ويدعم هذا العمل من قبل التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC)، والجمعية الملكية وجامعة نوتنجهام.

1. تحديد من شدة الإسفار تغيير على تجليد مانت المسمى النوكليوتيدات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرومتر المسمى MANT النوكليوتيدات إلى 1 ميكرومتر كينيسين (تركيزات النهائي) في وجود مخزن مؤقت رد الفعل المناسب. وعادة ما تستخدم عازلة يفيد النمو والاستقرار أنيبيب (انظر المناقشة). يحتوي عازلة تستخدم عادة 80MM ببيرازين مكرر-2-ethanesulfonic حمض (أنابيب) pH6.9، 1MM MgCl 2 و 1MM جلايكول الإثيلين مكرر-2-aminoether tetraacetic حمض (EGTA). ملاحظة: تركيز كينيسين ورد في جميع البروتوكولات يشير إلى تركيز النوكليوتيدات ملزمة المواقع (أي المجالات الحركية). توجد kinesins مختلفة كما أحادية، dimers أو tetramers وهكذا يمكن أن تحتوي على أكثر من موقع واحد ملزم النوكليوتيدات في الجزيء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة (1-3 دقيقة) وباستخدام مقياس التألق القياسية، وقياس طيف الانبعاث للمجمع كينيسين النوكليوتيدات المسمى MANT. استخدام الطول الموجي 365nm من الإثارة ومقياس انبعاث الضوء 400-500 نانومتر بزيادات 1nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل 1MM النوكليوتيدات MANT المسمى في نفس رد فعل العازلة المستخدمة في الخطوة 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس طيف الانبعاث للعينة الوحيدة MANT النوكليوتيدات، كما هو موضح سابقا (انظر الخطوة 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع الأطياف إلى إشارة في الطول الموجي للكثافة مضان الذروة من الطيف من النوكليوتيدات MANT في الحل (أي بدون كينيسين) بقسمة من خلال هذه القيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم أطياف تطبيع (على سبيل المثال، الشكل 2B) لمراقبة كثافة مضان الخلافات بين mantATP ملزمة و / أو متجهة الى mantADP كينيسين وMANT النوكليوتيدات في الحل. </li></ol> 2. القياس من الثوابت النقابية والتفكك السعر لmantATP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حل ما يصل إلى 20 ميكرومتر كينيسين (انظر المناقشة) في أي المغنيسيوم المناسب 2+ عازلة خالية (على سبيل المثال، 80MM أنابيب pH6.9، 1MM EGTA، 0.1٪ Tween20)، إضافة 1ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (التركيز النهائي) (EDTA) و1 ملم (التركيز النهائي) dithiothreitol (DTT). ملاحظة: من المستحسن إضافة Tween20 إلى المخزن المؤقت لأنه يقلل / يمنع فقدان البروتين كينيسين على عمود يستخدم لتبادل عازلة (خطوات 2.3 و 3.3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الحل عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النوكليوتيدات منفصلة حرة وEDTA من كينيسين باستخدام عمود تدفق الجاذبية G-25 باستخدام Sephadex هلام الترشيح وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر قائمة المواد). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن مع العمود لا يقل عن 3 مجلدات عمود من المغنيسيوم 2+ عازلة خالية المناسب (انظر الخطوة 2.1). تحميل حل كينيسين تحتوي على العمود. إعداد أنبوب جمع بإضافة حجم مناسب من محلول كلوريد المغنيسيوم 100MM إلى أنبوب فارغ، مثل أن تركيز النهائي من كلوريد المغنيسيوم هو 1 ملم بعد جمعها من الحل كينيسين. بالإضافة الفورية من كلوريد المغنيسيوم يساعد stabiliحد ذاتها كينيسين خالية من النوكليوتيدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل كينيسين باستخدام المغنيسيوم 2+ عازلة خالية المناسب. Kinesins غير مستقرة عندما خالية من النوكليوتيدات ولذلك فمن المهم العمل بسرعة. تخزين كينيسين خالية من النوكليوتيدات على الجليد واستخدام في غضون 1-2 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء أو قبل إعداد خالية من النوكليوتيدات كينيسين، وإعداد سلسلة تركيز mantATP في نفس رد فعل العازلة باعتبارها الحل النهائي خالية