This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. توليف 10 نانومتر الذهب النانوية (الذهب NPS) 15 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل A: إضافة 2 مل 1٪ مائي كلوريد الذهب إلى 160 مل ملي-Q، أو مزدوج المقطر والماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل ب: إضافة 8 مل 1٪ ثلاثي الصوديوم سترات × 2 H 2 O وحمض التانيك 160 ميكرولتر 1٪ إلى 32 مل ملي-Q، أو مزدوج المقطر والماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء حل A و B إلى 60 درجة مئوية، ومزجها مع التحريك. نلاحظ اللون الأزرق الداكن على الفور. لاحظ اللون الأحمر بعد حوالي 15 دقيقة. ثم تسخين إلى 95 ° C، والحفاظ 5 دقائق وتبريد حل لRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من تعليق NP على شبكة الكربون المغلفة والسماح ليجف في الهواء. التحقق من حجم والتشكل مصادر القدرة النووية بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. </li></ol> 2. طلاء من الذهب مصادر القدرة النووية مع BSA وصفها مع رودامين N-hydroxysuccinimidyl استر (NHS) 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 900 ميكرولتر مصادر القدرة النووية الذهب إلى 1.5 مل إيبندورف أنبوب، الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 30 دقيقة. المرجعدوليا هو، وإعداد أنابيب متعددة يجوز دفعة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، وإعادة تعليق بيليه في 900 ميكرولتر تعقيم المياه ملي-Q وإضافة 100 ميكرولتر 2 ملغ / مل BSA / PBS، مزيج على دوامة في 800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة الزائد BSA، أجهزة الطرد المركزي في إعداد 15،000 x ج لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، وإعادة تعليق مصادر القدرة النووية الذهب BSA في 125 ميكرولتر PBS، إضافة 12.5 ميكرولتر من 1 M بيكربونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فورا قبل الاستخدام، ويعد حل 10 ملغ / مل من رودامين NHS / DMSO، إضافة 30 ميكرولتر من رودامين NHS حل / DMSO إلى 1ml من تعليق الذهب BSA مصادر القدرة النووية. احتضان رد فعل لمدة 2 ساعة (أو O / N) في RT خلال 800 دورة في الدقيقة الاختلاط، وتجنب التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الذهب NPS-BSA-رودامين من خلال غسيل الكلى ضد PBS في 4 درجة مئوية مع 5 التغييرات عازلة خلال الفترة من 36 - 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق الاستقرار في مصادر القدرة النووية، إضافة 10 ميكرولتر من 200 ملغ / مل BSA / PBS في كل 1 مل مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين. لإزالة أجهزة الطرد المركزي مجانا أو الإفراج عنهم BSA-رودامين، في 15،000 x ج لمدة 60 دقيقة. Resuspend وبيليه في 2 ملغ / مل BSA / PBS، وقياس OD 520، وتخزينها في 4 ° C، وتجنب التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع مصادر القدرة النووية 10 مرات مع ميلي-Q أو الماء المقطر مزدوج، إضافة قطرة على شبكة المغلفة الكربون، والسماح ليجف في الهواء. التحقق من حجم ومورفولوجية مصادر القدرة النووية بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). تم تعقيمها جميع المواد التي تستخدم في إعداد NP وأجريت العملية في غطاء ثقافة الخلية أو على مقاعد البدلاء بجانب لهب: ملاحظة. </li></ol> 3. ثقافة خلايا هيلا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا هيلا معربا عن LAMP1-GFP بشكل دائم يتم تربيتها في DMEM مع المصل 10٪ العجل الجنين (FCS) ونمت عند 37 درجة مئوية في جو تحتوي على 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 50،000 لكل بئر في 8 جيد غرفة الشريحة (Ibidi)، واحتضان O / N. </li></ol> 4. ثقافة البكتيريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية NCTC 12023 فيلد من نوع (WT) سلالة. وعلى سبيل المقارنة، واستخدام سلالات متحولة Δ ssaV المعيبة في SPI2-T3SS وΔ سيفا تفتقر المستجيب رئيسيا سيفا لSIF. استخدام سلالات إيواء بلازميد pFPV25.1 للتعبير التأسيسي من تعزيز GFP. ملاحظة: سلالات جرثومية يتم تربيتها بشكل روتيني في لوريا، BERTANI مرق (LB) مع اضافة 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين (WT) وLB مع اضافة 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين و / أو 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (Δ ssaV، Δ سيفا ) من المطلوب للحفاظ على البلازميدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم مستعمرة واحدة من البكتيريا في 3 مل LB مع المضادات الحيوية المناسبة وتنمو O / N في 37 درجة مئوية تحت ظروف اهتزاز للتهوية، ثم تمييع 01:31 في LB جديدة ومواصلة نمو 3.5 ساعة. في هذه النقطة الوقت، والثقافات تصل إلى مرحلة سجل في وقت متأخر والبكتيريا والغازية للغاية. A &#39;طبل الأسطوانة &quot;هو ملائم لاحتضان الثقافات أنبوب اختبار مع التهوية. </li></ol> 5. العدوى من خلايا هيلا بواسطةالسالمونيلا والذهب BSA-رودامين مصادر القدرة النووية نبض تشيس وضع العلامات (انظر الشكل 1 للمخطط) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 من البكتيريا شبه مثقف وتمييع لOD 600 = 0.2 في 1 مل PBS (~ 3 × 10 8 وت م / مل)، إضافة الكميات المناسبة من البكتيريا إلى خلايا هيلا في الشرائح غرفة 8-جيدا لتحقيق تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 30 دقيقة في الحاضنة خلية، وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة البكتيريا غير المنضوية (تم تعيين هذه النقطة الوقت ك 0 ساعة بعد العدوى، أو 0 ساعة بي). إضافة 300 ميكرولتر من مستنبت الطازجة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين والحفاظ لمدة 1 ساعة. ثم استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة تحتوي على 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لبقية فترة حضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لمدة 1 ساعة، يتم استبدال المتوسطة عن طريق التصوير المتوسطة (النسور MEM دون FCS، L-الجلوتامين، الفينول الحمراء وبيكربونات الصوديوم، مع 30 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4) شاركntaining 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. تضاف NPS-الذهب BSA-رودامين إلى خلايا هيلا للحصول على التركيز النهائي من OD 520 = 0.1. ملاحظة: يمكن أيضا إضافة مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين إلى الخلايا قبل الإصابة، أو في مختلف نقاط في الوقت بي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة الحضانة، وإزالة المتوسطة، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة التصوير الطازجة تحتوي على 10٪ FCS و 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لبقية فترة حضانة. ملاحظة: مدة حضانة المرض قد تختلف اعتمادا على تركيز تلك المصادر وخطوط الخلايا المستخدمة. لالضامة RAW264.7، لاحظنا أن 30 دقيقة الحضانة مع مصادر القدرة النووية بتركيز OD 520 = 0.05 يسمح استيعاب كافية. </li></ol> 6. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نظام التصوير متحد البؤر مثل متحد البؤر الليزر المسح الضوئي (CLSM) أو قرص الغزل (SD) المجهر مع الغرفة البيئية مرطب للالتصوير عالية الدقة على مختلف نقاط الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على درجات الحرارة جontrol النظام والانتظار حتى أنها مستقرة. تحسين إعدادات التصوير مثل التكبير، سرعة المسح الضوئي، والقرار، Z-كومة الخ استخدام إعدادات الإثارة / الانبعاثات المناسبة لGFP ومصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين. لهذا البروتوكول، استخدم 400 هرتز سرعة المسح الضوئي، وقرار من 512 × 512 بكسل وحجم Z-خطوة من 0.25 ميكرون. تثير GFP والذهب-BSA-رودامين باستخدام الليزر هارون (488 نانومتر) والليزر الحنة (543 نانومتر)، على التوالي. تشمل مشرق الميدان (BF) قناة لرصد شكل الخلايا. لغيرها من نظم المجهري والشروط العدوى، والإعداد يجب أن يتم تعديلها وفقا لذلك. ملاحظة: استخدم نفس الليزر AR كمصدر للضوء من قناة BF وإشارة تم الكشف مع صورة المضاعف (PMT) كاشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت المشار إليه نقاط بي، جبل الشرائح الغرفة 8 جيدا تحتوي على الخلايا المصابة على المسرح المجهر والصور قياسية. </li></ol> 7. تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برامج التحليل المجهري صورة (انظر <stronز&gt; مواد ومعدات الجدول) للتحليل في إعادة بناء نظام إندو الليزوزومية من قبل الخلايا السالمونيلا. فتح البيانات عن طريق النقر على &#39;فتح&#39; واختيار الملف. ملاحظة: بدلا من ذلك، مفتوحة حزم برمجيات المصدر مثل يماغيج أو فيجي يمكن أن تستخدم لصورة الكمية تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في شريط الأدوات كائنات من فق رأي انقر على أيقونة <img alt="رمز" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" /> لإضافة عنصر سطح جديد. انقر على <img alt="رمز" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (التالى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، حدد جزء من العائد على الاستثمار. في منطقة المشاهدة، قسم تحدها المستطيل مضافين على الصورة ويمثل العائد على الاستثمار. أدخل القيم في X- المقابلة، Y-، وحقول Z-، أو النقر مباشرة على الأسهم في المعاينة المستطيل لتعديل حجم وموضع من العائد على الاستثمار. ثم انقر فوق <img alt="رمز" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ الملفات / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg&quot; /&gt; (التالي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كقناة المصدر، حدد القناة 3 (إشارة للذهب-BSA-رودامين NPS). التحقق من الخيار السلس لإعداد نعومة المنطقة الناتجة عن ذلك. تعريف قيمة يدويا أو قبول القيمة التي تنشأ تلقائيا. للعتبة، حدد الخيار كثافة المطلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعديل العتبة، حدد الخيار اليدوي وتعيين قيمة. في مساحة العرض، يتم عرض معاينة عتبة السطح في الرمادي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على علامة التبويب صنف السطوح السطح الناتجة يمكن أن تتم تصفيته وفقا لمعايير مختلفة. مرشح الافتراضي هو يمكن أيضا أن يدرج &#39;عدد من voxels&gt; 10&#39;، وغيرها من المرشحات بواسطة الضغط على &#39;إضافة&#39;. إذا كان الترشيح ليست ضرورية، ثم حذف جميع المرشحات عن طريق النقر على زر حذف. انقر <img alt="رمز" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (التالى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستكمال إنشاء السطحية، انقر على/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg &quot;/&gt; (إنهاء). في قائمة كائن، والآن برنامج الأمم المتحدة للتحقق مربع لهذا البند حجم والجدد سطح إنشاؤها يتم عرض في عرض المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير الإحصاءات. الآن، في رأي فق لون الموضوعات تختلف من الأرجواني إلى الأحمر وفقا لمنطقتهم. ويبين الجدول &#39;أرقام مساحة الأرض&#39; المعلومات إحصاءات (على سبيل المثال، رقم الهوية ومجال الكائنات). تصدير جميع الإحصاءات من سطح 1 إلى ملف Excel عن طريق النقر <img alt="رمز" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> (حفظ). </li></ol>

