This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

1. סינתזה של 10 ננומטר זהב חלקיקים (זהב NPS) 15 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון: להוסיף 2 מיליליטר 1% כלוריד זהב המימי ל160 מיליליטר מילי- Q, או מזוקק פעמיים, מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הפתרון B: להוסיף 8 מיליליטר 1% ציטראט x 2 H תלת-נתרן 2 O ו -160% μl 1 חומצה טאנית ל -32 מיליליטר מילי- Q, או מזוקק פעמיים, מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את הפתרון A ו- B ל- 60 ° C ומערבבים אותם תוך ערבוב. שים לב בצבע כחול כהה באופן מיידי. שים לב צבע אדום לאחר כ -15 דקות. לאחר מכן לחמם עד 95 מעלות צלזיוס, לשמור על 5 דקות ולקרר את הפתרון לRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה של ההשעיה NP על פחמן רשת מצופה ולאפשר לו להתייבש באוויר. בדוק את הגודל ומורפולוגיה של צירופים ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים החודר. </li></ol> 2. ציפוי של צירופים וזהב עם BSA ותיוג עם Rhodamine N-hydroxysuccinimidyl אסתר (NHS) 16 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μl צירופים וזהב לתוך צינור Eppendorf 1.5 מיליליטר, צנטריפוגות ב 15,000 XG למשך 30 דקות. אופtionally, להכין צינורות מרובים עשויים בבת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, מחדש להשעות את גלולה ב900 μl מעוקר המים מילי- Q ולהוסיף 100 μl 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA / PBS, לערבב במערבולת ב 800 סל&quot;ד במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר BSA העודף, צנטריפוגות ההכנה ב15,000 XG במשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, מחדש להשעות הצירופים והזהב-BSA ב125 μl PBS, להוסיף 12.5 μl של יקרבונט 1 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני השימוש, להכין פתרון 10 מ&quot;ג / מיליליטר של rhodamine NHS / DMSO, להוסיף 30 μl של פתרון / DMSO rhodamine NHS ל1ml של ההשעיה זהב-BSA הצירופים. דגירה התגובה לשעה 2 (או O / N) ב RT במהלך 800 ערבוב סל&quot;ד, הימנעות מחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הצירופים וזהב-BSA-rhodamine באמצעות דיאליזה נגד PBS בºC 4 עם 5 חיץ שינויים על פני תקופת 36-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצב צירופים ו, ​​להוסיף 10 μl של 200 מ&quot;ג / BSA / PBS מיליליטר לכל 1 מיליליטר צירופים וזהב-BSA-rhodamine. כדי להסיר את צנטריפוגות בחינם או שוחררה BSA-rhodamine, בגיל 15,000 XG במשך 60 דקות. Resuspend גלולה ב 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA / PBS, למדוד OD 520, ולאחסן ב 4 ° C, הימנעות מחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפעמים הצירופים 10 עם מילי- Q או מים מזוקקים פעמיים, להוסיף טיפה על רשת מצופה פחמן, ולאפשר לו להתייבש באוויר. בדוק את הגודל ומורפולוגיה של צירופים ועל ידי מיקרוסקופ אלקטרונים החודר (TEM). הערה: כל החומרים המשמשים להכנת NP עוקרו והמבצע שנערך במכסת מנוע תרבית תאים או על ספסל ליד להבה. </li></ol> 3. תרבות של תאי הלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הלה באופן קבוע להביע LAMP1-GFP בתרבית DMEM עם סרום 10% עגל עוברי (FCS) וגדלתי על 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי התאים בצפיפות של 50,000 לכל גם בתא שקופית 8 היטב (Ibidi) ודגירת O / N. </li></ol> 4. תרבות של חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> serovar enterica השימוש סלמונלה Typhimurium NCTC 12,023 wild-סוג מתח (WT). לשם השוואה, להשתמש זנים מוטנטים Δ ssaV פגומים בSPI2-T3SS וΔ SIFA חסר מפעיל מפתח SIFA לSIF. השתמש בזני חסת פלסמיד pFPV25.1 לביטוי מכונן של ה- GFP המשופר. הערה: זני חיידקים באופן שיגרתי בתרבית במרק לוריא-Bertani (LB) עם תוספת של 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin (WT) וLB עם תוספת של 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin ו / או 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin (Δ ssaV, Δ SIFA ) של הנדרש כדי לשמור על פלסמידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של חיידקים ב 3 מיליליטר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים רועדים לאוורור, ואז לדלל 01:31 בLB הטרי ולהמשיך את הצמיחה תמורת 3.5 שעות. בנקודה זמן זו, התרבויות להגיע השלב מאוחר יומן וחיידקים הם פולשני מאוד. &quot;תוף הרים &#39;הוא נוח לדגירת תרבויות מבחנה עם אוורור. </li></ol> 5. זיהום של תאי הלה על ידיסלמונלה וזהב-BSA-Rhodamine צירופים וPulse צ&#39;ייס תיוג (ראה תרשים 1 לערכה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד OD 600 של החיידקים תת תרבות ולדלל את OD 600 = 0.2 ב 1 מיליליטר PBS (~ 3 CFU × 10 8 / מיליליטר), להוסיף כמויות מתאימות של חיידקים לתאי הלה בשקופיות קאמריות 8 היטב כדי להשיג ריבוי זיהום (משרד הפנים) של 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה למשך 30 דקות בחממת התא, לשטוף 3 פעמים עם PBS להסיר חיידקים שאינם מופנמים (זמן נקודה זו נקבעה כלאחר