This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen&#8217;s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.

وأجريت الإجراءات التجريبية التالية بما يتفق بدقة مع الحيوانات (إجراءات علمية) لعام 1986. 1. إعداد البلازميد الحمض النووي ل microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البلازميد pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP مع DNA البلازميد عدة التجارية تنقية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وتمييع DNA البلازميد إلى تركيز المحلول النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي ترانسبوزاز التي تحتوي على البلازميد pT3TS / Tol2 14 بواسطة إنزيم BamHI تقييد الهضم، وبعد بروتوكول الشركة المصنعة. هذه الخطوة يمكن أن تمتد بين عشية وضحاها. ترسيب الحمض النووي خطي من قبل استخراج الفينول / الكلوروفورم، في أعقاب بروتوكول قياسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في المختبر نسخ الرنا المرسال ترانسبوزاز من البلازميد خطي مع مجموعة النسخ التجارية لكميات كبيرة من الحمض النووي الريبي توج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وتمييع وقسامة لتركيز المحلول النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر في nuclease خالية من المياه. ضمان الجودة من الحمض النووي الريبي المنقى مع الأم 1-2٪ TAE (40 ملي تريس، 20 ملم حمض الخليك، 1 ملم EDTA) الاغاروز الكهربائي هلام (80-120 V). تخزين الحمض النووي الريبي في -80 ° C. </li></ol> 2. Microinjection من البلازميد الحمض النووي للعابر التعبير الجيني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة حقن الاغاروز لعقد البويضات المخصبة خلال الحقن. صب السائل 3٪ الاغاروز إلى 90 مم طبق بتري. دع بارد الاغاروز إلى 40-50 درجة مئوية وإضافة حقن مكروي العفن على شكل وتد-TU-1 على رأس الاغاروز السائل. بعد تصلب في درجة حرارة الغرفة، والسماح للبقية الاغاروز في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل إزالة العفن. قوالب حقن مكروي تخزين عند 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قسامة من الحل الحقن. نفذ الخطوات التالية على الجليد. ماصة 1 ميكرولتر من DNA البلازميد (تركيز النهائي من 10 نانوغرام / ميكرولتر)، 2 ميكرولتر من ترانسبوزاز مرنا (النهائي تركيز 20 نانوغرام / ميكرولتر)، 2ميكرولتر من 10 ملغ / ميكرولتر رودامين B ثيوسيانات-ديكستران، 2 ميكرولتر من حل 5X Danieau (290 مم كلوريد الصوديوم، 3.5 ملي بوكل، 2 ملي MgSO 4، 3 ملي كا (NO 3) 2، 25 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.6) إلى الحجم النهائي من 10 ميكرولتر في nuclease خالية من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإبر من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات من 1 مم تحتوي على خيوط الداخلي عن طريق سحب الشعرية في اتجاهين متعاكسين مع ممص مكروى بولير. استخدام البرنامج التالي: حرارة 530، وسحب 200، سرعة 80 و 150 مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل إبرة واحدة مع 2 ميكرولتر من محلول الحقن (أبقى على الجليد). تجنب الفقاعات من خلال سحب بعناية غيض microloader حين الافراج عن حل في شعري. كسر بعناية غيض من الإبرة مع ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيم حجم الانخفاض مع مضخة هوائية بيكو. قياس قطرة قطره / حجم (V = 4/3 πr 3) وضبط حجم الانخفاض مع ميكرومتر العين تحت المجسام في dimethylpolysiloxane. ونحن نوصي100 ميكرون، أي ما يعادل 0.5 NL. هذا يؤكد تركيزات موحدة وقابلة للتكرار في كل جنين حقن. عاير تركيز حقن وضبط كل بناء وإعداد البلازميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع بيضات ملقحة (الشكل 1A) التي تم الحصول عليها من كرة عرضية من تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 15 مع