, 15 ML 튜브에 2 배 안티 - 안티 및 전송 납골당 10 ml의 얼음 차가운 PBS에서 뜨는에 resuspend 펠렛을 폐기합니다. 세차를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 배 안티 - 안티 - 10 ml의 얼음처럼 차가운 ADF, 고급 DMEM / F-12 (둘 베코 &quot;의 수정 이글 중간 / 햄&quot;의 F-12)로 한 번 지하실을 씻으십시오. </li><li> 한 번 납골당 10 ㎖를 씻어DF는 - 안티 - 안티 1 배. </li><li> 혈구를 사용하여 지하실을 계산합니다. 토굴 솔루션 볼륨을 조정하고 재현 탁 최종 토굴 농도가 젤라틴 단백질 혼합물 (마트 리겔)의 50 μL 당 100 ~ 500 지하실 될 수 있도록 1.5 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 젤라틴 단백질 혼합물에서 4 ° C 및 재현 탁 지하실에서 5 분 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 접시 토굴 50㎕의 - 24 웰 플레이트에 웰 당 단백질 젤라틴 혼합물을 현탁액 (성장 면적 : 2cm 2), 신중을 각 웰의 중앙에 현탁액 드롭을 배치. , CO 2의 서스펜션은 굳은 ~ 30 분까지 37 ° C 배양기를 접시를 유지한다. </li><li> 500 μl의 빙냉 완전 배양 배지 (고급 DMEM / 1X 방지와 F12 추가 - 안티 10 mm로 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 1X 루타, 1X B27 보충, 1X N2 보충, 1mM의 N-L 아세틸 시스테인 (NAC), 50 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF), 100 / ㎖ ng를소량, 500 NG / ㎖의 R-Spondin). <ol><li> PBS 중 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 성장 인자를 재생성. </li></ol></li></ol></li><li> 크립트 Organoid 문화와 항로 : <ol><li> 항로 토굴 organoids 14-21일 포스트 시딩 (필요에 따라)은 다음과 같습니다 : <ol><li> 미디어 변경, 매주 금요일과 월요일. 수요일에, 새로운 미디어의 절반 미디어를 교체합니다. </li></ol></li><li> 문화 매체를 제거합니다. 5 분 간격으로 500 μL PBS로 두 번 샘플을 씻으십시오. </li><li> PBS를 제거하고 부드럽게 멸균 P1000 마이크로 피펫 팁을 사용하여 젤라틴 단백질 혼합물을 휴식. </li><li> 하나의 웰에 1 ml의 완전한 문화 매체를 추가하고 1 ml의 미디어 organoids를 재현 탁. </li><li> 부드럽게 피펫 팅과 20-30x 아래 P1000을 사용하여 organoids 중단 (일관성있는 기술까지 좋은 토굴 수익률 적절한 organoid 해리에 대한 현미경 검사 개발). </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 지하실로 이동;4 ° C, 5 분에 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 ml의 완전한 배양 배지로 두 번 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 웰 당 50 μl를 매트 리겔에서 필요에 재현 탁 지하실 등의 6 : 3 또는 1 : 1의 비율로 분할. (섹션 1.1.16-18) 전술 한 바와 같이 진행합니다. </li></ol></li><li> 크립트 Organoid 냉동 : <ol><li> 문화 매체를 제거합니다. 500 μL PBS에서 샘플을 씻으십시오. </li><li> P1000 피펫 팁을 사용하여 젤라틴 단백질 혼합물을 분산. </li><li> 하나의 웰에 1 ml의 미디어를 추가하고 1 ml의 미디어 organoids를 재현 탁. </li><li> 부드럽게 아래로 20-30x 피펫 팅에 의해 P1000을 사용하여 organoids를 휴식. </li><li> 1.5 ML 튜브에 organoids을 전송합니다. 4 ° C, 5 분 100 XG에 원심 분리기. </li><li> 1 ml의 완전한 배양 배지로 두 번 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 미디어를 동결 500 μL에 재현 탁의 지하실. </li><li> cryotube로 전송 지하실은 -80 ° C 냉동고 overni에 냉동 컨테이너 및 저장소에 튜브를 배치GHT. </li><li> 액체 N 2 탱크에 지하실을 전송합니다. <ol><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 해동하여 냉동 토굴 organoids를 복구 할 수 있습니다. 