المؤلفون ممتنون لFONDAZIONE Filarete على مساعدتها ودعمها في نشر هذا المقال. نود أيضا أن نشكر سنترو دي EUROPEO Nanomedicina لاستخدام TECNAI G2 المجهر الإلكتروني النافذ.

1. البلازميد، زراعة الخلايا، وترنسفكأيشن مع ER نيون البروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة يتكون من نسخة محسنة من GFP تنصهر في دورته C-محطة للمنطقة الذيل من الإسوي ER من الفئران السيتوكروم ب (5) (مختصر هنا ب (5)) عبر تسلسل رابط. يحتوي على منطقة الذيل تسلسل كامل (Pro94-Asp134) الذي لا يزال الغشاء المرتبطة بعد انشقاق التربسين من الأم ب (5)، بما في ذلك انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى 17 بقايا (المجال عبر الغشاء)، ويحيط بها سلاسل القطبية المنبع والمصب (يو بي اس وDPS) . يتكون رابط من حاتمة MYC تليها [(الغليسين) 4 سر] 3، ويتم إدراج [كدنا بأكمله في مواقع Hind3-Xba1 من الثدييات ناقلات التعبير pCDNA3. وقد وصفت تفاصيل بناء هذا البلازميد في منشور السابقة التي يشار إليها باسم GFP-ER 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا COS-7 في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ فيتامصل ل البقري، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 10٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترنسفكأيشن. لوحة 3 × 10 5 الخلايا على ساترة الزجاج جولة في لوحة 6 جيدا و، في اليوم التالي، بالنقل مع نظام JetPEI كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. نلاحظ أن نسبة JetPEI / DNA الأمثل وقد تم اختبار من أجل تحديد الحد الأقصى لكفاءة ترنسفكأيشن اعتمادا على البلازميد وخط الخلية المستخدمة: في حالتنا، وJetPEI: نسبة الحمض النووي 2:1 يؤدي إلى 70-80٪ كفاءة ترنسفكأيشن. </li></ol> 2. يعيش الإسفار متحد البؤر المجهري الضوئي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير الخلية الحية. وضع ساترة التي كانت المصنفة على الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى غرفة خلية ثقافة الصلب لمدة 24 ملم coverslips مليئة DMEM ث / س الفينول الأحمر، على أن تستكمل مع FBS 10٪، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا، 25 ملي HEPES ، 50 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد و1:100 OxyFluor لمنع عينات من photobleaching من. وmicroscop SP5 مبائريستخدم البريد مجهزة CO 2 الحاضنة التي تسيطر عليها درجة الحرارة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لتجارب التصوير الخلية الحية، مع د GFP-ER يجري تصور باستخدام الليزر 488 نانومتر، ومرشح 525/50 تمريرة الفرقة الانبعاثات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضان الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP). رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، المقابلة لبنية OSER، والتبييض باستخدام التكرارات و20 مجموعة من 488 نانومتر (100٪ من ليزر الأرجون 30 ميغاواط، أي ما يعادل 5.5-6 μW في العينة) و 405 نانومتر (60٪ من 30 ميغاواط ديود ليزر 405، المقابلة ل11.6 μW في العينة) الليزر الذي يؤدي في تجربتنا لphotobleaching من كفاءة وسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل انتعاش مضان في رويس ابيض من خلال اتخاذ إطار واحد كل 10 ثانية لمدة 10 دقيقة (بالتوقيت بكسل = 1.61 μsec / مقصف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقدان مضان في photobleaching من (FLIP). رسم ROI المقابلة لبنية OSER، والتبييض كما هو موضح أعلاه. يتم تكرار تبيض كل 30 ثانية،وتسجل الصور آخر التبييض كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة (بالتوقيت بكسل = 1.61 μsec / مقصف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FRAP FLIP وتحليل. ويتم تحليل كافة الصور باستخدام برنامج ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). في التجارب FRAP، يتم قياس الانتعاش مضان من العائد على الاستثمار ابيض مع مرور الوقت وتطبيع مضان مجموعه خلية ابيض، والتي يتم التحقق دائما أن تكون ثابتة على مر الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجارب FLIP، رسم العائد على الاستثمار خارج OSER ابيض وتغطي الخلية بأكملها. قياس كثافة مضان بمرور الوقت وتطبيع إلى مستويات مضان من العائد على الاستثمار مرسومة على خلية غير مقصور من أجل تصحيح أي انخفاض في مضان الناجمة عن التصوير نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في جميع التجارب، تطرح إشارة الخلفية (تحديد في منطقة خارج الخلايا) من شدة الفلورسنت من رويس. أخيرا، رسم النتائج باستخدام غرامaphPad بريزم البرمجيات. </li></ol> 3. تحليل التركيبية بواسطة وسائل نقل المجهر الإلكتروني نظرا لسمية كثير من الكواشف، وجميع الإجراءات ينبغي أن يتم ارتداء مختبر المناسبة. معطف وقفازات تحت غطاء الدخان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة ساترة من طبق بيتري، وإصلاح الخلايا المتبقية نمت على الجزء السفلي من الطبق كما أحادي الطبقة باستخدام تصفيتها 2٪ في غلوتارالدهيد 0.1 M العازلة كاكوديلات، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة تفلون ونقلها إلى 1.5 مل أنابيب إيبندورف. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 9000 ز لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف، إضافة تثبيتي الطازجة، وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الكريات مع المخزن المؤقت، ثم إصلاح آخر مع محلول 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في المخزن كاكوديلات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع المياه MilliQ، وككل وصمة عار مع1٪ خلات اليورانيل في الماء المقطر لمدة تتراوح بين 20-60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى العينات في زيادة سلسلة الايثانول (70٪، 80٪، 90٪، 100٪، و 100٪ لمدة 10 دقيقة لكل منهما)، ويغسل مرتين لفترة وجيزة في أكسيد البروبيلين (15 دقيقة لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسلل العينات في خليط من أكسيد البروبيلين + EPON (1:1) (من 2 ساعة ليلة وضحاها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغرس في EPON راتنجات الايبوكسي الشفاء عند 60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القسم الكتل الراتنج قلص يدويا باستخدام مشراح مستدق LEICA UC6 مجهزة 45 درجة الماس سكين للحصول على أقسام مع سمك 60-70 نانومتر. جمع المقاطع على شبكات النحاس 300 شبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار المقاطع على الشبكة مع محلول مشبع من خلات اليورانيل (20 دقيقة) وتؤدي سترات (7 دقائق)، ويغسل جيدا للشبكات عن طريق غمر في الماء المقطر تصفيتها ثنائية، والسماح لهم لتجف في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويلاحظ شبكات الملون باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ TECNAI G2، ويتم التقاط الصور باستخدام بوتام محمولة على كاميرا CCD في تكبير النهائية مختلفة (تتراوح عادة من 6،000-39،000 X). </li></ol>