تيراغرام (lysC: dsRed2) nz50Tg 16 في قوالب من لوحة حقن عن طريق استخدام 3 مل pastette. وفي الوقت نفسه، والحفاظ على غيض من قبل مستعدة حقن إبرة في dimethylpolysiloxane لتجنب الحل من تجفيف والتخثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن قطرة premeasured (100 ميكرون الموافق 0.5 NL) تحت المجسام من خلال المشيمه في blastodisc 17، قبل أن الانقسام الأول (الشكل 1A). الحقن في مرحلة خلية واحدة يزيد من احتمال وجود توزيع موحد من DNA البلازميد وRNA في كتلة الخلايا النامية وإمكانية انتقال سلالة الجرثومية. ومنالجدير بالذكر أن التعبير عن ثوابت في كثير من الأحيان يميل إلى أن يكون الفسيفساء. </li></ol> 3. الشرطي تحول الجلد خلية بنسبة 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة حقنه في حل 0.3x Danieau والاحتفاظ بها في 28.5 درجة مئوية في حاضنة. إزالة بويضة غير مخصبة من الطبق في المجال المرحلة 17. وحقن شارك رودامين B ثيوسيانات-ديكستران يمكن استخدامها كعنصر تحكم حقن تحت المجسام الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجنة الشاشة في 24 HPF (التسميد آخر ساعة) للتعبير القلب من EGFP. مواصلة رفع cmlc: EGFP الأجنة الزرد إيجابية حتى 72 HPF. ترصد بدقة نوعية المياه (0.3x Danieau). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المشيماء تلك الأجنة التي لم تفقس مع ملقط في 72 HPF. كزة بعناية المشيماء مع 1 ملقط وتسحبه بعيدا باستخدام البعض. اختر الأجنة لlysC: dsRed2 التعبير باستخدام المجسام الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من 10 مليالأسهم من (Z) -4-Hydroxytamoxifen إلى 20 مل من محلول 0.3x Danieau (تركيز النهائي من 5 ميكرومتر). استخدام 4-OHT الحث-حل لطبق بيتري قياسي واحد (90 ملم) على دفعة من 40-60 الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة في طبق بتري جديدة تحتوي على 20 مل من تقدم طازجة الحث-حل. لديه 4-OHT ليتم تخزينها والتعامل معها في الظلام. قد يتم الكشف عن أول علامات التعبير 2 ساعة بعد تحريض بدء. في خطوة الاستقراء يمكن تمديد بين عشية وضحاها، مع الأخذ في الاعتبار أن الأولية الخلية المضيفة: التفاعلات الخلية سابق للورم يمكن أن يحدث بالفعل بعد ساعات قليلة من العلاج. </li></ol> 4. تصاعد وتصوير لايف من اسماك الزرد اليرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 60 مم طبق بتري عن طريق إدخال حفرة يبلغ قطرها 18-20 ملم. استخدام عالية فراغ سيليكون الشحوم لتغطية وختم ثقب في الجزء السفلي الخارجي للطبق بيتري مع 25 مم الغطاء الزجاجي (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1٪ نقطة انصهار منخفضة (LMP) الاغاروز. الحفاظ على واحد أنبوب 1.5 ملمن LMP الاغاروز عند 37 درجة مئوية في كتلة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مسبق تيراغرام (krt4: KalTA4-ER T2، UAS: EGFP-HRAS G12V، lysC: dsRed2) اليرقات لالخضراء الفلورسنت خلايا الجلد وdsRed2 إيجابي الفطري التعبير الخلايا المناعية، تحت المجسام الفلورسنت. تخدير اليرقات عن طريق إضافة 1 مل من تريكين 18 0.4٪ إلى الحل تحريض 20 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقات انتقاؤه مع pastette في الاغاروز LMP السائل. السماح لليرقات تغرق في LMP الاغاروز ونقلها على الزجاج غطاء (الشكل 1B). توجيه الأجنة تحت المجسام. اليرقات يجب أن توضع مباشرة على الزجاج لتقليل المسافة العمل (حتى 6 اليرقات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الاغاروز LMP مع تريكين تحتوي على حل تحريض بعد أن تصلب (الشكل 1B السهم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة اليرقات جزءا لا يتجزأ باستخدام الفلورسنت المقلوب، ليزر المسح الضوئي أو القرص الغزل المجهر متحد البؤر. استخدام 40X 63X أوالهدف كأهداف مع مسافات العمل الطويلة تمكن تركز من خلال يرقات بأكملها. </li></ol>