من النوكليوتيدات كينيسين. تحديد مجموعة من تركيزات mantATP المطلوبة وفقا لتركيز متاح من كينيسين مع سلسلة نموذجية تتراوح 0،1 حتي 50 ميكرومتر (انظر الخطوة 2.5 والمناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة تركيز خالية من النوكليوتيدات كينيسين. لكل تركيز mantATP (الخطوة 2.4)، ينبغي إعداد تركيز خالية من النوكليوتيدات كينيسين بحيث النوكليوتيدات المسمى MANT هي في 5 إلى 10 أضعاف الزيادة الضرس عبر مواقع الربط كينيسين النوكليوتيدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الطول الموجي الإثارة على فلو توقفتث مقياس التألق إلى 365 نانومتر، وجمع ينبعث الضوء في&gt; 400 نانومتر باستخدام فلتر تمريرة طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من أدنى تركيز mantATP، خلط mantATP مع التركيز المناسب من خالية من النوكليوتيدات كينيسين في نسبة 1: 1 ت / ت باستخدام مقياس التألق توقف تدفق (الشكل 3A و 3B أقحم). ملاحظة: يتم تخفيفه المواد المتفاعلة بنسبة 50٪ عند الخلط. الحفاظ على تركيز علما النوكليوتيدات كلا قبل وبعد الخلط (أي 3.0 / 1.5 ميكرومتر) لتفادي الخلط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب التغير في كثافة مضان قياس في كل تركيز mantATP إلى الدالة الأسية بالإضافة إلى خط الانحدار السلبي المستمر لحساب ل photobleaching المجموعة MANT (أي الإسفار = A 0 .exp (ك. تي OBS) + (م. ر + ج)، حيث A 0 هو السعة، ك OBS هو ثابت معدل وt غير الوقت، انظر الشكل 3B والمناقشة). من هذه النوبات تحديدمعدل ثابت (ك OBS) في كل تركيز mantATP. كل ك OBS هو التفاف على وجود ارتباط والتفكك معدل ثابت (الشكل 1، ك 1 و ك -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolve الجمعية ومعدل التفكك الثوابت التي كتبها ك OBS بالتآمر ضد تركيز mantATP (على سبيل المثال، الشكل 3C). تناسب هذه البيانات لدالة خطية (أي OBS ك = ك 1 [mantATP] + ك -1) للحصول على التدرج والمحور ص اعتراض. يمثل التدرج ثابت معدل للجمعية mantATP (الشكل 1، ك 1) مع وحدات M -1 ق -1. يمثل اعتراض ثابت معدل التفكك (الشكل 1، ك -1) مع وحدات من ق -1 (انظر المناقشة). ملاحظة: هذا النهج يمكن أن تطبق أيضا لتحديد ارتباط ADP والتفككالثوابت معدل (الشكل 1، ك -4 وك 4) باستخدام mantADP كما النوكليوتيدات. </li></ol> 3. القياس من التفكك معدل ثابت للmantADP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى حل من 2 ميكرومتر كينيسين في منطقة عازلة رد فعل مناسب (على سبيل المثال، 80 ملم أنابيب pH6.9، 1MM MgCl 2، 1MM EGTA، 0.1٪ Tween20)، إضافة 50 ميكرومتر mantADP (التركيز النهائي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mantADP إزالة الزائدة وغيرها من النوكليوتيدات مجانا عن طريق تبادل عازلة كينيسين في المخزن المؤقت رد فعل المختار باستخدام عمود باستخدام Sephadex G-25 (انظر قائمة المواد) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ينبغي الآن تحميلها المجال كينيسين المحرك مع mantADP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الطول الموجي الإثارة على مقياس التألق توقف تدفق إلى 365 نانومتر، وجمع ينبعث الضوء في&gt; 400 نانومتر باستخدام فلتر تمريرة طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج مجمع mantADP.kinesin (~ 1μM) مع 50 أضعاف أو أكثر مولاص تتجاوز الخالي من الملصقات ATP في نسبة 1: 1 ت / ت باستخدام مقياس التألق توقف تدفق (الشكل 4A و 4B أقحم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب انخفاض في كثافة مضان لوحظ مع مرور الوقت إلى الدالة الأسية واحدة بالإضافة إلى خط الانحدار السلبي المستمر لحساب ل photobleaching المجموعة MANT (أي الإسفار = A 0 .exp (ك. تي OBS) + (+ m.t ج)، حيث A 0 هو السعة، ك OBS هو ثابت معدل و t هو الوقت، انظر الشكل 4B و المناقشة). وOBS ك تحديد من يصلح هذا هو ثابت سرعة تفكك ADP (الشكل 1، ك 4) مع وحدات من ق -1 (انظر المناقشة). </li></ol>