<ol>
	<li>Coto-Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+fluorescent+labels+for+optical+imaging+and+sensing+in+genomics+and+proteomics.">Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).</li><li>Xie, J., Lee, S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+theranostic+agents.">Nanoparticle-based theranostic agents.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).</li><li>Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticles+for+intracellular+sensing:+a+review.">Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).</li><li>Wu, C., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+fluorescent+semiconducting+polymer+dots+for+biology+and+medicine.">Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).</li><li>Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles:+an+era+in+bionanotechnology.">Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).</li><li>Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+engineered+gold+nanoparticles+into+mammalian+cells.">Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells.</a> Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).</li><li>Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells.">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6, 662-668 (2006).</li><li>Finlay, B. B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+mammalian+host+cell+functions+by+bacterial+pathogens.">Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens.</a> Science. 276, 718-725 (1997).</li><li>Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host-cell+pathways+by+bacterial+pathogens.">Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens.</a> Nature. 449, 827-834 (2007).</li><li>Malik-Kale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+-+at+home+in+the+host+cell.">Salmonella - at home in the host cell.</a> Front. Microbiol. 2, 125 (2011).</li><li>Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+remodeling+of+the+endosomal+system+during+formation+of+Salmonella-induced+filaments+by+intracellular+Salmonella+enterica.">Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica.</a> Traffic. 9, 2100-2116 (2008).</li><li>Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella-induced+tubular+networks.">Salmonella-induced tubular networks.</a> Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+trafficking+is+defined+by+continuous+dynamic+interactions+with+the+endolysosomal+system.">Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system.</a> Traffic. 8, 212-225 (2007).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+preparing+gold+probes+for+multiple-labeling+cytochemistry.">A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry.</a> Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).</li><li>Zhang, Y., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticles+as+endocytic+tracers+in+cellular+microbiology.">Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology.</a> Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).</li><li>Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+22.">Chapter 22.</a> Cell Biology. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).</li><li>Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+biocompatible+and+long-life+marker+for+lysosome+labeling+and+tracking.">Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking.</a> Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).</li><li>Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+putative+effector+proteins+of+the+type+III+secretion+system+of+Salmonella+pathogenicity+island+2+are+required+for+bacterial+virulence+and+proliferation+in+macrophages.">Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages.</a> Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).</li><li>Beuzon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+maintains+the+integrity+of+its+intracellular+vacuole+through+the+action+of+SifA.">Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA.</a> EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