상기 한 바와 같이 100 XG, 젤라틴 단백질 혼합물에서 5 분 및 재현 탁하고, 문화 500 μL로 완전한 문화 번 미디어, 원심 분리기를 씻으십시오. 더 나은 복구의 경우, 냉동 미디어 ROCK 저해제 (Y-27632)를 추가합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 크립트 Organoid 대사 분석 <ol><li> 24 웰 플레이트 준비 : <ol><li> 분리 및 프로토콜 (토굴 격리 및 토굴 통로 섹션 1.2 섹션 1.1 참조)에 따라 납골당을 계산합니다. </li><li> 젤라틴 단백질 혼합물에 재현 탁의 지하실 (20 μL 당 100 ~ 200 납골당). </li><li> 24 웰 분석 플레이트 플레이트 토굴 - 젤라틴 단백질 혼합물 서스펜션 (각 샘플에 대한 최소한 삼중 거기 있는지 확인) 현탁액은 CO 2에서 37 ° C에서 응고시킬 것인큐베이터; 500 μL 전체 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> (1.1 절에 설명 된대로) 및 납골당이 완전히 개발 organoids으로 성장할 때까지 현미경으로 관찰 문화 지하실. </li></ol></li><li> 세포 외 유출 분석 : <ol><li> 밤새 비 이산화탄소 하이드레이트 카트리지 (0 %의 CO 2), 37 ° C 배양기. </li><li> 배지를 제거하고 500 ㎕의 DMEM 회 organoids 세척 (않고 : 글루코스, L 글루타민, 피루브산 나트륨 및 중탄산 나트륨과 함께 : 페놀 레드). 5 분을 기다립니다. </li><li> 각 웰에 잘 분석 매체 당 (DMEM 2 mM L- 글루타민 (L-glutamine), 5 mM의 D 글루코스) 675 μl를 추가합니다. </li><li> organoids 및 젤라틴 단백질 혼합물은 세척 후 손상되지 않도록 토굴 organoids 미세한 형태를 확인합니다. 비 CO 2에서 1 시간, 37 ° C 배양기를 품어. </li><li> 10 μM 주사 가능한 화합물 (oligomycin, 카보 시안화 메틸 -p- 플루오로 - 메 톡시 페닐 히드라 존 (FCCP)를 준비, Rotenone) 분석 배지에서. </li><li> 설정 카트리지를 카트리지 순차적으로 포트에 10 μM 주 화합물의 75 μl를로드하여 : 포트 - oligomycin을; 포트 B - FCCP; 및 포트 C는 - 로테 논 (분석 중 최종 농도 1 μM 될 것입니다). </li><li> 카트리지 30 분을 품어 - 37 ° C에서 1 시간을 비 CO 2 배양기에서. </li><li> 동시에, XF 분석기를 켜고 분석 프로토콜 템플릿을 만들 수 있습니다. </li><li> 카트리지를 &quot;보정&quot;XF 분석기로 카트리지와 유틸리티 플레이트를 삽입하고 실행합니다. </li><li> 그들은 젤라틴 단백질 혼합물에 부착되어 있는지 확인하기 위해 현미경 토굴 organoids를 확인합니다. </li><li> 악기와 실행 분석 프로토콜에로드 세포 배양 접시입니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li><li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer.">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells.">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li><li>Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells.">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC.">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7 (2013).</li><li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+changes+in+histone+modifications,+mRNA+levels,+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832/13+&#946;-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity.">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 &#946;-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li><li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro.">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li></ol>