<ol>
	<li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+kinesin+motor+proteins.">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation:+one+engine,+many+machines.">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li><li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase.">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li><li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules.">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li><li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors.">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li><li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors.">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+analogues+at+a+glance.">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization.">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li><li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin.">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li><li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase.">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li><li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+interaction+of+2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1:+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes.">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li><li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity.">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li><li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor.">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li><li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke.">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li><li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin.">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li><li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, 69-97 (2006).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li><li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro.">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li><li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules:+a+brief+historical+perspective.">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li><li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase.">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li><li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism.">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li><li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins.">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

هنا، نقدم بروتوكولات للمراقبة وتحليل حركية التحولات بين الدول النوكليوتيدات لكينيسين. هذه البروتوكولات السريع الاستفادة من طريقة خلط توقف تدفق بالتزامن مع النيوكليوتيدات fluorescently المسمى. وقد استخدمت أساليب من هذا النوع على نطاق واسع لدراسة النوكليوتيدات ملزمة والتفكك لمجموعة متنوعة من kinesins 9-11،13-16. الأساليب المذكورة لا تسمح الملاحظة الإفراج الفوسفات (الشكل 1، الخطوة 3). ومع ذلك، مضان توقف تدفق يمكن استخدامها لمراقبة هذا التحول باستخدام الاستشعار عن البروتين الفوسفات لزوجين إنتاج الفوسفات إلى كثافة مضان التغيير 17. أساليب عرض النيوكليوتيدات استخدام المسمى مع methylanthraniloyl fluorophore صغيرة (MANT)، والتي تظهر عادة زيادة في كثافة مضان عندما بد أن البروتين. علاوة على ذلك، fluorophore MANT، عندما مترافق إما موقف 2 &quot;أو 3&quot; على صibose، وغالبا ما له تأثير ضئيل أو لا على ملزم، التفكك أو التحلل من النوكليوتيدات 9-12. هي النيوكليوتيدات MANT المسمى متاحة بسهولة من المصادر التجارية (انظر قائمة المواد) ويتم توفيرها في شكل خلائط من 2 &quot;و 3&quot; المترافقة لأنها بسرعة إعادة تتوازن عند تخصيبه لايزومير واحد 8. النيوكليوتيدات المسمى MANT تجعل جزيئات مراسل الممتازة التي يمكن ملاحظتها حركية النوكليوتيدات ملزمة والتفكك. استخدام النيوكليوتيدات fluorescently المسمى يعني أن قراءة من المقايسات وصفها هو تغيير في الوقت الحقيقي في كثافة مضان. وهذا يجعل هذه المقايسات مثالية لمضان توقف تدفق، والذي يسمح خلط السريع الكواشف ومراقبة الوقت الحقيقي من التغيرات في مضان المرتبطة رد فعل لاحق. مزيج من توقف تدفق وتقنية خلط ومضان كأسلوب للكشف ينتج النظام الذي هو EF عينة نسبيا<html> كافية من. على سبيل المثال، للحصول على البيانات هو مبين في الشكل 3C يتطلب 0،8-1،0 ملغ من تنقية كينيسين-13، MCAK، والحصول على البيانات هو مبين في الشكل 4B يتطلب ~ 0.3 ملغ من تنقية كينيسين-13، MCAK. عيب واحد من استخدام MANT باعتباره fluorophore هو أنه عرضة للphotobleaching من. هذا يمكن ملاحظتها في العزلة من كينيسين حركية