النظام إندو-الليزوزومية من خلايا الثدييات يتحكم العمليات الفسيولوجية الهامة، بما في ذلك امتصاص العناصر الغذائية، بوساطة هرمون نقل الإشارة والمراقبة المناعة، وعرض المستضد 17. حتى الآن، وقد استخدمت مجموعة متنوعة من علامات لوضع العلامات على مسار وتتبع الدراسات ...

وقد اجتذبت النانوية الفلورسنت (NPS)، بما في ذلك مصادر القدرة النووية المعدنية، ونقاط الكم، البوليمر مصادر القدرة النووية، مصادر القدرة النووية السيليكا، النقاط الكربون وغيرها، اهتماما كبيرا خلال العقود الماضية 1،2. مقارنة الأصباغ العضوية التقليدية، وتبين مصادر القدرة النووية الفلورسنت الكيميائية والخصائص البصرية والميكانيكية مرغوبة، مثل قوة قوية إشارة، ومقاومة للphotobleaching من وارتفاع 3،4 توافق مع الحياة. هذه المزايا تجعل منها طريقة اختيار للاستشعار داخل الخلايا والتصوير الخلية الحية. وعلاوة على ذلك، مجموعة متنوعة من NPS-الإلكترون كثيفة مرئية بواسطة المجهر الإلكتروني (EM)، وتسهيل استخدامها لتحليل مجهري مترابطة، والذي يسمح الجمع بين الخلية الحية تتبع مع ​​المجهر الضوئي (LM) ودقة أعلى في مستوى التركيبية مع EM 5. على سبيل المثال، كانت مصادر القدرة النووية الذهب وقت طويل استخدامها بكفاءة كما أجهزة الاستشعار في خلايا حساسة للتشخيص يعيشون وكذلك في مجال المناعة وضع العلامات 6. الصورة الأخيرةtudies تشير إلى أن مصادر القدرة النووية الذهب مع حجم وشكل مختلف يمكن أن يكون بسهولة امتصاص من قبل مجموعة كبيرة ومتنوعة من خطوط الخلايا ونقل بشكل روتيني من خلال مسار endosomal، وبالتالي يكون كبيرا يجري المحتمل تطبيقها لداخل الخلايا تتبع النقل حويصلة ووضع العلامات نظام إندو الليزوزومية 7،8 . مسببات الأمراض الميكروبية، مثل السالمونيلا الملهبة، الشيجلا الفلكسنرية والليستريا المستوحدة، وضعت آليات مختلفة لغزو الخلايا المضيفة غير أكلة 9. بعد أن المنضوية، ومسببات الأمراض، والمترجمة إما في العصارة الخلوية أو عزلها في أماكن محددة الغشاء، تتفاعل على نطاق واسع مع البيئات التي تستضيفهم وتعدل هذه لصالح بقائهم على قيد الحياة 10. على سبيل المثال، السالمونيلا الملهبة لليقيم ويتكاثر داخل phagosomal حجرة داخل الخلايا وصفته السالمونيلا المحتوية فجوة (SCV) عند إصابة 11. وSCV النضجبالاتجار نحو جهاز جولجي، تمر التفاعل المستمر مع مسار التقامي، ويدفع تشكيل الهياكل واسعة أنبوبي، مثل السالمونيلا خيوط يسببها (SIF) والفرز الأنابيب نيكسين، السالمونيلا يسببها الناقل إفرازية البروتين غشاء 3 (SCAMP3) الأنابيب، الخ . 12-14. دراسة كيف يمكن لهذه مسببات الأمراض البكتيرية التلاعب مسارات خلايا المضيف أمر ضروري لفهم الأمراض المعدية. هنا، تم استخدام مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين كأثر السوائل لتسمية المضيف الخلوي نظام إندو-الليزوزومية، واستخدم الإنسان الممرض الهضمي السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية (السالمونيلا)، وبكتيريا نموذج لدراسة التفاعلات من مسببات المرض مع استضافة المسار التقامي. تم تصوير مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين الخلايا في الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة مع WT السالمونيلا أو سلالات متحولة من قبل متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي (CLSM).ثم تم استخدام البرمجيات Imaris لقياس توزيع مصادر القدرة النووية، مشيرا إلى أن عدوى السالمونيلا التي يسببها إعادة ترتيب الشديد من الإندوسومات / الجسيمات الحالة. وبعد وصف هذا الأسلوب، والتجارب المشابهة يمكن أن تكون مصممة لتتبع مصير طويلة الأجل للمعايير المهنية الوطنية المنضوية وللتحقيق في تأثير المواد الخارجية المختلفة أو العوامل الداخلية على مسار التقامي الخلايا حقيقية النواة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:193px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tri-sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NHS-Rhodamine</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamcyin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>tissue culture treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>version 7.6</td>
			<td>various configurations available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

