מחקר זה נתמך על ידי מענקי RO1 CA 135,561, R01 CA151494, R01 CA174432 וP3013330 מהמכונים הלאומי לבריאות. ברצוננו להודות למישל יוסטון, אלנה Dhima וד&quot;ר אנה Velcich על הערותיהם מועילות בפיתוח פרוטוקול בידוד קריפטה. אנו מודים גם להדרכת הסוכרת ומרכז המחקר של אלברט איינשטיין קולג &#39;לרפואה נתמך על ידי NIH P60DK20541, וד&quot;ר מיכאל בראונלי וד&quot;ר Xue-יאנג Du, שינחה ויפעיל את מתקן סוסון הים, בהתאמה.

מחקר זה בוצע בהתאם להמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אלברט איינשטיין קולג &#39;לרפואה. 1. בידוד קריפטה ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של מאורות מהמעי הדק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד מאורות מעיים מכל מודל עכברים של עניין. להרדים את העכברים עם CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בטן אורכית ולמלא את המעי דק (SI) עם פוספט הקר כקרח שנאגרו, PBS (-Ca 2 +; -Mg 2+) עם (אנטי-אנטי) אנטיביוטיקה antimycotic 2x. מהירות לבודד מעי דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לנתח ללא שומן mesenteric באמצעות אזמל. היזהר שלא לנקב את הרקמה - בכל העת לשמור על הרקמה לחה עם PBS הקר כקרח. פתח את inteStine אורכית ולשטוף ביסודיות עם קרח הקר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך מעי דק לשני חלקים ולרדד באמצעות קצה צמר גפן רטוב, בעדינות לגרד את villi באמצעות שקופיות מקוררות מראש. לשטוף במרץ כמה פעמים PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 דקות ב 20 מיליליטר 1x PBS לכל חומצת ethylenediaminetetraacetic 3 מ&quot;מ (EDTA) /0.5 dithiothreitol מ&quot;מ (DTT) לניתוק אינו אנזימטית של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך ברקמה לחתיכות קטנות (2-4 מ&quot;מ) באמצעות סכין גילוח בשקופית מקורר מראש. העבר את החתיכות לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר קר PBS קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מעלה ומטה בעדינות 10x באמצעות פיפטה חד פעמית סטרילי 10 מיליליטר. בואו ברי רקמה משקעים על ידי כוח הכבידה. הסר את supernatant עם טפטפת. חזור שלוש פעמים נוספות; להפוך את supernatant בטוח הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מיליליטר של PBS לכל 2 מ&quot;מ EDTA. מערבולת ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם נדנדה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו משקעי רקמות ולהשליך supernatant. להוסיף 15 מיליליטר קרח PBS ופיפטה הקריםלמעלה ולמטה 5x עם פיפטה 10 מיליליטר. בואו ברי רקמת משקעים ולאסוף את supernatant כבר 1 (F1). חזור על איסוף F2-F5, כל חלקן בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 15 מיליליטר קרח הקר PBS ולרעוד הפעם במרץ ביד במשך 15 שניות. לאסוף F6 ולחזור לF7, F8. אם חתיכות רקמה מתחילות לצוף, הקש כדי לעזור להם להתיישב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק aliquot של כל חלק מתחת למיקרוסקופ. בריכת שברים המכילים כוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את השברים ונקוו דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר, איסוף מאורות בשפופרת 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בלמשך 5 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, זורקת את כדור supernatant וגלול ב-10 PBS קר כקרח מיליליטר עם מאורות אנטי-אנטי והעברת 2x לצינור 15 מיליליטר. חזור על לשטוף עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מאורות פעם אחת עם 10 מיליליטר ADF קר כקרח, מתקדם DMEM / (&quot;נשר בינוני / חם של שינוי&quot; Dulbecco של F-12) F-12 - 2x אנטי-אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מאורות פעם אחת עם 10 מיליליטרDF - 1x אנטי-אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מאורות באמצעות hemocytometer. התאם את קריפטה פתרון הנפח ומעביר לצינור 1.5 מיליליטר, כך שריכוז קריפטה הסופי כאשר resuspended יהיה 100-500 מאורות לכל 50 μl של תערובת דביקה חלבון (Matrigel). צנטריפוגה בלמשך 5 דקות 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס ומאורות גלולים בתערובת החלבונים הדביקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 50 μl של קריפטה - השעיה תערובת חלבונים דביקה לכל גם בצלחת 24 גם (אזור גידול: 2 סנטימטר 2), הצבה בזהירות טיפת ההשעיה במרכז כל אחד. לשמור את הצלחת בCO 2, 37 ° C חממה ל~ 30 דקות עד שההשעיה מתמצקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 מדיה μl תרבות השלמה קרה כקרח (מתקדם DMEM / F12 עם אנטי 1x - אנטי, 10 מ&quot;מ 4 (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x Glutamax, מוסף 1x B27, מוסף 1x N2, 1 מ&quot;מ N-Acetyl-L-ציסטאין ng / ml (NAC), 50 ng / ml גורם גדילה באפידרמיס (EGF), 100גולגולת של, R-Spondin 500 ng / ml). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש גורמי גדילה ב0.1% הסרום אלבומין שור (BSA) ב- PBS. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריפטה Organoid תרבות ומעבר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> organoids קריפטה לאחר זריעת 14-21 יום מעבר (או לפי צורך) באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת שינוי בכל יום שישי וביום שני. בימי רביעי, להחליף מחצית התקשורת עם תקשורת טרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות. לשטוף את המדגם פעמיים עם 500 μl PBS ב 5 דקות במרווחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ועדינות לשבור את תערובת חלבונים הדביקה באמצעות קצה פיפטה מייקר P1000 סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה תרבות 1 מיליליטר מלאה וליחיד וresuspend organoids ב 1 מיליליטר תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשבש organoids באמצעות P1000 על ידי pipetting למעלה ולמטה 20-30x (לבדוק מתחת למיקרוסקופ לניתוק organoid נכון עם תשואת קריפטה טובה עד שיטה עקבית מפותח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המאורות לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge;צנטריפוגות ב 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור פעמיים עם 1 מיליליטר תקשורת ותרבות שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול ביחס של 1: 3 או 1: 6 במידת צורך מאורות resuspending, ב -50 μl Matrigel לכל טוב. המשך כפי שתואר לעיל (סעיף 1.1.16-18). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפאת Organoid קריפטה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות. לשטוף את המדגם ב500 μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר את תערובת חלבונים הדביקה באמצעות קצה פיפטה P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר תקשורת ולאחת וresuspend organoids ב 1 מיליליטר תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשבור את organoids באמצעות P1000 על ידי pipetting למעלה ולמטה 20-30x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את organoids לצינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 100 XG ב 4 מעלות צלזיוס, 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור פעמיים עם 1 מיליליטר תקשורת ותרבות שלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאורות גלולים ב500 μl הקפאת תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מאורות לcryotube, במקום הצינור במכל וחנות הקפאה ב-80 ° C מקפיא overnight. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הכוכים לN 2 טנק נוזלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר organoids קריפטה קפואה במהירות הפשרה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לשטוף עם 500 μl מדיה מלאה תרבות אחת, צנטריפוגות ב 100 XG, 5 דקות וגלולות בתערובת חלבונים דביקה, ותרבות כפי שתואר לעיל. להתאוששות טובה יותר, להוסיף מעכב רוק (Y-27632) לתקשורת ההקפאה. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. קריפטה Organoid מטבוליזם Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת צלחת 24 גם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד ולספור מאורות בהתאם לפרוטוקול (ראה סעיף 1.1 לבידוד קריפטה וסעיף 1.2 למעבר קריפטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאורות גלולים בתערובת חלבונים דביקה (100-200 מאורות לכל 20 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה צלחת קריפטה-דביקה תערובת חלבונים בצלחת 24 גם assay (לוודא שיש בtriplicates לפחות עבור כל דגימה) ולאפשר ההשעיה לבסס על 37 מעלות צלזיוס בCO 2חממה; לאחר מכן להוסיף 500 μl תקשורת ותרבות השלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאורות תרבות (כמפורט