التفاعل عن طريق خلط محلول المسمى MANT النوكليوتيدات مع العازلة رد الفعل، في غياب كينيسين، في التدفق توقف. لوحظ انخفاض بطيء في كثافة مضان كما تصبح مجموعة MANT ابيض. على مجموعة من الجداول الزمنية المستخدمة في البروتوكولات المذكورة photobleaching من المجموعة MANT يوصف جيدا بواسطة دالة خطية. لذلك، طريقة بسيطة لتصحيح البيانات ل photobleaching هي لتناسب إلى الدالة الأسية مع خط الأساس وصفها دالة خطية (أي طن متري + ج) بدلا من خط الأساس مسطح أكثر شيوعا، التي وصفها معلمة واحدة. الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; mantATP ملزمة عند قياس الثوابت معدل تكوين الجمعيات والتفكك من mantATP (القسم 2) ADP، والذي لا يزال يرتبط مع موقع النوكليوتيدات ملزم كينيسين في غياب الأنابيب الدقيقة، ويجب إزالتها. وهذا يسمح جمعية mantATP والتفكك (الشكل 1، الخطوة 1) التي يتعين مراعاتها في معزل عن التفكك ADP. لتحقيق وحضنت هذا كينيسين مع ما لا يقل عن 50 أضعاف الفائض من EDTA على مواقع الربط النوكليوتيدات (الخطوة 2.1). وEDTA تعزل المغنيسيوم 2+ تسبب أيونات المغنيسيوم 2+ إلى فصل من جيب ملزمة النوكليوتيدات، مما يؤدي الى الافراج عن 11 النوكليوتيدات. ولذلك، عند تنفيذ الخطوات 2،1-2،3، من المهم جدا لاستخدام منطقة عازلة خالية من المغنيسيوم 2+. البروتين كينيسين خالية من النوكليوتيدات هو تبادل عازلة لفصلها كلا من النوكليوتيدات الحرة ومن EDTA. لتحقيق هذا الفصل، وهو المتاح خطورة تدفق جنرال الكتريكالعمود لتر الترشيح كافية وبسيط وسريع لاستخدام (انظر قائمة المواد). ويتم تفاعل مع mantATP النوكليوتيدات كينيسين مجانا من خلال مجموعة من تركيزات mantATP (الخطوة 2.4) لتمكين deconvolution الثوابت الجمعيات والتفكك معدل (الخطوة 2.8). النظرية وراء تجارب من هذا النوع يوصف أيضا في إشارة 18. في تنفيذ هذه التجارب واحد يبدأ مع أدنى تركيز mantATP. هذا يزيل ضرورة اتخاذ خطوات غسل بين تركيزات مختلفة. فمن المرجح أن يكون ضروريا لضبط حساسية مقياس التألق توقف تدفق وتركيز mantATP يزداد. يجب أن يكون تركيز mantATP دائما ما يزيد على الأقل 5 أضعاف خلال تركيز المواقع ملزمة كينيسين النوكليوتيدات للحفاظ على الأوضاع الزائفة من الدرجة الأولى. لكن، وكما تركيز mantATP يزداد، فإن التغيير يمكن أن تصبح إشارة اغراق باعتبارها جزء من النوكليوتيدات التي تربط لكينيسين الانخفاضات. Therefoإعادة، ويزداد أيضا تركيز كينيسين لكل تركيز جديد من mantATP مثل أن تركيز mantATP أبدا أكبر من المولي يزيد 10 أضعاف على مواقع الربط النوكليوتيدات (الخطوة 2.6). mantADP التفكك على الرغم من أن الجمعيات ومعدل التفكك الثوابت لmantADP يمكن تحديده من خلال نفس الأسلوب وصفها لmantATP (القسم 2). تفكك ADP من كينيسين يمكن ملاحظة مباشرة من قبل تحميلها مسبقا في الموقع، النوكليوتيدات ملزمة مع mantADP (خطوات 3،1-3،3) ثم يتم خلط مجمع mantADP.kinesin مع وجود فائض من توضيحها ATP (الخطوة 3.5). والخالي من الملصقات ATP الزائد يمنع إعادة الربط من mantADP إلى كينيسين ويسمح رد الفعل التفكك (الشكل 1، ك 4) لوحظ في معزل عن رابطة mantADP بذلك. في هذا الاختبار يجب أن يكون تركيز ATP الخالي من الملصقات على الأقل فائض المولي 50 أضعاف من مجلس التوحيد الوطنىleotide مواقع الربط. النظرية وراء هذا الاختبار يوصف جيدا في إشارة 18. هذه الطريقة المباشرة يعطي قيمة أكثر دقة لمعدل التفكك المستمر من استقراء إلى المحور ص هو موضح في الخطوة 2.8. إدراج ميكروتثبول ويمكن أيضا أن تستخدم الأساليب المذكورة لتحديد حركية النوكليوتيدات ملزمة والتفكك في وجود الأنابيب الدقيقة. يتم إدخال الأنابيب الدقيقة لالنوكليوتيدات تحتوي على حقنة قبل الاختلاط في التدفق توقف: انخفاض حقنة في الشكل 3B و 4B (إدراجات). في هذا التكوين، فإن كينيسين تلبية النوكليوتيدات في نفس الوقت لأنها تلبي الأنابيب الدقيقة. وتستخدم الأنابيب الدقيقة استقرت، حيث تم تمديد عمر البوليمر تويولين عن طريق استخدام إما الكيميائية الاستقرار، مثل التاكسول، أو GTP التناظرية nonhydrolysable، مثل غوانوزين-5 &#39;- [(α، β) -methyleno] ثلاثي الفوسفات (GMPCPP، انظر قائمة المواد). فمن الممكن استخدام دورتين من تويولين البلمرة مع GMPCPP لجعل الأنابيب الدقيقة التي يمكن تخزينها لعدة أشهر في 9،19 النيتروجين السائل. استخدام الأنابيب الدقيقة المعدة مسبقا يخفف كثيرا من الصعوبات العملية في أداء هذه المقايسات. لتشمل الأنابيب الدقيقة في المقايسات، فمن المهم استخدام منطقة عازلة رد فعل مناسب للاستقرار أنيبيب. المخزن المؤقت الاختيار هو أساس أنابيب، مع المخزن المؤقت الأكثر شيوعا تحتوي على 80 ملي أنابيب درجة الحموضة 6.9، 1 ملم MgCl 2 و 1 ملي EGTA (المعروف باسم BRB80) 20،21. الأساليب المذكورة لا تقتصر على استخدامها مع kinesins، ولكن يمكن تكييفها وتطبيقها على أي بروتين ملزمة النوكليوتيدات. على سبيل المثال، تم تطبيق أساليب مشابهة لدورة دوران ATP من أعضاء الأسرة الميوسين المحركات الجزيئية 12،22 واستخدام MANT المسمى النيوكليوتيدات غوانوزين تمتد أبعدأساليب من هذا النوع إلى GTP hydrolyzing البروتينات 23،24.