النانوية الفلورسنت (NPS) مع المواد الكيميائية مرغوب فيه، الخصائص البصرية والميكانيكية هي أدوات واعدة لتسمية عضيات داخل الخلايا. هنا، ونحن نقدم طريقة استخدام الذهب-BSA-رودامين مصادر القدرة النووية لتسمية نظام إندو الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة ورصد التلاعب من المضيف مسارات الخلوية من قبل الممرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة. وقد استوعبت مصادر القدرة النووية بسهولة عن طريق خلايا هيلا ومحلية في أواخر الإندوسومات / الجسيمات الحالة. عدوى السالمونيلا التي يسببها إعادة ترتيب الحويصلات وتراكم تلك المصادر في الهياكل غشاء Salmonella- المستحث. نحن نشر حزمة البرامج Imaris للالتحليلات الكمية من الصور مبائر المجهري. وكان عدد من الأشياء وتوزيع حجمها في الخلايا غير المصابة تختلف عن تلك الموجودة في خلايا -infected السالمونيلا، مشيرا إلى إعادة تشكيل للغاية من نظام إندو الليزوزومية التي كتبها WT السالمونيلا.

وقد تم توليد مصادر القدرة النووية الذهب من خلال طريقة راسخة عبر الحد من حمض chloroauric بواسطة سترات وحمض التانيك. كما هو مبين في الشكل 2A، كانت مصادر القدرة النووية الذهب توليفها شبه كروية الشكل مع حجم ما يقرب من 10 نانومتر. لم BSA طلاء ورودامين وضع العلامات لا تؤثر ا...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

توضح هذه المقالة الطرق لتركيب ووضع العلامات الفلورية النانوية (NPS). تم تطبيق مصادر القدرة النووية في التجارب نبض مطاردة لتسمية نظام إندو-الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة. وتلت التلاعب في نظام إندو الليزوزومية من الأنشطة من مسببات المرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة التي كتبها التصوير الخلية الحية وكميا.

تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

application-fluorescent-nanoparticles-to-study-remodeling-endo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Views.  Universität Osnabrück.  توضح هذه المقالة الطرق لتركيب ووضع العلامات الفلورية النانوية (NPS). تم تطبيق مصادر القدرة النووية في التجارب نبض مطاردة لتسمية نظام إندو-الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة. وتلت التلاعب في نظام إندو الليزوزومية من الأنشطة من مسببات المر?...

Video: Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

كشف متعددة من البكتيريا الموجودة في مجمع العينات السريرية والبيئية باستخدام قليل النوكليوتيد ، بالإضافة نيون المجهرية

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

تطبيق نظام التعبير محرض لدراسة التدخل من العوامل البكتيرية الفوعة مع اشارة بين الخلايا

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

تطوير نظام تسليم الاقتصادية DNA من قبل &quot;Acufection&quot; وتطبيقه لبحوث الجلد

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic purposes. However, the visualization and quantification of multiple antigens in a single tissue section using conventional chromogenic IHC is challenging. Multiplexed imaging is especially relevant in lymphoma research and diagnostics, where markers have to be interpreted in the context of a complex tumor microenvironment. Here we describe a protocol for multiplexed fluorescent IHC staining to enable the quantitative assessment of multiple targets in specific cell types of interest in lymphoma.The method covers aspects of antibody validation, antibody optimization, the multiplex optimization with markers of lymphoma subtypes, the staining of tissue microarray (TMA) slides, and the scanning of the slides, followed by data analysis, with specific reference to lymphoma. Using this method, scores for both the mean intensity of a marker of interest and the percentage positivity are generated to facilitate further quantitative analysis. Multiplexing minimizes sample utilization and provides spatial information for each marker of interest.

Here we describe a protocol for multiplex fluorescent immunohistochemical staining and imaging for the simultaneous localization of multiple cancer-associated antigens in lymphoma. This protocol can be extended to the colocalization analysis of biomarkers within all tissue sections.

متعدد الفلورسنت المناعي تلطيخ والتصوير والتحليل في عينات نسيجية من سرطان الغدد الليمفاوية

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four women experience bacterial vaginosis, in which a low level of lactobacilli is accompanied by an overgrowth of diverse anaerobic bacteria. This condition has been associated with many health complications, including risks to reproductive and sexual health. While there is growing evidence showing the complex nature of microbial interactions in human vaginal health, the individual roles of these different anaerobic bacteria are not fully understood. This is complicated by the lack of adequate models to study anaerobically grown vaginal bacteria. Mouse models allow us to investigate the biology and virulence of these organisms in vivo. Other mouse models of vaginal bacterial inoculation have previously been described. Here, we describe methods for the inoculation of anaerobically grown bacteria and their viable recovery in conventionally raised C57Bl/6 mice. A new, less stressful procedural method for vaginal inoculation and washing is also described. Inoculation and viable recovery of Gardnerella are outlined in detail, and strategies for additional anaerobes such as Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum are discussed.

The protocol presents a mouse model of vaginal colonization with anaerobically cultured human vaginal bacteria. We focus on Gardnerella vaginalis,&#160;while including suggestions for Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum. This protocol can also be used as a guide for vaginal inoculations and viable recovery of other anaerobically grown bacteria.

نماذج من استعمار الفئران المهبلي بواسطة البكتيريا المزروعة لاهوائيا

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...