<ol>
	<li>Kajita, M., Sugimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+acts+as+a+key+regulator+in+epithelial+defence+against+transformed+cells.">Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells.</a> Nature communications. 5, 4428 (2014).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).</li><li>Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Tumor+Initiation+in+Zebrafish+Larvae+Reveals+a+Trophic+Role+for+Leukocyte-Derived+PGE+2.">Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2.</a> Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).</li><li>Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4/UAS+transgenic+tools+and+their+application+to+zebrafish.">Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish.</a> Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).</li><li>Gong, Z., Ju, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Cre+recombinase+activity+by+mutated+estrogen+receptor+ligand-binding+domains.">Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).</li><li>Gerety, S. S., Breau, M. a., Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+transgene+expression+system+for+zebrafish+and+chick.">An inducible transgene expression system for zebrafish and chick.</a> Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+Using+Gal4+in+Zebrafish.">Trapping Using Gal4 in Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).</li><li>Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Santoriello, C., Gennaro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kita+driven+expression+of+oncogenic+HRAS+leads+to+early+onset+and+highly+penetrant+melanoma+in+zebrafish.">Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish.</a> PloS One. 5 (12), e15170 (2010).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiSite+Gateway+Three-+Fragment+Vector+Construction+Kit.">MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit.</a> Protocols and Product Manuals. 12537-023, (2010).</li><li>Petersen, L. K., Stowers, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gateway+MultiSite+Recombination+Cloning+Toolkit).">A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit).</a> PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).</li><li>Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Gateway+to+MultiSite+Gateway+in+one+recombination+event.">From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event.</a> BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).</li><li>Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+the+(E)+and+(Z)+isomers+of+the+antiestrogen+tamoxifen+and+its+metabolite,+hydroxytamoxifen,+in+tritium-labeled+form.">Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form.</a> The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).</li><li>Murphy, C., Langan-Fahey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+hydroxylated+metabolites+of+tamoxifen+that+control+the+proliferation+of+estrogen-responsive+T47D+breast+cancer+cells+in+vitro.">Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro.</a> Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).</li><li>Furr, B. J. A., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+clinical+uses+of+tamoxifen.">The pharmacology and clinical uses of tamoxifen.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).</li><li>Akerberg, A. a., Stewart, S., Stankunas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Control+of+Transgene+Expression+in+Zebrafish.">Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish.</a> PloS One. 9 (3), e92217 (2014).</li><li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally-controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish.">Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PloS One. 4 (2), e4640 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