זיהום 0 שעה, או 0 pi hr). להוסיף 300 μl של מדיום תרבות הטרי המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין ולשמור עבור שעה 1. לאחר מכן להחליף בינוני עם בינוני טרי המכיל גנטמיצין / מיליליטר 10 מיקרוגרם לשארית זמן הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה עם מדיום תרבות המכיל גנטמיצין / מיליליטר 100 מיקרוגרם לשעה 1, הבינוני הוא הוחלף על ידי הדמיה בינונית (הנשרים MEM ללא FCS, L-גלוטמין, ביקרבונט האדום ונתרן פנול, עם 30 מ&quot;מ HEPES, pH 7.4) במשותףntaining 10 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. צירופים וזהב-BSA-rhodamine מתווספים לתאי הלה להשיג ריכוז סופי של OD 520 = 0.1. הערה: צירופים וזהב-BSA-rhodamine יכול להיות גם הוסיפו לתאים לפני ההדבקה, או בpi נקודות הזמן השונים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1 שעה, להסיר את המדיום, לשטוף 3 פעמים עם PBS, ולהוסיף 300 μl של מדיום הדמיה טרי המכיל 10% FCS וגנטמיצין / מיליליטר 10 מיקרוגרם לשארית זמן הדגירה. הערה: משך הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לריכוז של צירופים ושורות תאים בשימוש. למקרופאגים RAW264.7, שמה לב שדגירת דקות 30 עם צירופים ובריכוז של OD 520 = 0.05 אפשר הפנמה מספקת. </li></ol> 6. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת הדמיה confocal כגון לייזר סריקת confocal (CLSM) או מיקרוסקופ דיסק מסתובב (SD) עם תא סביבת humidified להדמיה ברזולוציה גבוהה בזמן נקודות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על ג הטמפרטורהontrol מערכת ולחכות עד שהוא יציב. למטב את הגדרות ההדמיה כגון הגדלה, מהירות סריקה, רזולוציה, Z-ערימה וכו &#39;השתמש בהגדרות עירור / פליטה מתאימות לGFP וצירופים וזהב-BSA-rhodamine. לפרוטוקול זה, השתמש 400 הרץ מהירות סריקה, ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים וגודל Z-צעד של 0.25 מיקרומטר. Excite GFP וזהב-BSA-rhodamine באמצעות לייזר Ar (488 ננומטר) וליזר HeNe (543 ננומטר), בהתאמה. כולל בהיר שדה ערוץ (BF) להתבוננות בדמותם של התאים. למערכות אחרות במיקרוסקופ ותנאי זיהום, ההגדרה צריכה להיות בהתאם. הערה: השתמש באותה הלייזר Ar כמקור האור של ערוץ BF ואות זוהה עם גלאי מכפיל תמונה (PMT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בpi נקודות הזמן שצוין, הר השקופיות קאמריות 8-היטב המכילות תאים נגועים על הבמה מיקרוסקופ ותמונות שיא. </li></ol> 7. ניתוח של תמונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ניתוח תמונה מיקרוסקופית (ראה <strong&gt; חומרים ולוח של הציוד) כדי לנתח את העיצוב מחדש של מערכת אנדו-lysosomal ידי סלמונלה תאית. פתח את הנתונים על-ידי לחיצה על &#39;פתח&#39; ובחירת הקובץ. הערה: לחלופין, חבילות תוכנת קוד פתוחות כגון ImageJ או פיג&#39;י עשויות לשמש לתמונת ניתוחים כמותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסרגל הכלים האובייקטים של קליק לעלות מבט על הסמל <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" /> כדי להוסיף פריט שטח חדש. לחץ על <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח אזור של העניין (ROI), מגזר בחר ROI. באזור תצוגה, סעיף-גובל מלבן מעולף על תמונה המייצג את ההחזר על ההשקעה. הזן את הערכים בקואורדינטות x המקבילות, y-, ושדות Z-, או ישירות לחץ על החצים במלבן התצוגה המקדימה לגודל ומיקום של ההחזר על ההשקעה לשנות. לאחר מכן לחץ על <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,058 / 52058icon2.jpg&quot; /&gt; (הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כערוץ מקור, ערוץ בחר 3 (אות לזהב-BSA-Rhodamine NPS). בדוק את האפשרות החלקה להגדיר את החלקות באזור וכתוצאה מכך. להגדיר ערך באופן ידני או לקבל את הערך שנוצר באופן אוטומטי. לסף, בחר באפשרות העוצמה מוחלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאמת הסף, בחר באפשרות הידנית ולהגדיר ערך. באזור התצוגה, תצוגה מקדימה סף משטח מוצגת באפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על המשטחים לסווג כרטיסיית פני השטח וכתוצאה ניתן לסנן לפי קריטריונים שונים. מסנן ברירת מחדל הוא &#39;מספר voxels&gt; 10&#39;, ומסננים אחרים יכול להיכלל גם על ידי לחיצה על &quot;הוספה&quot;. אם סינון אין צורך, ולאחר מכן למחוק את כל המסננים על ידי לחיצה על כפתור המחיקה. לחץ <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשלים את יצירת Surface, לחץ על/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg &quot;/&gt; (Finish). ברשימת האובייקט, עכשיו את הסימון בתיבה לVolume הפריט והמשטח שנוצר חדש מוצג בשטח צפייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים הסטטיסטיים. עכשיו, בתצוגה לעלות את הצבע של הנושאים משתנים מסגול לאדום בהתאם לאזור שלהם. והשולחן &#39;פינת מספרי מגרש&#39; מציג את המידע הסטטיסטי (למשל, מספר תעודת זהות ושטח של אובייקטים). לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים של משטח 1 לקובץ Excel על ידי לחיצה <img alt="אייקון" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> (שמור). </li></ol>

