نشكر M. دوغلاس بينسون لإجراء محادثات أولية بشأن التصوير الحنك الثانوي. ونحن نعترف أيضا ديفيد كاستانيدا كاستيلانوس (لايكا) وكريس رييكين (زايس) لمساعدتهم على ضبط ظروف التصوير في المجهر متحد البؤر. نحن نقدر لينزي هاميلتون (بيتبلان) للحصول على اقتراحات مفيدة لتحليل الصور الكمية باستخدام برنامج إماريس. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نيدر R01 DE025887.

<ol>
	<li>Ray, H. J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+fusion+during+development.">Mechanisms of tissue fusion during development.</a> Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).</li><li>Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatal+fusion+-+where+do+the+midline+cells+go?+A+review+on+cleft+palate,+a+major+human+birth+defect.">Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect.</a> Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).</li><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palatogenesis:+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development.">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139, 231-243 (2012).</li><li>Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+Molecular+Mechanisms+of+Palatogenesis.">Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).</li><li>Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+cleft+palate+in+TGF-b3+knockout+mice.">Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice.</a> Development. 126, 3869-3879 (1999).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+and+Extrusion+Are+Required+for+Normal+Fusion+of+the+Mammalian+Secondary+Palate.">Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate.</a> PLOS Biol. 13, 100122 (2015).</li><li>Yoshida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periderm+cells+covering+palatal+shelves+have+tight+junctions+and+their+desquamation+reduces+the+polarity+of+palatal+shelf+epithelial+cells+in+palatogenesis.">Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis.</a> Genes Cells. 17, 455-472 (2012).</li><li>Fitchett, J., Hay, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medial+edge+epithelium+transforms+to+mesenchyme+after+embryonic+palatal+shelves+fuse.">Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse.</a> Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).</li><li>Akira, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+TGF-beta3+for+epithelial-mesenchyme+transdifferentiated+MEE+in+palatogenesis.">The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis.</a> J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).</li><li>Sani, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate-mapping+of+the+epithelial+seam+during+palatal+fusion+rules+out+epithelial-mesenchymal+transformation.">Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation.</a> Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).</li><li>Jin, J. -. Z., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+migration,+transdifferentiation+and+apoptosis+during+mouse+secondary+palate+fusion.">Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion.</a> Development. 133, 3341-3347 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomous+requirement+for+Tgfbr2+in+the+disappearance+of+medial+edge+epithelium+during+palatal+fusion.">Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion.</a> Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).</li><li>Carette, M. J., Ferguson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+medial+edge+epithelial+cells+during+palatal+fusion+in+vitro:+an+analysis+by+Dil+labelling+and+confocal+microscopy.">The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy.</a> Development. 114, 379-388 (1992).</li><li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+growth+and+morphogenesis+of+the+tooth.">Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth.</a> Development. 127, 4775-4785 (2000).</li><li>Eisenhoffer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowding+induces+live+cell+extrusion+to+maintain+homeostatic+cell+numbers+in+epithelia.">Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia.</a> Nature. 484, 501-546 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7, 168-169 (2010).</li><li>Can, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+correction+in+confocal+laser+microscopes:+a+novel+two-view+approach.">Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach.</a> J Microsc. 211, (2003).</li><li>Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+motion+correspondence+for+densely+moving+points.">Resolving motion correspondence for densely moving points.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).</li><li>Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+cell+dynamics+in+mouse+embryos+using+light-sheet+microscopy.">Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy.</a> Development. 141, 4406-4414 (2014).</li><li>Stoller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+mouse+expressing+a+nuclear+localized+fusion+of+GFP+and+beta-galactosidase+reveals+new+derivatives+of+Pax3-expressing+precursors.">Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors.</a> Genesis. 46, 200-204 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

التصوير الحي من التشكل الأنسجة مع 3D ثقافة الجهاز إكسلانت يمكن أن توفر معلومات مفصلة بشأن العمليات الخلوية التي لا يمكن أن تظهر في تحليل تلطيخ التقليدية من أقسام الأنسجة الثابتة. باستخدام في المختبر ثقافة إكسلانت من الماوس الحنك الثانوي الجنينية، لاحظنا العديد ...