خلال مرحلة التطور الجنيني ونمو اليرقات، ويتكون الجلد الزرد الجنينية من طبقتين الظهارية، وطبقة سطحية دعا محيط بالأدمة وطبقة من الخلايا الكيراتينية القاعدية التي تعلق على الغشاء القاعدي الأساسي 19 (الشكل 1C، أ). بروتوكول المعروضة هنا يصف طريقة واضحة للحث مشروط تحول الخلية سابق للورم في طبقة الجلد السطحية لليرقات الزرد، ويسمح للتحليل التفاعل لاحق مع الخلايا المناعية الفطرية عن طريق التصوير الحي. المنهجيات الأساسية في بروتوكول لدينا تتبع تقنيات الزرد راسخة 9-13، وبروتوكول لدينا يمكن أن تتكيف بسهولة وتعديلها. المروج krt4 5 المستخدمة هنا يدفع KalTA4-ER T2 التعبير على وجه التحديد في طبقة الجلد الأبعد (الشكل 1C، ب). ومع ذلك، فإن وحدات متعددة المواقع بوابةاستنساخ استراتيجية، وتستخدم لتوليد krt4: KalTA4-ER T2 بناء (1D الشكل، أ)، ويوفر إمكانية استنساخ أي مروج للاهتمام أمام KalTA4-ER T2 في خطوة الاستنساخ واحدة. للتكيف من طريقة المقدمة في هذه الوثيقة هو بالتالي من الممكن بالنسبة لمعظم الأنسجة خلال مرحلة التطور الجنيني ومراحل اليرقات. توافر تسلسل المروج هو بهذا العامل المحدد. وعلاوة على ذلك، أي ما يقرب من الجينات في المصالح المستنسخة وراء UAS يمكن overexpressed مشروط في مراحل تنموية مختلفة عن طريق استخدام والمكاني وتسيطر زمنيا التعبير KalTA4-ER T2. لذلك، لدينا بروتوكول يمكن تكييفها لأداء مشروط التعبير الجيني في أي نوع من الأنسجة من الاهتمام في يرقات الزرد، بطريقة الفسيفساء. يمكن للمرء أيضا تحسين وضع المجهر في سبيل العيش صورة أعمق الأنسجة مثل الكبد أو البنكرياس. وصفناها تطبيق واحد باستخدام بروتوكول انهإعادة، وبالمثل، يمكن للمرء أن بإفراط عن جهري التهاب الأخرى التي تستخدم هذا البروتوكول لدراسة تنظيم الاستجابات الالتهابية، باعتبارها واحدة يمكن أن يعيش بسهولة العدلات صورة والتغيرات السلوكية بلعم التالية تحريض واعتقال في التعبير عن المغير التهابات مرشح. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول تكييفها أيضا أن يكون مفيدا لأولئك الذين يريدون لتتبع حركة الخلية وتغيير السلوك خلال مراحل مختلفة من التشكل الأنسجة وتشكيل هيئة وصورة حية أخيرا تفاعل الفطرية تفاعلات الخلايا المناعية مع غيرها من الأنساب الخلية المحددة التي يمكن أن تستهدف قبل KalTA4-ER نظام T2 / UAS التعبير محرض. استخدمنا ناقلات pDestTol2CG من Tol2kit الزرد 23 - 20 التي تحتوي على cmlc2: EGFP والسلطة الفلسطينية كاسيت (1D الشكل، أ) والتي تتيح اختيار لاحقة من الأجنة التي كتبها الخضراء الفلورسنت قلوب إيجابية باعتباره حد ذاتهافصل من الكتاب المقدس علامة 20 التي تبسط عملية الفرز F0. ومما يسهل والإدراج المستقر للينقول يحيط الجينات في المصالح في الجينوم من شارك في حقن الحمض النووي البلازميد مع ترانسبوزاز مرنا. إعداد DNA البلازميد ومرنا ترانسبوزاز ل microinjection يتبع البروتوكولات القياسية. ومع ذلك، فإن التكامل الناجح للبناء في الجينوم يعتمد على تبديل استنادا Tol2-14. هذا يسلط الضوء على اهتمام خاص لدفعها إلى العمل على الجليد تحت ظروف معقمة لتجنب التلوث والتدهور التي كتبها RNases وDNases. حقن مكروي في خلية واحدة الأجنة مرحلة هي تقنية قوية وراسخة لتحقيق مكاسب وخسائر من الدراسات وظيفة في 9،10 الزرد. على الرغم من أن الشخص المدربين تدريبا جيدا يمكن حقن بسهولة في صفار البيض من أكثر من 1،000 الأجنة في 1 ساعة، والحقن في blastodisc (الشكل 1A، النجمة) يتطلب المزيد من الخبرة والتدريب. الحرجة أثناء هذا الإجراء طليالي التعامل مع الإبرة. الإبرة يجب أن تكون رقيقة جدا لاختراق الخلية دون ضرر، وبالتالي لابد من كسر فقط على طرف ذاته. من المهم للسيطرة بانتظام وقياس حجم انخفاض خلال الحقن لضمان حقن موحد في كل جنين. التعامل معها بعناية، الإبرة يمكن أن تستخدم لتدوير الجنين. وغالبا ما يحتاج هذا للعثور على blastodisc وزاوية الاختراق المثلى. تركيز الحمض النووي وترانسبوزاز مرنا المستخدمة للحقن يكاد يكون من المؤكد يؤثر على كفاءة التعبير. الجرعات العالية يمكن أن يؤدي إلى زيادة نسبة الخلايا معربا عن التحوير ولكن مع تركيزات أعلى من الحمض النووي (&gt; 50 نانوغرام / ميكرولتر) وترانسبوزاز مرنا (&gt; 100 نانوغرام / ميكرولتر) أيضا إمكانية الآثار السامة بين الأجنة المحقونة لا تنشأ. ونحن نحبذ استخدام 10 نانوغرام / DNA ميكرولتر و 20 نانوغرام / ميكرولتر ترانسبوزاز مرنا للحقن، والتي تتطابق إلى 50 خريج من DNA البلازميد و 100 خريج من الحمض النووي الريبي في الإدارة الانتخابية حقنريو. 