<ol>
	<li>Coto-Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+fluorescent+labels+for+optical+imaging+and+sensing+in+genomics+and+proteomics.">Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics.</a> Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).</li><li>Xie, J., Lee, S., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+theranostic+agents.">Nanoparticle-based theranostic agents.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).</li><li>Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticles+for+intracellular+sensing:+a+review.">Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).</li><li>Wu, C., Chiu, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+fluorescent+semiconducting+polymer+dots+for+biology+and+medicine.">Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).</li><li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots.">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).</li><li>Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticles:+an+era+in+bionanotechnology.">Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).</li><li>Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+engineered+gold+nanoparticles+into+mammalian+cells.">Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells.</a> Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).</li><li>Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+size+and+shape+dependence+of+gold+nanoparticle+uptake+into+mammalian+cells.">Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells.</a> Nano Lett. 6, 662-668 (2006).</li><li>Finlay, B. B., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+mammalian+host+cell+functions+by+bacterial+pathogens.">Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens.</a> Science. 276, 718-725 (1997).</li><li>Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+host-cell+pathways+by+bacterial+pathogens.">Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens.</a> Nature. 449, 827-834 (2007).</li><li>Malik-Kale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+-+at+home+in+the+host+cell.">Salmonella - at home in the host cell.</a> Front. Microbiol. 2, 125 (2011).</li><li>Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+remodeling+of+the+endosomal+system+during+formation+of+Salmonella-induced+filaments+by+intracellular+Salmonella+enterica.">Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica.</a> Traffic. 9, 2100-2116 (2008).</li><li>Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella-induced+tubular+networks.">Salmonella-induced tubular networks.</a> Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+trafficking+is+defined+by+continuous+dynamic+interactions+with+the+endolysosomal+system.">Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system.</a> Traffic. 8, 212-225 (2007).</li><li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+preparing+gold+probes+for+multiple-labeling+cytochemistry.">A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry.</a> Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).</li><li>Zhang, Y., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+nanoparticles+as+endocytic+tracers+in+cellular+microbiology.">Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology.</a> Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).</li><li>Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+22.">Chapter 22.</a> Cell Biology. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> LysoTracker and LysoSensor Probes. , (2013).</li><li>Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-based+biocompatible+and+long-life+marker+for+lysosome+labeling+and+tracking.">Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking.</a> Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).</li><li>Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+putative+effector+proteins+of+the+type+III+secretion+system+of+Salmonella+pathogenicity+island+2+are+required+for+bacterial+virulence+and+proliferation+in+macrophages.">Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages.</a> Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).</li><li>Beuzon, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+maintains+the+integrity+of+its+intracellular+vacuole+through+the+action+of+SifA.">Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA.</a> EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