בסעיף 1.1) ולבחון תחת מיקרוסקופ עד מאורות לגדול לתוך organoids פותח באופן מלא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי השטף Assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחסנית מימה הלילה ב2 אינם CO (0% CO 2), 37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מדיום התרבות ולשטוף organoids פעמיים עם 500 DMEM μl (בלי: גלוקוז, L- גלוטמין, פירובט נתרן וסודיום ביקרבונט, ועם: פנול אדום). חכה 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 675 μl לבינוני גם assay (DMEM עם 2 המ&quot;מ L- גלוטמין ו5 מ&quot;מ D-גלוקוז) זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק המורפולוגיה המיקרוסקופית organoids קריפטה כדי להבטיח שorganoids ותערובת החלבונים הדביקה לא ניזוקו לאחר שטיפה. דגירה 1 שעה שבאינו CO 2, 37 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיקרומטר תרכובות להזרקה (oligomycin, קרבוניל ציאניד-p-trifluoro-פניל-hydrazone methoxy (FCCP), rotenone) במדיום assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת המחסנית על ידי טעינת 75 μl של 10 מיקרומטר תרכובות להזרקה ליציאות ברצף המחסנית: נמל - oligomycin; הנמל B - FCCP; והנמל C - rotenone (הריכוזים הסופיים במהלך assay יהיה 1 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דקות 30 מחסנית - שעת 1 ב 37 ° C בחממת 2-CO שאינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, מפעיל את מנתח XF וליצור תבנית פרוטוקול assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מחסנית וצלחת שירות לXF Analyzer ולהפעיל &quot;לכייל&quot; מחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק organoids קריפטה מיקרוסקופית כדי לוודא שהם מחוברים לתערובת החלבונים הדביקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת תרבית תאי עומס לפרוטוקול assay המכשיר ולהפעיל. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).</li><li>Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eating+patterns+and+risk+of+colon+cancer.">Eating patterns and risk of colon cancer.</a> Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).</li><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+cells.">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li><li>Coles, N. W., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+metabolism+in+Ehrlich+ascites-carcinoma+cells.">Glutamine metabolism in Ehrlich ascites-carcinoma cells.</a> Biochem J. 83, 284-291 (1962).</li><li>Medina, M. A., Castro I, N. u. n. e. z. d. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaminolysis+and+glycolysis+interactions+in+proliferant+cells.">Glutaminolysis and glycolysis interactions in proliferant cells.</a> Int J Biochem. 22, 681-683 (1990).</li><li>Anso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+changes+in+cancer+cells+upon+suppression+of+MYC.">Metabolic changes in cancer cells upon suppression of MYC.</a> Cancer Metab. 1, 7 (2013).</li><li>Malmgren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinate+changes+in+histone+modifications,+mRNA+levels,+and+metabolite+profiles+in+clonal+INS-1+832/13+&#946;-cells+accompany+functional+adaptations+to+lipotoxicity.">Coordinate changes in histone modifications, mRNA levels, and metabolite profiles in clonal INS-1 832/13 &#946;-cells accompany functional adaptations to lipotoxicity.</a> J Biol Chem. 288 (17), 11973-11987 (2013).</li><li>Whitehead, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice.">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li><li>Roig, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+epithelial+cells+derived+from+human+colon+biopsies+express+stem+cell+markers+and+differentiate+in+vitro.">Immortalized epithelial cells derived from human colon biopsies express stem cell markers and differentiate in vitro.</a> Gastroenterology. 138 (3), 1012-1021 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+LGR5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake.">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li></ol>