<ol>
	<li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum.">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li><li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+architecture:+structures+in+flux.">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li><li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum.">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li><li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and.">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li><li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome.">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li><li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubic+membranes:+a+legend+beyond+the+Flatland*+of+cell+membrane+organization.">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li><li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+ER:+experimental+approaches+and+current+questions.">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li><li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li><li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital.">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li><li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells.">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li><li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres.">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+protein+misfolding:+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases.">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li><li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways.">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li><li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats.">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وقد استخدمت البروتوكولات والنهج التصوير وصفها في هذه الورقة للتحقيق في التوزيع والتنقل من transfected TA البروتينات الفلورية المقيمين في لائحة من الخلايا الحية. قمنا بتحليل أيضا تأثير الإفراط في التعبير من هذه البروتينات على بنية هذا الحيز التحت خلوية من خلال التحليلات ا...

اكتشاف بروتين الفلورية الخضراء (GFP) ومشتقاته الطيفية، وتطور مواز من مضان المجهري، وفتحت آفاقا جديدة تماما للتحقيق في سلوك البروتين في الخلايا. تقنيات مثل الانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP)، والتي هي ممكنة بسبب القدرة الذاتية للfluorophores لإطفاء مضان بهم تحت إضاءة مكثفة، تقوم على مبائر التصوير الخلية الحية واستخدام transfected البروتينات الفلورية الانصهار 1-3. وتستخدم على نطاق واسع لتقييم ليس فقط توطين البروتينات، ولكن أيضا قدرتهم على التنقل والنقل الحويصلي، والتي يمكن أن تكشف عن أدلة مهمة بشأن وظيفتها 4. ميزة فريدة من الخلايا حقيقية النواة هو وجود حجرات داخل الخلايا التي تحتوي على الدهون والبروتين التراكيب محددة. على الرغم من العضيات هي isolat جسدياإد، فإنها تحتاج إلى التواصل مع بعضهم البعض وتبادل المكونات الجزيئية من أجل الحفاظ على التوازن الخلوية. تضمن مسار إفرازية أن البروتينات والدهون توليفها في ER وصول إلى الوجهة النهائية الصحيحة التي تمارس وظيفتها. يمكن أيضا أن تكون متصلا عضيات داخل الخلايا عن طريق مواقع الاتصال الديناميكية التي تسمح الجزيئات (الدهون) التي يتم تبادلها مباشرة بين المقصورات. علاوة على ذلك، العديد من البروتينات قد لتجميعها في مجمعات مغايرة التغصن كبيرة أو المرتبطة بالأنواع الدهون محددة (الطوافات الدهنية / microdomains) لكى تصبح نشطة وظيفيا أو ليتم نقلها إلى وجهتها النهائية. كل هذه الجوانب البيولوجية تؤثر بشكل كبير على الخصائص الحركية للبروتينات، وبالتالي يمكن أن يتم التحقيق بشكل مناسب عن طريق التقنيات الموضحة أدناه. وقد استخدمت على نطاق واسع مجموعتنا FRAP والوجه جنبا إلى جنب مع المجهر الإلكتروني من أجل دراسة الهندسة المعمارية لائحة وشبه المختلفةالمجالات. لائحة هي المحطة الأولى من مسار إفرازية، ويلعب دورا رئيسيا في البروتين والدهون الفرز 5. بل هو عضية ديناميكية للغاية التي تعكس وظائف عديدة ومختلفة (أي البروتين والدهون والاتجار الحيوي والبروتين للطي، كا 2 + تخزين والإفراج عنهم، والتمثيل الغذائي أجنبي بيولوجيا) نطاقات فرعية متميزة. ومع ذلك، على الرغم من أنها شكليا، مكانيا، ومتميزة وظيفيا، وهذه المجالات هي مستمرة مع بعضها البعض، ويمكن تعديل الوفرة النسبية