מערכת אנדו-lysosomal של תאי יונקים שולטת בתהליכים פיסיולוגיים חשובים, כוללים מזין קליטה, הולכים אותות בתיווך הורמון, מעקב חיסוני, והצגת אנטיגן 17. עד עכשיו, מגוון רחב של סמנים שימש במשך תיוג של לימודי מסלול ומעקב endocytic. לדוגמא, בדיקות Lysotracker הן בדיקות ניאון acidotropic שפות?...

חלקיקי ניאון (NPS), כוללים צירופים ומתכת, נקודות קוונטיות, צירופים ופולימר, צירופים וסיליקה, נקודות פחמן, וכו &#39;, משכו תשומת לב רבה במהלך העשורים האחרונים 1,2. בהשוואה לצבעים אורגניים מסורתיים, צירופים וניאון להראות כימיים, תכונות אופטיות ומכאניות רצויות, כגון עוצמת אות חזקה, התנגדות לphotobleaching ו3,4 biocompatibility גבוה. יתרונות אלה הופכים אותם לשיטת בחירה של חישה תאית והדמיה תא חי. יתר על כן, מגוון רחב של צירופים ואלקטרון-צפוף גלוי על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים (EM), המאפשר את השימוש בם לניתוח מיקרוסקופי מתואם, המאפשר שילוב של תא חי מעקב עם מיקרוסקופ אור (LM) ורזולוציה גבוהה יותר ברמת ultrastructural עם EM 5. לדוגמא, צירופים וזהב היו זמן רב ביעילות משמש כחיישנים ביולוגיים בתאים חיים לאבחון רגיש, כמו גם בתחום אימונו-תיוג 6. ים האחרוןtudies עולה כי צירופים וזהב עם גודל וצורה שונים יכול להיות בקלות ספיגה על ידי מגוון גדול של שורות תאים ובאופן שיגרתי להעביר דרך מסלול endosomal, ולכן יש לי יצור פוטנציאל גדול הגיש בקשה למעקב תחבורה השלפוחית ​​תאית ותיוג מערכת אנדו-lysosomal 7,8 . פתוגנים חיידקים, כגון סלמונלה enterica, flexneri Shigella וחיידקים ליסטריה, פיתחו מנגנונים שונים כדי לפלוש תאי מארח שאינו phagocytic 9. לאחר שהפנים, פתוגנים, מקומי או בcytosol או מוחרם בתאי קרום נכנסים, אינטראקציה נרחבת עם סביבות המארח שלהם ולווסת את אלה לטובת ההישרדות שלהם 10. לדוגמא, enterica סלמונלה מתגורר ומשכפל בתוך תא phagosomal תאית המכונה vacuole המכיל סלמונלה (SCV) על זיהום 11. SCV ההתבגרותtraffics כלפי מערכת גולג&#39;י, עוברים אינטראקציות רציפות עם מסלול endocytic, וגורם להיווצרות של מבנים נרחבים צינורי, כגון חוטי -induced סלמונלה (SIF), מיון tubules nexin, 3 tubules סלמונלה מוביל הפרשת -induced חלבון קרום (SCAMP3), וכו &#39; . 12-14. לומדים איך חיידקים פתוגנים אלה לתפעל מסלולי מארח תאים חיוני להבנת מחלה זיהומית. כאן, צירופים וזהב-BSA-rhodamine שמשו כקליעים נותבים נוזל לתייג מערכת אנדו-lysosomal הסלולרית המארח, והפתוגן עיכול Typhimurium serovar enterica אדם סלמונלה (Salmonella) שימש כחיידק מודל ללמוד את יחסי הגומלין של הפתוגן עם לארח מסלול endocytic. צירופים וזהב-BSA-rhodamine תאיים בתאים הנגועים באי ותאים נגועים בסלמונלה WT או זנים מוטנטים היו צילמו על ידי מיקרוסקופ confocal לייזר סריקה (CLSM).אז תוכנת Imaris שימשה לכמת את ההפצה של צירופים ו, מצביע על כך שזיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש קיצוני של endosomes / lysosomes. לאחר התיאור של שיטה זו, יכולים להיות מתוכנן ניסויים מקבילים כדי לעקוב אחר גורל לטווח הארוך של צירופים והמופנמים ולחקור את ההשפעה של חומרים אקסוגניים שונים או גורמים במשק על מסלול endocytic של תאים האיקריוטים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:193px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tri-sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NHS-Rhodamine</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamcyin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>tissue culture treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>version 7.6</td>
			<td>various configurations available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