100٪ من الأجنة المحقونة مع هذه التركيزات لا تتطور بشكل طبيعي، وبين 40-70٪ عرض EGFP-HRAS G12V التعبير، وبعد 4-OHT الاستقراء، وهذا يتوقف على كفاءة الحقن في خلية واحدة. بين الأجنة إيجابية ونحن عادة تجد ما يقرب من 30٪ أن يكون 1-10 استنساخ، و 40٪ أن يكون 10-50 استنساخ و 30٪ وجود أكثر من 50 الحيوانات المستنسخة. نظرا لأهداف أبحاثنا، فإننا نفضل استخدام الأجنة مع عدد أقل من الحيوانات المستنسخة معربا عن EGFP-HRAS G12V. نختار الأجنة مع 10-50 استنساخ لتجارب عابرة لدينا. لتوليد الأسماك مؤسس المعدلة وراثيا، ونحن نوصي لتحديد الأجنة مع كل من EGFP علامة القلب الإيجابية وعدد كبير من الحيوانات المستنسخة إيجابية EGFP-HRAS G12V في البشرة بهم فقط. (Z) -4-Hydroxytamoxifen يخضع لرابطة الدول المستقلة العابرة (EZ) interconversion عند تعرضها للضوء 24 ساعة. وقد وجد أن الأيزومر رابطة الدول المستقلة (E) هو 100X أقل المضادة للاستروجين من نظيره العابرة لل25،26. Exposurلذا الإلكترونية للضوء لابد من تجنبها. الحل الأسهم 4-OHT المذاب في الإيثانول يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية في الظلام على مدى فترة زمنية طويلة. من المستحسن استخدام مربع لحماية أطباق بتري من خلال ضوء الهدف تحريض الجينات داخل الحاضنة والنقل. على الرغم من أن مجال التصوير صغيرة جدا وتعرض 4-OHT للأشعة فوق البنفسجية يتم تقليل إلى أدنى حد ممكن، تبادل مستمر من حل تحريض كل 2 ساعة بينما يوصى التصوير على مدى فترات زمنية أطول للحفاظ على مستويات التعبير القصوى. 4-OHT permeabilizes بشكل فعال من خلال المشيمه وطبقات الجلد الأبعد خلال مرحلة التطور الجنيني الزرد، وبالتالي فإنه يمكن أن تحفز التعبير الجيني بسرعة كبيرة. يمكننا أن نلاحظ بسهولة الانبعاثات EGFP بعد 2 ساعة من الحث وتم الإبلاغ عن أن العلامات الأولى للتعبير الجينات المستهدفة ويمكن ملاحظة بعد 1 ساعة والهضبة بعد 3 ساعات من العلاج 8. قد يكون الاختلاف يرجع إلى المروج المختلفة المستخدمة في دراستنا. كما تم العلاقات العامةذكرت eviously أن 4-OHT العلاج جرعة يعتمد 8،27، اخترنا لاستخدام أعلى تركيز المبلغ عنها من 5 ميكرومتر لتحقيق مستويات التعبير قوية وقابلة للتكرار في نهجنا عابر. وهذا ينبغي أن نضمن أن كل الخلايا التي تحمل التحوير من شأنها أن تحفز التعبير الجيني الهدف. أنه يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن نهج عابرة المقدمة هنا يمكن أن يؤدي إلى تفاوت مستويات التعبير نظرا لإمكانية متعددة وعشوائية الأحداث الجينوم الإدراج. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام مرنا ترانسبوزاز في Tol2 الخلفية المعدلة وراثيا من تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 يمكن أن يؤدي إلى التبديلات المحتملة للالتحوير UAS التي يمكن أن تؤدي في إسكات الجينات أو التعطيل. ومع ذلك، كما أن طريقة المقدمة هنا يمثل نهجا عابرة، والاختيار من الأجنة لاحقة لحقن إلزامي. وقد وجدت العديد من المختبرات التي متواليات UAS تميل إلى أن تصمت في النسل المعدلة وراثيا، وبالتالي فيحقن ثنائي في pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP بناء في تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 الأجنة قد لا تكون فعالة مثل حقن UAS بناء في تيراغرام (krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: GFP ) الأجنة. استخدام خط المعدلة وراثيا مستقر تيراغرام (krt4: KalTA4-ER T2) عبروا مع تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 سيسمح للرصد الدقيق للتشغيل / إيقاف حركية الوقت جرعة يعتمد التنشيط الجيني 4-OHT . خطوة حاسمة خلال تصاعد اليرقات هي نقل إلى الاغاروز LMP وعلى غطاء زجاجي (الشكل 1B). هو فقط هناك فترة زمنية قصيرة للسائلة في درجة الحرارة LMP الاغاروز التي تسمح للنقل آمنة والتوجه لليرقات انتقاؤه دون الإضرار الأسماك إما عن طريق الصدمة الحرارية أو تصلب هلام. يجب الموجه اليرقات مباشرة على الزجاج غطاء للحد من مسافة العمل لanaly المجهري لاحقجهاز الأمن والمخابرات. وهذا يمكن أن يكون عاملا يحد من خلال الفحص المجهري اختيار الأهداف المناسبة إلزامي. مرة واحدة محمولة، اليرقة يمكن الحفاظ على من ساعات إلى أيام. ومشروطية في النظام النموذجي المقدمة في هذه الوثيقة يسمح للتحول المتكررة من جانب تفعيل 4-OHT من التحوير. نظام التعبير يعتمد على وجود 4 OHT وبالتالي KalTA4 تسيطر تعبير عن الجينات في المصالح هو عكسها (1D الشكل، ب). وعلى النقيض من لجنة المساواة العرقية-ER T2 / نظام السلمون المدخن، مما يسهل على الجيني لا رجعة فيه الحدث إعادة التركيب 28، KalTA4-ER T2 / UAS يمكن تفعيلها وأبطل مفعولها على إضافة أو إزالة 4-OHT وهذه الإمكانات لتحريض المتكررة هي ميزة من هذه التقنية خلال لجنة المساواة العرقية-ER T2 نظام / السلمون المدخن. ومع ذلك، فإن شرط لمستويات ثابتة من 4 OHT وجود قيود إذا كانت التجربة لابد من فترات طويلة من أيام إلى أسابيع.