الأنسجة الانصهار هو خطوة هامة في تطوير أجهزة متعددة. يمكن أن تشوه العيوب البشرية الرئيسية مثل الشفة المشقوقة والحنك، السنسنة المشقوقة وتشوهات القلب من عيوب في انصهار الأنسجة 1 . وقد تم دراسة الماوس الماوس الحنك الانصهار على نطاق واسع لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية السيطرة على انصهار الأنسجة في التنمية 2 ، 3 ، 4 . في الماوس، يبدأ تطوير الحنك الثانوي في جميع أنحاء E11.5 مع ثمار الرف الحنكي الثانوي من كل من العمليات الفك العلوي الثنائية. النمو الأولي للرفوف الحنكية يحدث عموديا على طول اللسان، حتى حوالي E14.0، في ذلك الوقت، رفوف الحنك تصبح مرتفعة أفقيا فوق اللسان. يؤدي النمو الموجه وسطيا إلى الاتصال الجسدي بين ظهارة التطبيق من الرفوف الحنكية اثنين، وتشكيل خط الوسط إبيثيليآل سيم (ميس) عند E14.5. يجب إزالة ميس ميس من بين الرفوف الحنكية الثانوية للسماح التقاء الوسيطة وتطوير سليمة، تنصهر تماما الحنك الثانوي من قبل E15.5 3 . كيف يتم تشكيل طبقة الخلية الظهارية الخلية ميس بين اثنين من رفوف الحنجرة منفصلة، ​​ومن ثم إزالتها لتحقيق كونفلنسي الوسيطة، وكان السؤال الرئيسي في التنمية الحنك. استنادا إلى دراسات الماوس المجهري والإلكترون المجهري (إم) والدراسات ثقافة إكسلانت، والتجارب الوراثة الماوس وظيفية، وقد تورطت العديد من السلوكيات الخلية الأساسية في هذه العملية. الإسقاطات مثل فيلوبوديا من الحافة الإنسية ظهارة مي من كل رف الحنطة يسهل الاتصال الأولي 5 ، 6 ، تليها إقحام هذه الخلايا الظهارية إلى ميس واحد مشترك 6 ، 7 . إزالة المحطة ميس المشتركة الناتجةاقترح المضي قدما بثلاث آليات غير حصرية. وأشارت الدراسات المبكرة التي تستخدم الرصد النسيجي والجسم الحي خارج تتبع المفردات مع الأصباغ الحيوية أن ميس يمكن إزالتها عن طريق الظهارية إلى الانتقال الوسيطة (إمت) من الخلايا ميس 8 ، 9 ، على الرغم من أن في الآونة الأخيرة، تتبع النسب الوراثية للخلايا الظهارية أثار عدم اليقين فيما يتعلق والمساهمة على المدى الطويل من الخلايا الظهارية إلى الحنك الحنكي اللحمة المتوسطة 10 ، 11 ، 12 . وقد أدت أعداد كبيرة من الخلايا الأبوطوزية، وانخفاض في عددهم في بعض المسوخ التي تفشل في الخضوع الصحيح الانصهار الحنك إلى فكرة أن موت الخلايا المبرمج قد يكون المحرك الرئيسي لحل ميس 2 ، 3 . وأخيرا، استنادا في البداية على الدراسات التي تنطوي على وضع العلامات الظهارية والملاحظة ثابتة في تيمبوانتس التقدمية، خلايا ميسقد اقترحت على الهجرة في أبعاد الأوعية و الأمامي الخلفي 11 ، 13 ، ولكن هذه السلوكيات خلية ديناميكية في البداية غير مؤكدة بسبب عدم القدرة على مراقبتها في الأنسجة الحنكية الحية. في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على مراقبة مباشرة هذه السلوكيات من خلال تطوير منهجية التصوير الحية الجديدة التي تجمع بين الأساليب الوراثية الماوس من وضع العلامات الفلورسنت مع التصوير المباشر مبائر من الرفوف الحنكية إكسلانتيد. أولا، لتصور السلوكيات الخلوية الديناميكية في الخلايا الظهارية الحنك أثناء الانصهار الحنك، أنشأنا الماوس مراسل الظهارية محددة عن طريق عبور ROSA26- متمغ الفئران فلوكس مع الفئران Keratin14-كري 14 ، 15 . وأكد التصوير مبائر الحية من ثقافة الحنك إكسلانت من الأجنة الناتجة بعض السلوكيات الخلوية المقترحة سابقا وحددت الأحداث الرواية في عملية الاندماج 6 </سوب&gt;. الظهارية نتوءات غشاء الخلية مسبقة الأولي خلية خلية الاتصال تليها التقارب الظهارية عن طريق إقحام الخلية وتشريد الخلايا الأنفية. ومن الجدير بالذكر، اكتشفنا أيضا أن قذف الخلية، وهي عملية ذكرت للعب الأدوار الهامة في التوازن الظهاري، كان آلية رئيسية تدفع الماوس الانصهار الحنك الثانوي 6 ، 16 . هذا الأسلوب التصوير يمكن استخدامها مع خطوط مراسل أخرى. استخدمنا الفئران المعدلة وراثيا ليفيكت-مرفبروبي 17 ، 18 لدراسة ديناميات الهيكل الخلوي أكتين أثناء عملية الانصهار. ويمكن أيضا للصحفيين الآخرين أن تستخدم لمراقبة جوانب محددة أخرى من الانصهار الحنك ويمكن تكييف هذه الطريقة إما ليزر المسح متحد البؤر المجهري أو الغزل القرص المجهري متحد البؤر، اعتمادا على احتياجات التصوير والمجهر توافر. أصبح التصوير الحي على نحو متزايد نهجا رئيسيا في علم الأحياء التنموي. حزببشكل رئيسي، التشكل القحفي الوجهي هو التشوهات المعقدة والإنسانية التي تؤثر على الوجه شائعة. وهذا مبهجة طريقة التصوير الحية تساعد على تمكين فهم أفضل للآليات التنموية الأساسية الكامنة وكذلك أصول تشوهات القحف القحفي البشري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1193">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:348px;">Reagents</td>
			<td style="width:360px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td style="width:260px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Low melting agarose</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>E-3111-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">35mm glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Petrolieum Jelly (Vaseline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16415-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Keratin14-cre</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:65294</td>
			<td>Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">ROSA26mTmG</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:124702</td>
			<td>Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lifeact-mRFPruby</td>
			<td></td>
			<td>MGI: J:164274</td>
			<td>Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">White Light SP5 confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell Observer spinning disk confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of mouse secondary palate fusion