אין גילויים.

בדקנו את שיעור צריכת חמצן (OCR) והמחיר תאי החמצה (ECAR) של מאורות מבודדים מעכברים בן 8 חודשים וגדלו והפכו לorganoids ex vivo. לאחר המדידה של קצב הבסיסי, חילוף החומרים קריפטה הוערך על ידי הוספת oligomycin, ציאניד קרבוניל -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) וrotenone, ברצף. <p class="jove_content" style=";text-align:ri...

סרטן מעי גס (CRC) הוא הגורם המוביל השלישי של מקרי מוות מסרטן הקשורים בארצות הברית. סרטן מעי גס לא סדיר - כלומר, שנובע מאוחר יותר בחיים (&gt; 50 שנים) וללא גורמים גנטיים לנטייה ברורה - חשבונות ל~ 80% מכל המקרים, עם שכיחות מאוד מושפעות דפוסי תזונה ארוך טווח 1,2. גידולים אלה תערוכת משמרת חילוף חומרים לכיוון התלות בגליקוליזה חמצוני, הידוע בשם האפקט ורבורג, שעשוי בחלק לעשות ריכוזים גבוהים יותר של בלוקים סלולריים בניין זמינים ואנרגיה (באמצעות glutaminolysis) להתיר ואולי לנהוג שיעור גבוה של תאים סרטניים התפשטות 3-5 . מחקרים של סרטן המעי הגס, כמו גם סוגי סרטן אחרים במערכת העיכול, כולל סרטן המעי דק מספקים תובנה חשובה לסיבת היווצרות גידול. חוקר את ההבדלים מטבוליים בין מדינות נורמליות, פרו-סרטניות וסרטניות של מערכות איברים במערכת העיכול עשוי לסייע determination של סיכון יחסי להתפתחות גידולים, כמו גם גילוי המוקדם של גידולים. יתר על כן, הבנת חילוף חומרים ביו-אנרגטיים הכוללים נשימה וגליקוליזה המיטוכונדריה תספק תובנה בסיסית לתוך איך מדינת פיזיולוגיה של תא, הזדקנות והמחלה מדאיגה את הומאוסטזיס מעיים. ניצול של טכנולוגית assay ביו-האנרגיה לניתוח שטף תאי יכול להעריך את השיעורים של נשימה וגליקוליזה המיטוכונדריה בו זמנית בתאי גידול בתרבות בזמן אמת 6,7. עד לאחרונה, מחקרים במבחנה של מעי דק היו מוגבלים לשורות תאים שמקורם בגידולים או שפיר או ממאיר 8,9 ואינו מייצגים את הפיסיולוגיה של אפיתלים מעיים רגילים ואת השפעתם של מייקרו-הסביבה שבה הם מתגוררים. בשינה 2009, סאטו et al. 10 הציג מערכת ex vivo תרבות לגדול organoids אפיתל במעי עכבר תלת-ממדי (3D), או epith&quot;מיני-אומץ&quot; elial, מתאים לחקירות ניסיוניות, אבחון וטיפול 10,11. יתר על כן, מאורות מבודדים מעכברים מוגבלים calorically לשמור על מאפייני הצמיחה שינו כorganoids בתרבויות כגון 12. בהשוואה לשורות תאים הפכו, ניתן להשתמש תרבויות organoid קריפטה להפיק נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הצגת מודל הרבה יותר טוב כדי להבין את מצב in vivo. מתאמנים את טכנולוגיית ניתוח ביו-אנרגיה לassay חילוף חומרים של אנרגיה של organoids קריפטה מעיים. organoids קריפטה המעיים העכבר היה בתרבית ex vivo לפתח מחקרי חילוף חומרים של אנרגיית קריפטה organoid הוצגו. שיעור צריכת החמצן (OCR) והמחיר תאי החמצה (ECAR) של organoids קריפטה נמדדו בהעדר ונוכחותם של שני מעכבים שונים חילוף חומרים (oligomycin, rotenone) ונושאת יון (ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone קרבוניל). Orga קריפטהתגובה המטבולית noid לתרכובות כימיות אלה באו לידי ביטוי בהצלחה באמצעות ECAR משתנה וערכי OCR. מחקרים ביו-אנרגטיים תאיים יבהירו את יחסי הגומלין ההדדיים בין מצב מטבולים וסיכון למחלות ופנוטיפ בסרטן, השמנת יתר, סוכרת, הפרעות בחילוף חומרים ומחל מיטוכונדריאליות ולעזור שיטות הקרנה מראש עם השלכות ישירות על רפואת translational. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבודד את מאורות מעי דקים וorganoids קריפטה התרבות. יתר על כן, אנו מציגים שיטה חדשה לשימוש תרבויות organoid קריפטה למבחנים מטבולים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1633">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">BD Matrigel Basement Membrane Matrix, GFR, Phenol Red-free, LDEV-free</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:135px;">356231</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">PBS (phosphate buffered saline), no magnesium, no calcium, pH 7.2</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">20012-027</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Advanced DMEM/F-12 (1X)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12634-028</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Dulbecco&#8242;s Modified Eagle&#8242;s Medium without glucose, L-glutamine, Phenol Red, sodium pyruvate and sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">D5030</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Phenol Red sodium salt&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">P4758</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 15 mg / L in DMEM (D5030) - step 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X, 100ml</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15240-062&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X or 2 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Penicilin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15140-122</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">35050061</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid), 1 M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15630-080</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">N-Acetyl-L-Cysteine, 25g</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A9165-25G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">100X N-2 supplement, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">17502-048</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">50X B-27&#174; supplement minus Vitamin A, liquid</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:135px;">12587-010</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Mouse R-Spondin 1, CF, 50ug</td>
			<td style="width:229px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:135px;">3474-RS-050&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 500 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine EGF, 100ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">315-09&#160;</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 50 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recombinant Murine Noggin, 20ug&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Peprotech</td>
			<td style="width:135px;">250-38</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 100 ng / mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; L-glutamine, 200 mM</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">25030-081</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Gibco&#174; Glucose powder</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">15023-021</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Ambion&#174; 0.5 M EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">AM9260G</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM for step 1.1.5; 2 mM for step 1.1.8&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">DTT (Dithiothreitol), 1M</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P2325</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">A2058</td>
			<td style="width:456px;">0.1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">16000-044</td>
			<td style="width:456px;">1 % in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Recovery&#8482; Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:229px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">12648-010</td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">ROCK inhibitor (Y-27632)&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">Y0503</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">O4876</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Carbonyl cyanide-p-trifluoro-methoxy-phenyl-hydrazone (FCCP)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">C2920</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Rotenone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">R8875</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 1 &#181;M&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:135px;">221465</td>
			<td style="width:456px;">Final Concentration 0.1 N in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:815px;">XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td>
			<td style="width:229px;">Seahorse Bioscience</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:456px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real time analysis of metabolic profile in ex vivo mouse intestinal crypt organoid cultures