فرط نمو ذرية خلية سابق للورم داخل ورقة الظهارية عادية على خلاف ذلك تعتمد بقوة على التفاعل مع المكروية لها. التفاعل مع الأنسجة مضيفه من المرجح أن يكون المحدد الرئيسي لما إذا كانت الخلية سابق للورم قادرة على تأسيس مكانة نسيلي لمواصلة تطوير إلى السرطان كاملة. وعلى الرغم من أهميته في التنمية، وهذه المرحلة الأولية من تطور سرطان هي التي يتعذر الوصول إليها في الأنظمة النموذج الأكثر شيوعا في الجسم الحي. الزرد، دانيو rerio، هو نموذج كائن راسخة للدراسات التصوير الحية بسبب الشفافية في جميع أنحاء التنمية، وإمكانية للتلاعب الجيني، وسهولة الوصول للأدوية للذوبان في الماء. الدراسات الحديثة باستخدام نموذج الزرد اليرقات، overexpressing الجين الورمي البشري HRAS G12V لتحويل الخلايا الظهارية، وأظهرت أن الخلية المضيفة إشارات مشتقة، ولا سيما H 2 O 2 الرصاص لتجنيد الخلايا المناعية الفطرية. ومن المثير للاهتمام، وتجنيد خلايا المناعة، العدلات والضامة وقد أظهرت، أن يكون لها دور التغذية في دعم انتشار الخلايا سابق للورم 2،3. من أجل فهم الأحداث في وقت مبكر من بدء الورم والتقدم فضلا عن مساهمة استجابة التهابية، ويحتاج المرء أن يكون قادرا على صورة هذه الأحداث من أقرب نقطة زمنية فصاعدا. ولذلك فمن الضروري للسيطرة على التحولات خلية بطريقة معينة الزمنية والأنسجة. علينا الاستفادة من نظام / UAS GAL4 التي تم تكييفها بنجاح من ذبابة الفاكهة 4 للتعبير مشروط في الجين الورمي البشري HRAS G12V تحت سيطرة المروج الجلد محدد الكيراتين 4 (krt4) 5. نسخة معدلة من النسخي المنشط GAL4، وهي KalTA4 6، يمكن التعبير عن HRAS G12V تحت سيطرة المنبع تفعيل تسلسل (UAS). للحث مشروط التعبير المنشط النسخي، وقد تنصهر KalTA4 إلى متحولة ملزم يجند المجال من α مستقبلات هرمون الاستروجين الإنسان (ER T2) 7 الذي يربط على وجه التحديد 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. في غياب 4-OHT لا بد من ER T2 في السيتوبلازم من البروتينات الحرارة صدمة. على 4 OHT ملزمة الحرارة في صدمة البروتينات تنفصل، والسماح لإزفاء النووي من KalTA4-ER T2 وتفعيل لاحق من UAS تسيطر الجينات في المصالح 8 (الشكل 1C، ب). كما يعتمد هذا النظام التعبير عن وجود 4 OHT، وKalTA4 تسيطر تعبير عن الجينات في المصالح هو عكسها. وعلى النقيض من لجنة المساواة العرقية-ER T2 / نظام السلمون المدخن، الأمر الذي يؤدي إلى حدث إعادة التركيب لا رجعة فيه، وتحريض تفعيل النسخي التي كتبها KalTA4-ER T2 هو عكسها عن طريق إضافة أو إزالة 4-OHT. وألو بروتوكول التالية<html> WS تحولا مشروط من خلايا الجلد في يرقات الزرد ومراقبة لاحقة من التفاعل مع الخلايا المناعية الفطرية التي كتبها الفلورسنت التعبير البروتين. المنهجيات الأساسية المستخدمة في هذا البروتوكول هي مماثلة لبعض التقنيات المستخدمة عادة داخل المجتمع الزرد 9-13. توليد واستخدام توفيقية من خطوط المعدلة وراثيا مع Microinjection من يبني المعدلة وراثيا تمكن نهج عابرة فقط لتحويل الخلايا واحد بطريقة الفسيفساء. نفاذية الأكسجين من الجنينية واليرقات الجلد الزرد تثير إمكانية لمرور الزمن الدراسات التصوير الحي من قبل عالية الدقة المجهر من ساعات إلى أيام. وعلاوة على ذلك، فإن الوصول إلى الأدوية للذوبان في الماء تسمح دراسات الآلية المستقبلية ورصد الأحداث البيولوجية خلية في الجسم الحي والتي قد تؤدي إلى فهم أفضل للالمراحل الأولى من تطور مرض السرطان. _content &quot;&gt; هذا البروتوكول يمكن تكييفها لأداء مشروط التعبير الجيني في أي نوع من الأنسجة من الاهتمام في يرقات الزرد، بطريقة الفسيفساء. يمكن للمرء أيضا تحسين وضع المجهر في سبيل العيش صورة أعمق الأنسجة الأخرى من الجلد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1104">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:197px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(Z)-4-Hydroxytamoxifen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td>dilute in ethanol and store in the dark at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>20x/0,5 Ph2 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>40x/1,2W Korr &#8734;/0,14-0,18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">63x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>63x/1.4 Oil Ph3 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 510 META</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0171</td>
			<td>Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DMPSV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning high-vacuum silicone grease&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MKBL4135V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent stereoscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection mold TU-1</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axiovert 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>PV820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-90A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8881</td>
			<td>10mg/&#956;l in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M80</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine/MS-222</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Low Melting Point Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>25:24:1, v/v</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of innate immune and preneoplastic cell interactions using an inducible gal4/uas expression system in larval zebrafish skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