وkinesins هي الفصيلة من البروتينات التي تتميز مجال السيارات حفظا للغاية 1. يتفاعل المجال كينيسين المحرك مع ميكروتثبول بطريقة تعتمد على النوكليوتيدات. أعضاء الأسرة كينيسين عرض مجموعة من الوظائف من translocating kinesins التي تحمل البضائع بطريقة موجهة على طول الأنابيب الدقيقة، لkinesins ملزم نهاية غير translocating أنيبيب، التي تنظم ديناميات أنيبيب 2،3. Kinesins استخدام دوران adensosine-5&#39;-ثلاثي الفوسفات (ATP) لتنظيم تفاعلها مع أنيبيب الهيكل الخلوي 4-6. التشكل المجال كينيسين المحرك وبالتالي لها تقارب للأنيبيب يعتمد على الدولة النوكليوتيدات لها: ATP، ADP، ADP.Pi أو النوكليوتيدات لا يمكن ربط (الشكل 1). لفهم الآلية الجزيئية لكينيسين، مطلوب فهم العلاقة بين دوران ATP والتفاعل أنيبيب. وrefore، هدفا رئيسيا في مجال كينيسين هو لوصف الخصائص الفنية للدول النوكليوتيدات مختلفة وحركية التحولات بين لهم على حد سواء في وجود وغياب الأنابيب الدقيقة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> يتكون الشكل 1. أبسط دورة دوران اعبي التنس المحترفين لكينيسين من أربع ولايات المحتملة: (Φ) خالية من النوكليوتيدات، ATP محددة، ADP.P ط -bound ومتجهة الى ADP ويتميز كل من التحولات الأربعة إلى الأمام و. متخلف ثابت معدل (ك س و ك -x على التوالي). لفهم كيفية يقترن دورة الكيميائي للدوران ATP لدورة ميكانيكية التفاعل أنيبيب، لا بد من تحديد أي خطوة في دورة دوران ATP هو معدل الحد في غياب microtubules ومن ثم تحديد كيفية تغيير دورة من خلال وجود الأنابيب الدقيقة. وتتكون أبسط دورة دوران اعبي التنس المحترفين من أربع خطوات فردية المواد الكيميائية: (1) ATP ملزم لموقع فارغ (Φ يدل الموقع فارغة، أي خالية من النوكليوتيدات كينيسين). (2) الانقسام ATP. (3) التفكك الفوسفات و (4) التفكك ADP (الشكل 1). في خطوة تحد من معدل تحدد معدل ثابت للدوران دورة كاملة للاعبي التنس المحترفين. لذلك، لتحديد الخطوة هو الحد من معدل كل من التحولات الفردية يجب قياس ومقارنة مع معدل ثابت لدورة كاملة. أساليب لقياس لا توصف هنا ثابت معدل دوران ATP دورة العام لكن يمكن العثور عليها في إشارة 7. هنا، نحن تصف الأساليب التي يمكن من خلالها تحديد الثوابت معدل للخطوات الكيميائية الفردية. هناك عدد من الطرق المتاحة لدراسة التحولات الفردية في دورة دوران البروتين النوكليوتيدات hydrolyzing. الأساليب المقدمة هنا تأخذ الميزه(ه) من خصائص النيوكليوتيدات المسمى مع methylanthraniloyl fluorophore، يشار اليها عادة باسم MANT، التي تعرض تغير في كثافة مضان عليها ملزمة لبروتين 8. يتم استخدام مجموعة MANT لأن حجمه صغير يعني، عندما يقترن إلى الريبوز (الشكل 2A)، ولها عموما تأثير ضئيل أو لا على حركية النوكليوتيدات ملزمة أو التحلل 9-12. هنا، نقدم بروتوكولات واصفا استخدام النيوكليوتيدات المسمى MANT، بالتزامن مع مضان توقف تدفق، للسماح مراقبة النوكليوتيدات ملزمة والتفكك في دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;triphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-202</td>
			<td style="width:279px;">mantATP</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-201</td>
			<td style="width:279px;">mantADP</td>
		</tr>
		<tr height="134">
			<td height="134" style="height:134px;width:220px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:147px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;"># 10519979001</td>
			<td style="width:279px;">The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&#160;mM in 100&#160;mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260&#160;nm (e = 15400&#160;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&#160;oC.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP120-500</td>
			<td style="width:279px;">0.5&#160;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:220px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:147px;">Melford</td>
			<td style="width:136px;">MB1015</td>
			<td style="width:279px;">1&#160;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">NAP-5 column</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;"># 17-0853</td>
			<td style="width:279px;">G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:220px;">GMPCPP</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-405</td>
			<td style="width:279px;">nonhydrolysable analogue of GTP</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:220px;">Stopped-flow fluorimeter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Applied Photophysics</td>
			<td style="width:136px;">SX20</td>
			<td style="width:279px;">A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&#160;-&#160;100&#160;s to be monitored.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