חלקיקי ניאון (NPS) עם כימי רצוי, תכונות אופטיות ומכאניות הם כלים מבטיחים לתייג אברונים תוך-תאיים. כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות זהב-BSA-rhodamine צירופים ולתייג את מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים ולעקוב אחר מניפולציות של מסלולים סלולריים מארח ידי enterica סלמונלה הפתוגן תאיים. הצירופים והופנמו בקלות על ידי תאי הלה ומקומיים בendosomes / lysosomes מאוחר. זיהום סלמונלה מושרה סידור מחדש של שלפוחית ​​והצטברות של צירופים ובמבני קרום Salmonella- מושרה. אנחנו פרסנו את חבילת תוכנת Imaris לניתוחים כמותיים של תמונות מיקרוסקופיה confocal. מספר האובייקטים והתפלגות גודלם בתאים הנגועים שאינם היו שונים מאלה בתאי -infected סלמונלה, המציין מאוד שיפוץ של מערכת אנדו-lysosomal ידי WT סלמונלה.

צירופים וזהב שהופקו באמצעות שיטה מבוססת היטב באמצעות הפחתה של חומצת chloroauric ידי ציטראט וחומצה טאני. כפי שניתן לראות באיור 2 א, הצירופים והזהב מסונתזים היו מעין-כדוריים בצורה בגודל של כ -10 ננומטר. BSA-הציפוי וrhodamine תיוג לא השפיעו המורפולוגיה שלהם או גודל (איו?...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria at JoVE.com

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי ולכמת.

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

application-fluorescent-nanoparticles-to-study-remodeling-endo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K Views.  Universität Osnabrück.  מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי...

Video: Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

פיתוח של מערכת מסירת DNA החסכוני ידי &quot;Acufection&quot; ויישומו מחקר עור

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic purposes. However, the visualization and quantification of multiple antigens in a single tissue section using conventional chromogenic IHC is challenging. Multiplexed imaging is especially relevant in lymphoma research and diagnostics, where markers have to be interpreted in the context of a complex tumor microenvironment. Here we describe a protocol for multiplexed fluorescent IHC staining to enable the quantitative assessment of multiple targets in specific cell types of interest in lymphoma.The method covers aspects of antibody validation, antibody optimization, the multiplex optimization with markers of lymphoma subtypes, the staining of tissue microarray (TMA) slides, and the scanning of the slides, followed by data analysis, with specific reference to lymphoma. Using this method, scores for both the mean intensity of a marker of interest and the percentage positivity are generated to facilitate further quantitative analysis. Multiplexing minimizes sample utilization and provides spatial information for each marker of interest.

Here we describe a protocol for multiplex fluorescent immunohistochemical staining and imaging for the simultaneous localization of multiple cancer-associated antigens in lymphoma. This protocol can be extended to the colocalization analysis of biomarkers within all tissue sections.

מרובבת פלורסנט נוגדן, הדמיה, וניתוח בדגימות היסטולוגית של לימפומה

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four women experience bacterial vaginosis, in which a low level of lactobacilli is accompanied by an overgrowth of diverse anaerobic bacteria. This condition has been associated with many health complications, including risks to reproductive and sexual health. While there is growing evidence showing the complex nature of microbial interactions in human vaginal health, the individual roles of these different anaerobic bacteria are not fully understood. This is complicated by the lack of adequate models to study anaerobically grown vaginal bacteria. Mouse models allow us to investigate the biology and virulence of these organisms in vivo. Other mouse models of vaginal bacterial inoculation have previously been described. Here, we describe methods for the inoculation of anaerobically grown bacteria and their viable recovery in conventionally raised C57Bl/6 mice. A new, less stressful procedural method for vaginal inoculation and washing is also described. Inoculation and viable recovery of Gardnerella are outlined in detail, and strategies for additional anaerobes such as Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum are discussed.

The protocol presents a mouse model of vaginal colonization with anaerobically cultured human vaginal bacteria. We focus on Gardnerella vaginalis,&#160;while including suggestions for Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum. This protocol can also be used as a guide for vaginal inoculations and viable recovery of other anaerobically grown bacteria.

מודלים של התיישבות נרתיקית מורין על ידי חיידקים שגודלו אנאירובית

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...