تم جمع nz50Tg 10-15 دقيقة بعد الإخصاب (الشكل 1A) للحصول على 1-مرحلة خلية الأجنة بيضات ملقحة من عبور بين تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V) io006 وتيراغرام (dsRed2 lysC). بعد الحقن أثيرت الأجنة حتى 3 DPF، قبل الاستقراء مع 4-OHT وتصاعد للتصوير الحية (الشكل 1B). 2-6 بعد ساعة الاستقراء وضعت الأجنة التي شنت إما تحت المجهر الفلورسنت المقلوب (الشكل 2A) أو مجهر مقلوب مبائر (الشكل 2B-C) وتصويرها لمدة 2-3 ساعة مع فترات 1.5 دقيقة. ويمكن تحديد خلايا الجلد السطحية سابق للورم عن طريق التشكل أكثر تنوعا مقارنة مع الخلايا الكيراتينية العادية، فضلا عن الانبعاثات الفلورية الخضراء للغشاء محلية EGFP-HRAS G12V. وقد تم اختيار مناطق التصوير للمشاركة في توطين سابق للورم خلايا الجلد والخلايا المناعية الفطرية (الشكل 2A رأس السهم). نظرا لMIG سريععملية التموينية من العدلات تم اختيار فترات الوقت الفاصل بين أن يكون بين 1-1.5 دقيقة مع Z كومة خطوة أحجام 0،7-1،7 ميكرون للحصول على أقصى قدر من التوقعات شدة (الشكل 2، فيديو 1). وهناك مجموعة واسعة من السلوكيات التي يمكن ملاحظتها في حين التصوير الحي: العدلات تهاجر بجوار وتحت خلايا سابق للورم (الشكل 2C، فيديو 1)، تشكل اتصالات مباشرة إلى الخلايا (الشكل 2B و C)، وإزالة بقايا خلايا سابق للورم أن الخضوع موت الخلايا المبرمج (فيديو 1)، أو بنشاط تبتلع أجزاء من خلايا سابق للورم (لا يظهر). لالتقاط مجموعة كاملة من التفاعلات، فإنه من المستحسن اتباع السلوكيات من خلال الوقت الفاصل بين التصوير الحي. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" width="700px" /> الشكل 1: تخطيطي للالمشروط تحول خلايا الجلد في يرقات الزرد. (A) صورة من البيضة الملقحة من تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V، lysC: dsRed2) الزرد في 10 دقيقة بعد الإخصاب (MPF). ويحيط البويضة المخصبة من قبل المشيمه (رأس السهم). الموقع للحقن هو blastodisc (النجمة)، التي شكلتها تيارات حشوية من صفار البيض (السهم) الذي يعرف القطب الحيواني من الجنين. (ب) تركيب اليرقات الزرد. 60 ملم طبق بتري مع 18-20 ملم حفرة (رأس السهم) التي مختومة من قبل 25 مم غطاء زجاجي. ويجمد اليرقات الزرد والتي شنت على غطاء زجاجي بنسبة 1٪ الاغاروز آخر دورة شهرية. ويستخدم 0.3x Danieau حل (السهم) التي تحتوي على 5 ميكرومتر 4-OHT لتغطية الاغاروز LMP. (C) 4-OHT الناجم عن التحولات من خلايا الجلد السطحية. (أ) تخطيطي عبر الملف الشخصي قطاعات من الجلد اليرقات. يتكون الجلد الجنينية واليرقات من طبقتين الخلايا الظهارية، وهي طبقة الخلايا السطحية وطبقة الخلايا القاعدية من الخلايا الكيراتينية التي تتصل الغشاء القاعدي الأساسي (BM). (ب) التعبير عابر النظام رس لحث على استنساخ الخلايا سابق للورم بين خلايا الجلد السطحية. وأعرب عن KalTA4-ER T2 حصرا في طبقة الجلد الأبعد مدفوعا المروج krt4 (الصفراء). التعبير فسيفساء من KalTA4-ER T2 ينشط UAS للرقابة (الأزرق) EGFP-HRAS G12V التعبير في الخلايا السطحية، مما يؤدي إلى استنساخ الخلايا سابق للورم (الخضراء). (D) تخطيطي لنظام التعبير عابر. (أ) كاسيت Tol2 لل pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP ناقلات التعبير المستخدم عابر (ب) الحث الشرطي التعبير المنشط النسخي. وتنصهر KalTA4 إلى متحولة ملزم يجند مجال الاستروجين البشري مستقبلات α (ER T2) الذي يربط على وجه التحديد 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT). في غياب 4-OHT لا بد من ER T2 في السيتوبلازم من البروتينات الحرارة صدمة (Hsp90). على 4 OHT ملزمة Hsp90 يتفكك، والسماح لإزفاء النووي من KalTA4-ERT2 وتفعيل لاحق من UAS تسيطر EGFP-HRAS G12V التعبير. مقياس شريط A = 500 ميكرون. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" width="700px" /> الشكل 2: تصوير مباشر من سابق للورم والفطري تفاعل الخلايا المناعية. (AC) صور ل4 DPF تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V، lysC: dsRed2) الجنين الذي تم حقنه مع pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP وترانسبوزاز مرنا في مرحلة خلية واحدة. واتخذت صورة بعد 6 ساعات من 4 OHT الاستقراء (A) نظرا الجانبي المنطقة tailfin في 6 ساعات بعد العلاج، وتبين بقع من EGFP-HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد (السهم)، وlysC: dsRed2 + العدلات (رأس السهم). (BC) صور الممثل تاكين من متحد البؤر فيلم مرور الزمن، والتي تبين العدلات (أحمر) التفاعلات مع EGFP-HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد (الخضراء). (ب) خلية سابق للورم تشكل امتدادا filopodial قصيرة مع الاتصال العدلات (رأس السهم). (C) العدلات (الأحمر) هو على اتصال وثيق لاستنساخ خلايا الجلد سابق للورم (الخضراء). شريط النطاق في A = 100 ميكرون. B / C = 50 ميكرون. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52107/Video_1.mov" target="_blank">الفيديو 1</a> : الوقت الفاصل بين التصوير المباشر لسابق للورم والفطري تفاعل الخلايا المناعية. الوقت الفاصل بين 4 DPF تيراغرام (UAS: EGFP-HRAS G12V، lysC: dsRed2) الجنين، حقن مع pTol2-krt4: KalTA4-ER T2، cmlc2: EGFP وترانسبوزاز مرنا في مرحلة خلية واحدة. متحد البؤر فيلم الوقت الفاصل بين الفترة من 6-9 حواورس بعد 4-OHT تحريض تظهر lysC: dsRed2 + العدلات (أحمر) التفاعلات مع EGFP-HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد (الخضراء). العدلات تهاجر بجوار وتحت خلايا سابق للورم وإزالة بقايا خلية سابق للورم أن يخضع لموت الخلايا المبرمج. فترات الوقت الفاصل بين 1.5 دقيقة أكثر من 3 ساعة مع Z كومة خطوة الأحجام من 1.3 ميكرون.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin at JoVE.com