في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية والمرضية. أشهرها والمجالات عادة منفصلة مكانيا من ER هي المغلف النووية، وER ناعمة وخشنة، ولكن نحن وآخرون أظهرت أن هناك هياكل ER مع بنية أكثر تفصيلا وتنظيم ثلاثية الأبعاد في مختلف أنواع الخلايا و الأنسجة تحت الظروف الفسيولوجية التي يمكن أيضا أن يتسبب من خلال محفزات المجهدة مثل نقص الأكسجة، المخدراتالإدارة، أو الإفراط في التعبير عن-ER المقيمين البروتينات عبر الغشاء 2،6 (والمراجع فيه). كما أننا أظهرنا مؤخرا وجود مثل هذه الهياكل في نماذج خلية من الأمراض التي تصيب الإنسان 1،7. تنشأ من صهاريج مكدسة من ER على نحو سلس، قدمت لهم اسم الجماعية من الشبكة الإندوبلازمية الملساء تنظيم (OSER) في عام 2003 6، على الرغم من أنها معروفة أيضا باسم karmellae، صفاحات، وبلوراني ER على أساس الهندسة المعمارية الخاصة بهم والتي، مثل بهم الحجم، ويمكن أن تختلف. بعد و transfected الخلايا مع GFP تنصهر إلى المنطقة عصاري خلوي من (TA) البروتينات-ER المقيمين (د EGFP-ER) رست الذيل، والميل dimerizing ضعيفة من GFP في العابرة يغير بشكل كبير من تنظيم وهيكل ER. وأظهرت التجارب FRAP وFLIP أن د EGFP-ER هو حر لنشر ضمن OSERs، وحقيقة أنه ينتقل من لائحة شبكي لOSER والعكس بالعكس &lt;م /&gt; يشير إلى أن المجاميع مستمرة مع شبكي ER المحيطة بها. وقد سمح لنا التحليل التركيبية لربط البيانات مضان مع وصفا مفصلا لOSER العمارة وتنظيم على مستوى النانو: تصنع دائما OSERs تتكون من أكوام من صهاريج تقرن من ER نحو سلس ولكن قد يكون لها أشكال مختلفة من التنظيم المكاني، مثل ترتيب بانتظام الجيبية صفائف أو جدلات، أو سداسية &quot;بلوراني&quot; صفائف أنبوبي. هذه تؤدي إلى إعادة ترتيب الأشكال التضاريسية مكعب 8 الذي، كما تم العثور في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية 9 والضغوط التالية مثل نقص الأكسجة 10، 11 العلاج من تعاطي المخدرات، والسرطان 9، قد تنطوي على إمكانات كبيرة كعلامات التركيبية. بعد هذه المظاهرة الأولى باستخدام GFP البروتينات الانصهار، استخدمنا تجارب التصوير لتحليل انتشار المجالات ER استجابة للعلاجات الدوائية 12، ASSESS ميل البروتينات الفلورية لoligomerise 13 في الخلايا، والتحقيق في دور متحولة، ALS المرتبطة البروتين TA في تشكيل المجاميع داخل الخلايا ER المنشأ التي قد تكون ذات صلة 1،8 المرضية لها. فقد قيل أن تشكيل المجاميع داخل الخلايا (والذي يحدث في كثير من الأمراض العصبية 14) قد تكون آلية وقائية تهدف إلى منع التفاعلات بين البروتينات متحولة السامة ومكونات الخلية المحيطة 15. ما يلي هو وصف لمجموعة من الأساليب المجهر الضوئي والإلكترون عن التحقيق الذي يبني-C محطة تندس المجالات مسعور في غشاء من لائحة، وتحليل سلوكهم دينامية وآثار على مدى تعبير على نطاق ER الهندسة المعمارية في الخلايا المستزرعة (انظر الشكل 1 لمخطط انسيابي للبروتوكول التجريبية).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>PP10110</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OxyFluor</td>
			<td>Oxyrase Inc.</td>
			<td>OF-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde Grade I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Uranyl Acetate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td>slightly radioactive</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82320</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EPON embedding medium kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lead Citrate </td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bench top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectral Confocal Microscope </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Microscope Cage Incubation System </td>
			<td>OkoLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultramicrotome </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Diamond knife </td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45 &deg;</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmission Electron Microscope </td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>steel culture cell chamber for 24 mm coverslip</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>CSC-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electron Microscopy grids</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>G300Cu</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells

الدهون والبروتينات في الخلايا حقيقية النواة يتم تبادل مستمر بين المقصورات الخلية، على الرغم من أن هذه تحتفظ تكوينها مميزة وظائف على الرغم من مرور interorganelle الجزيئية مكثفة. التقنيات الموضحة في هذه الورقة هي وسيلة قوية لدراسة البروتين والدهون التنقل والاتجار في الجسم الحي في بيئتهم والفسيولوجية. مضان الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP) وخسارة في مضان photobleaching من (FLIP) وتستخدم على نطاق واسع تقنيات التصوير الخلية الحية لدراسة الاتجار داخل الخلايا عن طريق إكسو التقامي المسار، والاستمرارية بين العضيات أو subcompartments، وتشكيل مجمعات البروتين، والبروتين التعريب في microdomains الدهون، والتي يمكن ملاحظتها في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. القيود المفروضة على هذه المناهج هي أساسا نتيجة لاستخدام البروتينات الانصهار الفلورسنت، وتشمل سلبياتها المحتملة مصطنعة الإفراط في التعبير عنايون في الخلايا وإمكانية الاختلافات في للطي والتعريب من البروتينات الموسومة والأم. أخيرا، وكما الحد من قرار المجهر الضوئي (حوالي 200 نانومتر) لا يسمح التحقيق في هيكل غرامة من ER أو subcompartments المحددة التي يمكن أن تنشأ في الخلايا تحت الضغط (أي نقص الأكسجة، وإدارة المخدرات، والإفراط في التعبير من عبر الغشاء البروتينات ER المقيم) أو في ظل ظروف مرضية، ونحن الجمع بين التصوير الخلية الحية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مثقف مع التركيبية يحلل على أساس نقل الإلكترون المجهري.

ويبين الشكل 2 دراسة FRAP سبيل المثال التنقل البروتين. ويتجلى تنقل د البروتين EGFP-ER من الانتعاش السريع بعد مضان photobleaching من OSERs في المبيض. للتحليل الكمي، وقد استمدت النصف الساعة وجزء المحمول من البيانات المقاسة معمليا عن طريق تركيب المعادلة monoexponential التالية: ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells at JoVE.com

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

نحن تصف النهج التصوير التي نستخدمها لتحقيق توزيع والتنقل من البروتينات الفلورية transfected المقيمين في الشبكة الإندوبلازمية (ER) عن طريق التصوير متحد البؤر الخلايا الحية. نحن أيضا تحليل ultrastructurally تأثير التعبير عنها على بنية هذا الحيز التحت خلوية.

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Views.  Fondazione Filarete.  نحن تصف النهج التصوير التي نستخدمها لتحقيق توزيع والتنقل من البروتينات الفلورية transfected المقيمين في الشبكة الإندوبلازمية (ER) عن طريق التصوير متحد البؤر الخلايا الحية. نحن أيضا تحليل ultrastructurally تأثير التعبير عنها على بنية هذا الحيز التحت خلو?...

Video: Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

العد وتحديد صلاحية خلايا مثقف

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

تصور من خلايا خلالية لشبكة (ICC) في الفئران كاجال

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

إعداد كروموسوم من الخلايا المستزرعة

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

النقل عضية في مثقف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا: S2 الخط الخليوي والخلايا العصبية الابتدائية.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

فحوصات مراسل المتوازية نطاق واسع في خلايا الثدييات مثقف

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

التصوير المحلية الكالسيوم<sup&gt; 2+</sup&gt; الإشارات في خلايا الثدييات مثقف

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

رصد الباطنة شبكية الكالسيوم باستخدام<em&gt; Gaussia</em&gt; luciferase المراسل SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

تصور هيولي باطني شبكية النطاقات الفرعية في الخلايا المستزرعة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video