רירית המעי הקטנה מציגה ארכיטקטורה חוזר על עצמו מחולק לשני מבנים בסיסיים: villi, מקרינים לתוך חלל המעי ומורכב מenterocytes הבוגר, תאי גביע ותאי enteroendocrine; ובכוכים, המתגוררים הפרוקסימלי לsubmucosa וmuscularis, חסת גזע בוגרים ובתאים ותאים הבוגר פנט, כמו גם סטרומה ותאי חיסון של מייקרו-סביבת קריפטה. עד השנים האחרונות, במחקרי מבחנה של מעי דק היה מוגבל לשורות תאים שמקורם בגידולים או שפיר או ממאיר, ואינו מייצג את הפיסיולוגיה של אפיתלים מעיים רגילים ואת השפעתם של מייקרו-הסביבה שבה הם מתגוררים. הנה, אנחנו מדגימים שיטה המותאמת מאל סאטו ואח. (2009) לculturing organoids קריפטה העיקרי מעיים עכבר נגזר מעכברי C57BL / 6. בנוסף, אנו מציגים את השימוש בתרבויות organoid קריפטה לassay הפרופיל המטבולי קריפטה בזמן אמת על ידי מדדment של הצריכה בסיסית חמצן, קצב glycolytic, ייצור ATP ויכולת נשימה. Organoids לשמור על מאפיינים שהוגדרו על ידי המקור שלהם ולשמר היבטים של ההסתגלות המטבולית שלהם באו לידי ביטוי בצריכת חמצן ושיעורי החמצה תאיים. מחקרים מטבוליים בזמן אמת בorganoid מערכת תרבות קריפטה זה הם כלי רב עוצמה כדי לחקור את חילוף החומרים של אנרגיית organoid קריפטה, ואיך זה יכול להיות מווסת על ידי גורמים תזונתיים ותרופתיים.

organoids קריפטה הוקמו מ8 חודש C57BL / 6 עכברים ישנים האכיל מטוהר דיאטה מכרסם מכון לתזונת 76A (AIN76A) אמריקאי. ניתן לגדל organoids קריפטה מעיים בתרבות לפרקי זמן ארוך מכוך בודד (איור 1 א, חץ אדום יחיד). Organoids לצמוח מתוך מבנים דמויים מערים ב18-20 ימים בתרבות (איור 1, חיצים אד?...