التصوير الحي لتفاعلات الخلايا المناعية الفطرية وخلايا ما قبل الورم باستخدام نظام التعبير Gal4/UAS المحفز في جلد يرقات الزرد | علم الأحياء التنموي | فيديو

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

دراسة أقرب أحداث تطور الخلية سابق للورم والفطري تفاعل الخلايا المناعية غير محورية لفهم وعلاج السرطان. نحن هنا تصف طريقة للحث مشروط التحولات الخلايا الظهارية والتصوير الحي لاحق من الفطري تفاعل الخلايا المناعية مع HRAS G12V معربا عن خلايا الجلد في يرقات الزرد.

تصوير لايف الفطرية المناعي والتفاعلات سابق للورم الخلية باستخدام نظام التعبير / UAS محرض GAL4 في اليرقات الزرد الجلد

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

live-imaging-innate-immune-preneoplastic-cell-interactions-using-an

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Immune System

SCIENTISTS IN ACTION

11.8K Views.  The University of Edinburgh.  دراسة أقرب أحداث تطور الخلية سابق للورم والفطري تفاعل الخلايا المناعية غير محورية لفهم وعلاج السرطان. نحن هنا تصف طريقة للحث مشروط التحولات الخلايا الظهارية والتصوير الحي لاحق من الفطري تفاعل الخلايا المناعية مع HRAS G12V معربا عن خلاي?...

Video: Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D عضوي النمط المشارك الثقافة نموذج دعم النخاع التوتة الظهارية تكاثر الخلايا، التمايز ومختلط التعبير الجيني

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

إنشاء الزرد اليرقات "نموذج الحيوان" للتحقيق مثقبيه الكروزية حركية في فيفو

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

تحديد حجم الكبد في لارفال زيبرافيش باستخدام المجهر برايتفيلد

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...