انصهار الرفوف الحنكية الثانوية لتشكيل الحنك الثانوي سليمة هو عملية رئيسية في تطوير الثدييات وانقطاعه يمكن أن يؤدي إلى الحنك الثانوي الحلق، وهو شذوذ خلقي مشترك في البشر. وقد تم دراسة اندماج الحنك الثانوي على نطاق واسع مما أدى إلى العديد من الآليات الخلوية المقترحة التي قد توسط هذه العملية. ومع ذلك، فقد أجريت هذه الدراسات في الغالب على الأنسجة الجنينية الثابتة في نقاط زمنية التقدمية أثناء التنمية أو في الثقافات المستكشفة الثابتة تحليلها في نقاط زمنية ثابتة. تحليل ثابت محدود لتحليل العمليات التشكلية الديناميكية مثل الانصهار الحنك وما هي أنواع السلوكيات الخلوية الديناميكية توسط الانصهار الحنكي غير مفهومة تماما. نحن هنا وصف بروتوكول للتصوير الحي من السابقين فيفو الانصهار الحنك الثانوي في أجنة الماوس. لدراسة السلوكيات الخلوية من الانصهار الحنك، تم استخدام كيراتين 14 -cre الظهارية لتسمية الخلايا الظهارية الحنك في روسA26- متمغ الأجنة مراسل فلوكس . لتصور أكتين الخيطية، استخدمت الفئران مراسل ليفاكت-مرفبروبي . تم إجراء التصوير الحي من الانصهار الحنك الثانوي عن طريق تشريح الرفوف الحنكية الثانوية انضمت مؤخرا من الجنينية يوم (E) 14.5 مرحلة الأجنة وزراعة في وسائل الإعلام التي تحتوي على الاغاروز على طبق القاع الزجاج لتمكين التصوير مع المجهر متحد البؤر مقلوب. باستخدام هذه الطريقة، لقد اكتشفنا مجموعة متنوعة من السلوكيات الخلوية الرواية خلال الانصهار الحنك الثانوي. إن تقدير كيفية تنسيق سلوكيات الخلايا المتميزة في المكان والزمان يسهم إلى حد كبير في فهمنا لهذه العملية التشكلية الديناميكية. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على خطوط الماوس متحولة، أو الثقافات تعامل مع مثبطات الدوائية لمواصلة دفع فهم كيفية السيطرة على الانصهار الحنك الثانوي.

كشف التصوير المباشر للثقافة ألكسندر الحنك العديد من العمليات الخلوية التوسط الانصهار الحنك 6 . يتم إجراء الاتصالات الأولية بين الخلايا الظهارية اثنين من نتوءات غشاء ( الشكل 2 B-2E ). عندما تلتقي طبقتان الظهارية، ف...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion at JoVE.com

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

هنا، نقدم بروتوكول للتصوير الحي من الماوس الانصهار الحنك الثانوي باستخدام المجهر متحد البؤر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها في تركيبة مع مجموعة متنوعة من خطوط الماوس مراسل الفلورسنت، ومع مثبطات المسار لبصيرة الميكانيكية. ويمكن تكييف هذا البروتوكول للتصوير الحي في النظم التنموية الأخرى.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

live-imaging-of-mouse-secondary-palate-fusion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Views.  University of California San Francisco.  هنا، نقدم بروتوكول للتصوير الحي من الماوس الانصهار الحنك الثانوي باستخدام المجهر متحد البؤر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها في تركيبة مع مجموعة متنوعة من خطوط الماوس مراسل الفلورسنت، ومع مثبطات المسار لبصيرة الميكانيكية. ويمكن تكييف هذا ?...

Video: Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

في المختبر تمايز الناضجة Myofibers للتصوير لايف

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

التصوير الحي وتحليل تقلصات العضلات في جنين دروسوفيلا

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

الصب الوعائي لرئتي فأرة ما بعد الولادة المبكرة للتصوير المقطعي المجهري

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

تشريح وتصوير حي للغدد التناسلية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

يعيش التصوير لل