الفصيلة كينيسين من البروتينات المرتبطة أنيبيب محرك تشترك مجال السيارات المميزة التي تتحلمأ كل من ATP ويربط الأنابيب الدقيقة. عرض Kinesins الخلافات عبر الفصيلة سواء في دوران ATP والتفاعل أنيبيب. هذه الاختلافات خياط kinesins محددة لمختلف المهام مثل نقل البضائع، أنيبيب انزلاق، أنيبيب التحلل والاستقرار أنيبيب. لفهم آلية عمل لكينيسين من المهم أن نفهم كيف يقترن دورة الكيميائية ATP دوران لدورة ميكانيكية التفاعل أنيبيب. لتشريح دورة دوران اعبي التنس المحترفين، نهج واحد هو استخدام النيوكليوتيدات fluorescently المسمى لتصور الخطوات الفردية في الدورة. تحديد حركية كل انتقال النوكليوتيدات في دورة دوران ATP يسمح الحد من معدل خطوة أو خطوات لدورة كاملة لتحديدها. لكينيسين، فمن المهم أن نعرف الخطوة معدل الحد، فيغياب الأنابيب الدقيقة، وهذه الخطوة تتسارع بشكل عام عدة آلاف أضعاف عندما يتفاعل مع كينيسين الأنابيب الدقيقة. دورة في غياب الأنابيب الدقيقة ثم يتم مقارنة ذلك بحضور الأنابيب الدقيقة لنفهم تماما ATP دورة دوران لكينيسين ل. حركية التحولات النوكليوتيدات الفردية عادة ما تكون سريعة جدا لمراقبة عن طريق خلط المواد المتفاعلة يدويا، وخصوصا في وجود الأنابيب الدقيقة. جهاز الخلط السريع، مثل مقياس التألق توقف تدفق، والذي يسمح حركية التي يتعين مراعاتها في فترات زمنية أقل قدر من أجزاء قليلة من الثانية، ويمكن استخدامها لرصد هذه التحولات. هنا، نحن تصف البروتوكولات التي تستخدم في خلط السريع من الكواشف التي توقف تدفق بالتزامن مع النيوكليوتيدات fluorescently المسمى لتشريح دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين.