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우리는 기저 속도 측정 후, 토굴 대사가 oligomycin, 카르 보닐 시아 나이드를 첨가하여 평가 하였다. 산소 소모율 (OCR) 및 8 개월 된 마우스로부터 단리 organoids 체외로 성장 소낭의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)를 테스트 순차적으로 -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)와 로테 논,. 29 분 (그림 2A와 2B) - 기저 OCR 및 기초 ECAR은 0에서 기록되었다. 29 일 분...

대장 암 (CRC)는 미국에서 암 관련 사망 원인 중 3 위를 차지한다. 산발적 인 대장 암은 - 즉 인생의 뒷부분에서 발생하는 (&gt; 50 세)와 명확한 걸리기 유전 적 요인과 -를 차지하고 ~ 강하게 장기식이 패턴 1, 2에 의해 영향을 발생으로 모든 경우의 80 %. 이 종양은 종양 세포의 증식 3-5의 높은 비율을 허용 아마도 운전하는 부분 (glutaminolysis을 통해) 사용 가능한 휴대 빌딩 블록과 에너지의 높은 농도를 만들 수 바르 부르크 효과로 알려진 산화 적 해당 작용에 대한 의존도를 향한 신진 대사 변화를, 전시 . 소장 암을 포함하여 대장 암에 대한 연구뿐만 아니라 다른 위장관 암 종양 형성의 원인으로 중요 통찰력을 제공. 탐지를 도울 수있다 위장 기관계의 정상 친 종양 및 종양 상태 사이의 차이를 조사 대사종양 발생에 대한 상대 위험뿐만 아니라 종양의 조기 발견 ermination. 또한, 미토콘드리아의 호흡과 당분을 포함하는 생체 에너지 대사를 이해하는 것은 세포 생리학, 노화 및 질병 상태가 장내 항상성을 교란하는 방법에 근본적인 통찰력을 제공 할 것입니다. 세포 외 플럭스 분석을위한 생체 에너지 분석 기술의 활용이 실시간으로 6,7 문화에서 성장 세포에서 동시에 미토콘드리아 호흡과 당분의 비율을 평가할 수 있습니다. 최근까지 소장의 시험 관내 연구는 양성 또는 악성 종양 중 -8,9- 유래 세포주에 한정되었고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 2009 년, 사토 등. (10)는 체외 배양 3 차원 (3D) 마우스 장내 상피 organoids를 성장 시스템, 또는 epith 소개실험 진단 및 치료 연구 (10, 11)에 적합 elial &quot;미니 용기&quot;. 또한, 열량 제한 쥐에서 분리 된 납골당은 문화 12 organoids 그들의 변화된 성장 특성을 유지한다. 형질 전환 된 세포주에 비해 토굴 organoid 배양 생체 상태를 이해하기 위해 훨씬 더 좋은 모델을 제시 생리 관련 데이터를 생성하는데 사용될 수있다. 우리는 장 토굴 organoids의 에너지 대사를 분석하는 생체 에너지 분석 기술을 적용. 마우스 장 토굴 organoids 제시 토굴 organoid 에너지 대사 연구 개발에 체외 배양 하였다. 산소 소비 속도 (OCR) 및 굴 organoids의 세포 외 산성화 레이트 (ECAR)가없는 두 개의 다른 대사 억제제 (oligomycin, 로테 논) 및 이온 담체 (보닐 시안화 메틸 -p- trifluoromethoxyphenylhydrazone)의 존재하에 측정 하였다. 토굴 ORGA이러한 화학 물질에 솔레노이드 대사 반응은 성공적으로 변화 ECAR 및 OCR 값을 반영했다. 셀룰러 바이오 에너지 연구는 암, 비만, 당뇨병, 대사 장애 및 미토콘드리아 질환 신진 대사 상태와 질병 위험과 표현형 사이의 상호 작용을 규명하고 병진 의학에 대한 직접적인 영향은 사전 심사 방법을 도움이 될 것입니다. 여기에, 우리는 상세한 프로토콜 소장 납골당을 분리하고 문화 토굴 organoids의 정보는 다음의 제품에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 대사 분석을 위해 토굴 organoid 문화를 사용하는 새로운 방법을 소개합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1633">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">356231</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">20012-027</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Advanced DMEM/F-12 (1X)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12634-028</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D5030</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Phenol Red sodium salt&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P4758</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) - step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15240-062&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X or 2 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Penicilin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15140-122</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">35050061</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15630-080</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">N-Acetyl-L-Cysteine, 25g</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A9165-25G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">100X N-2 supplement, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">50X B-27&#174; supplement minus Vitamin A, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12587-010</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug</td>
			<td style="width:229px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3474-RS-050&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 500 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine EGF, 100ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">315-09&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 50 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine Noggin, 20ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">250-38</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 100 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; L-glutamine, 200 mM</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">25030-081</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; Glucose powder</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15023-021</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Ambion&#174; 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">AM9260G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">DTT (Dithiothreitol), 1M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P2325</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A2058</td>
			<td style="width:456px;">0.1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">16000-044</td>
			<td style="width:456px;">1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recovery&#8482; Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12648-010</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">ROCK inhibitor (Y-27632)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">Y0503</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">O4876</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C2920</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Rotenone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R8875</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">221465</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 0.1 N in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td>
			<td style="width:229px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