Watch this Scientific Journal Video about Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures at JoVE.com

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

organoids קריפטה מעי הדק תרבית ex vivo לספק מערכת תרבית רקמה שמשחזרת צמיחה של מאורות תלויים בתאי גזע והנישה שלהם. הקמנו שיטה לassay הפרופיל המטבולי בזמן אמת בorganoids קריפטה עכבר העיקרי. מצאנו organoids לשמור על מאפיינים פיסיולוגיים שהוגדרו על ידי המקור שלהם.

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

real-time-analysis-metabolic-profile-ex-vivo-mouse-intestinal-crypt

Research

JoVE Journal

Biology

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

16.1K Views.  Albert Einstein College of Medicine.  organoids קריפטה מעי הדק תרבית ex vivo לספק מערכת תרבית רקמה שמשחזרת צמיחה של מאורות תלויים בתאי גזע והנישה שלהם. הקמנו שיטה לassay הפרופיל המטבולי בזמן אמת בorganoids קריפטה עכבר העיקרי. מצאנו organoids לשמור על מאפיינים פיסיולוגיים שהוגדרו על ידי המקו...

Video: Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

בזמן אמת In Vivo הקלטה של תודרנית סידן אותות שהאכילה חרקים באמצעות ביוסנסור פלורסנט

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell (EC) proliferation assays using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs) or isolated primary retinal ECs are widely used in vitro models to study retinal angiogenesis. However, isolating pure murine retinal endothelial cells is technically challenging and retinal ECs may have different proliferation responses than choroidal endothelial cells and different cell/cell interactions. A highly reproducible ex vivo choroidal sprouting assay as a model of choroidal microvascular proliferation was developed. This model includes the interaction between choroid vasculature (EC, macrophages, pericytes) and retinal pigment epithelium (RPE). Mouse RPE/choroid/scleral explants are isolated and incubated in growth-factor-reduced basal membrane extract (BME) (day 0). Medium is changed every other day and choroid sprouting is quantified at day 6. The images of individual choroid explant are taken with an inverted phase microscope and the sprouting area is quantified using a semi-automated macro plug-in to the ImageJ software developed in this lab. This reproducible ex vivo choroidal sprouting assay can be used to assess compounds for potential treatment and for microvascular disease research to assess pathways involved in choroidal micro vessel proliferation using wild type and genetically modified mouse tissue.

This protocol presents choroid sprouting assay, an ex vivo model of microvascular proliferation. This assay can be used to assess pathways involved in proliferating choroidal micro vessels and assess drug treatments using wild type and genetically modified mouse tissue.

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, prevent fracture. In the interest to both optimize peak bone mass and combat various musculoskeletal diseases (i.e., post-menopausal osteoporosis, anorexia nervosa, type 1 and 2 diabetes mellitus), incredible efforts have been made in the field of bone biology to fully characterize osteoblasts throughout their differentiation process. Given the primary role of mature osteoblasts to secrete matrix proteins and mineralization vesicles, it has been noted that these processes take an incredible amount of cellular energy, or adenosine triphosphate (ATP). The overall cellular energy status is often referred to as cellular bioenergetics, and it includes a series of metabolic reactions that sense substrate availability to derive ATP to meet cellular needs. Therefore, the current method details the process of isolating primary, murine bone marrow stromal cells (BMSCs) and monitoring their bioenergetic status using the Real-time cell metabolic flux analyzer at various stages in osteoblast differentiation. Importantly, these data have demonstrated that the metabolic profile changes dramatically throughout osteoblast differentiation. Thus, using this physiologically relevant cell type is required to fully appreciate how a cell's bioenergetic status can regulate the overall function.

Real-time cell metabolic flux assay measures the oxygen consumption rate and extracellular acidification rate, which corresponds to mitochondrial and glycolytic adenosine triphosphate production, using pH and oxygen sensors. The manuscript explains a method to understand the energy status of osteoblasts and the characterization and interpretation of the cellular bioenergetic status.

שימוש במנתח שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביו-אנרגיה של אוסטאובלסט

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...