وعادة ما يلاحظ زيادة في كثافة مضان من مجموعة MANT على ربط المسمى MANT النوكليوتيدات إلى كينيسين. ومع ذلك، فإن ضخامة مثل هذا التغيير إشارة يعتمد على كينيسين معين في السؤال. ولذلك، فمن المفيد إجراء قياسات التوازن لتأكيد كلا وجود وحجم التغيير كثافة مضان قبل التقدم لفحوصات الحركية. أطياف مضان التمثيلي للmantATP وmantADP، سواء في حل وفي مجمع مع كينيسين-13، MCAK ترد، في الشكل 2B. تبرز هذه المعطيات الزيادة كثافة مضان عرض من قبل كل من mantATP وmantADP عليها ملزمة لMCAK. ويستخدم التغير في كثافة مضان على ربط MANT النوكليوتيدات إلى كينيسين أن يقدم تقريرا عن الجمعيات والتفكك كل من ATP و ADP (الأقسام 2 و 3). في حالة MCAK، لوحظ اختلاف كثافة مضان بين mantATP.kinesin وmantADP.kinesin <suP&gt; 9. الشكل 3A يصور رد الفعل الذي يحدث عند خلط mantATP مع خالية من النوكليوتيدات كينيسين. بيانات تمثيلية توضح الزيادة في كثافة مضان الذي يحدث على ربط mantATP إلى كينيسين-13، هو مبين في الشكل 3B MCAK. بيانات من النوع هو موضح في الشكل 3B يتم جمعها في مجموعة من تركيزات mantATP. ويرد مؤامرة من الثوابت معدل (ك OBS) تحديد مقابل تركيز mantATP في الشكل 3C. تركيب هذه البيانات لدالة خطية (أي OBS ك = ك 1 [mantATP] + ك -1) يسمح deconvolution من الثوابت التي تساهم في معدل ك OBS (الخطوة 2.8). وبالتالي، تمكن من تحديد كل من الجمعيات وثابت معدل التفكك لmantATP (الشكل 1، ك 1 و ك <eم&gt; -1 على التوالي). الشكل 4A يصور رد الفعل الذي يحدث عند خلط mantADP.kinesin مع وجود فائض من ATP الخالي من الملصقات. تظهر البيانات في الشكل 4B انخفاض كثافة مضان لوحظ mantADP على التفكك من كينيسين-13، MCAK. عن طريق تركيب هذه البيانات إلى الدالة الأسية (الخطوة 3.6) إلى ثابت سرعة تفكك mantADP يتحدد مباشرة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> وتستخدم الرقم 2. النيوكليوتيدات المسمى مع methylanthraniloyl fluorophore (MANT) لعزل الخطوات الفردية في دورة دوران اعبي التنس المحترفين. (A) هيكل mantATP تبين الموقف من fluorophore MANT مترافق إما إلى 2 &quot;أو 3&quot; موقف بشأن الريبوز. (B) أطياف مضان تطبيع للmantATP وmantADP في الحل (mAXP) وmantATP ود mantADP في مجمع مع كينيسين MCAK (mATP + MCAK وmADP + MCAK). أطياف mantATP لا تطبيع للمضان في أقصى لmantATP في الحل والأطياف mantADP وتطبيع مضان في أقصى لmantADP في الحل. يتم جمع أطياف من النيوكليوتيدات MANT مختلطة مع MCAK في 1 دقيقة آخر الاختلاط. تركيز الكواشف وإعدادات مقياس التألق وكما هو موضح في الخطوات من بروتوكول 1.1 و 1.2. <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> الرقم 3. قياس ثابت معدل رابطة mantATP. (A) تخطيطي تصور رد الفعل الذي يأخذ مكان آخر بواسطة خلط توقف تدفق: mantATP (mATP) بربط خالية من النوكليوتيدات كينيسين. لاحظت كثافة مضان من الزيادات على مجموعة MANT ملزمة للبروتين. (B) تغيير إشارة الإسفار (أسود) عند خلط mantATP (25 M) مع MCAK (5 M نو<html> الحرة cleotide،). هذه البيانات يصلح (أحمر متقطع) إلى الدالة الأسية واحدة بالإضافة إلى خط الانحدار السلبي المستمر، الذي يمثل ل photobleaching من fluorophore MANT (انظر المناقشة) أقحم: محتويات الحقن قبل الاختلاط على مقياس التألق توقف تدفق. (C) الثوابت معدل (ك OBS) لتحديد رد فعل mantATP مع خالية من النوكليوتيدات MCAK تآمر ضد تركيز mantATP. وهذه المؤامرة لديها المنطقة الخطية مع التدرج كونها ثابت معدل تكوين الجمعيات (الشكل 1، ك 1) مع وحدات من M -1 ق -1 والتقاطع y يجري معدل ثابت التفكك (الشكل 1، ك -1) مع وحدات من ق -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> gether.within الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" /> . الشكل 4. قياس ثابت التفكك لmantADP معدل (A) تخطيطي تصور رد الفعل الذي يأخذ مكان آخر بواسطة خلط توقف تدفق: يتم تخفيف كينيسين مسبقة مع mantADP إلى وجود فائض من توضيحها ATP. يتم استبدال النأي mantADP بواسطة الخالي من الملصقات ATP، وبالتالي منع رد الفعل الخلفي للجمعية mantADP (انظر المناقشة). كثافة مضان من مجموعة MANT تنخفض على التفكك من البروتين. انخفاض (B) الإسفار وحظ على تفكك mantADP من كينيسين MCAK. إشارة مضان (أسود) يصلح (أحمر متقطع) إلى واحد الأسي بالإضافة إلى خط الانحدار السلبي المستمر لحساب ل photobleaching المجموعة MANT (انظر المناقشة). ثابت معدل العزم هو ثابت سرعة تفكك mantADP (الشكل 1، ك4) أقحم:. محتويات الحقن قبل الاختلاط على مقياس التألق توقف تدفق <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins at JoVE.com