소장 점막은 두 가지 기본적인 구조로 구성 반복적 인 구조 전시 : 융모, 장 내강으로 돌출 성숙 장 세포, 술잔 세포와 enteroendocrine 세포 구성을; 및 점막하 근육 판과, 은닉 성체 줄기 및 전구 세포 및 성숙한 Paneth 세포 근위뿐만 아니라 간질과 토굴 미세 환경의 면역 세포를있는 소낭. 지난 몇 년 전까지의 소장 시험 관내 연구에서 양성 또는 악성 종양 중 하나로부터 유래 된 세포주로 제한하고, 정상적인 장 상피의 생리 상주하는 미세 환경의 영향을 나타내지 않았다. 여기서 우리는 사토 등의 알에서 적응하는 방법. (2009) C57BL / 6 마우스에서 파생 된 기본 마우스 장 토굴 organoids을 배양를 보여줍니다. 또, 측정에 의해 실시간으로 토굴 대사 프로파일을 분석하는 토굴 organoid 배양의 사용을 제시기저 산소 소비, 당분 레이트, ATP 생산 및 호흡 능력, 표준. Organoids는 소스에 의해 정의 된 속성을 유지하고 산소 소비와 세포 외 산성화 속도에 의해 반사 된 대사 적응의 측면을 유지합니다. 이 토굴 organoid 문화 시스템에서 실시간 대사 연구는 토굴 organoid 에너지 대사를 연구하는 강력한 도구이며, 어떻게이 영양과 약물 학적 요인에 의해 변조 될 수 있습니다.

크립트 organoids 8 개월 된 C57BL / 6 마​​우스에서 설립되었다가 영양 76A (AIN76A)의 설치류 다이어트 미국 연구소 정제 먹인. 장 토굴 organoids는 하나의 토굴 (그림 1A, 하나의 빨간색 화살표)에서 연장 된 기간 동안 문화에서 재배 할 수있다. Organoids 문화 18 ~ 20 일 (그림 1B, 빨간색 화살표)를 토굴 같은 구조를 성장. 납골당은 모든 삼주 계​​대하고 organoids 효율적으로 각각의 ...

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Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

소장 토굴 organoids 줄기 세포와 그 틈새에 의존 소낭의 성장을 되풀이 조직 배양 시스템을 제공하는 생체 외 배양. 우리는 기본 마우스 토굴 organoids에 실시간으로 대사 프로파일을 분석하는 방법을 설립했다. 우리는 organoids 자신의 소스에 의해 정의 된 생리 학적 특성을 유지했습니다.

대사 프로파일의 실시간 분석<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 장내 크립트 Organoid 문화

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.1K 조회수.  Albert Einstein College of Medicine.  소장 토굴 organoids 줄기 세포와 그 틈새에 의존 소낭의 성장을 되풀이 조직 배양 시스템을 제공하는 생체 외 배양. 우리는 기본 마우스 토굴 organoids에 실시간으로 대사 프로파일을 분석하는 방법을 설립했다. 우리는 organoids 자신의 소스에 의해 정의 된 생리 학적 특성을 유지했습니다. 