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

وتتميز Kinesins بواسطة التفاعل تعتمد على النوكليوتيدات مع ميكروتثبول: دورة من دوران ATP بالإضافة إلى دورة التفاعل أنيبيب. هنا، نحن تصف بروتوكولات لتحليل حركية التحولات النوكليوتيدات الفردية في دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين باستخدام النيوكليوتيدات fluorescently المسمى ومضان توقف تدفق.

استخدام توقف تدفق الإسفار وإعتبر النيوكليوتيدات لتحليل دورة دوران اعبي التنس المحترفين من Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.4K Views.  University of Nottingham.  وتتميز Kinesins بواسطة التفاعل تعتمد على النوكليوتيدات مع ميكروتثبول: دورة من دوران ATP بالإضافة إلى دورة التفاعل أنيبيب. هنا، نحن تصف بروتوكولات لتحليل حركية التحولات النوكليوتيدات الفردية في دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين باستخ?...

Video: Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

إعداد واستخدام ثنائي يوديد السمريوم (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) في التركيب العضوي: دور الميكنة من أملاح النيكل وHMPA (II) في رد فعل باربييه السمريوم

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

ثابت للدولة، قبل المطرد للدولة، واحدة دوران قياس الحركية للنشاط الحمض النووي Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

تحديد الطائرات الملزمة للجليد من البروتينات المضادة للتجمد من قبل تقارب طائرة الجليد القائم على الفلورسينس

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

استعمال اللوني للغاز لتحليل التغييرات التركيبية من الأحماض الدهنية في الفئران الكبد الأنسجة أثناء الحمل

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

رصد القائم على مضان آخر PAD4 عبر برو-مضان الركيزة النظير

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

إعداد واستخدام Carbenes الكربونيل زينت في تفعيل الفسفور الأبيض

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

وBioconjugation وRadiosynthesis من<sup&gt; 89</sup&gt; الأجسام المضادة عنصر الزركون-DFO المسمى

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

تصور المحيطة الطيف الكتلي مع استخدام انعراجي التصوير الفوتوغرافي

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

بروتوكول الأمثل لRadiolabeling كفاءة من جزيئات الذهب عن طريق استخدام<sup&gt; 125</sup&gt; أزيد المجموعة الترقيعي المسمى أنا

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

إعداد وتقييم<sup&gt; 99m</sup&gt; ح المسمى ثلاثي الشعب يخلب لما قبل استهداف عن طريق Bioorthogonal الكيمياء

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...