الكتاب أشكر البروفيسور توماس راينر، الدكتور يعقوب هوتون، والدكتور سيرج Lyaschenko لإجراء محادثات مفيدة.

أجريت جميع التجارب على الحيوانات في الجسم الحي وصفها وفقا لبروتوكول المعتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للميموريال سلون كيترينج للسرطان مركز رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (IACUC). 1. الإقتران من DFO-NCS لJ591 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل، وإعداد حل 2-5 ملغ / مل من J591 في 1 مل من إما 1X الفوسفات مخزنة المالحة (7.4 درجة الحموضة) أو 0.5 M HEPES عازلة (7.4 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل DFO-NCS في DMSO جافة بتركيز بين 5-10 ملم (3،8-7،6 ملغ / مل). يصوتن أو دوامة الحل بدقة من أجل تسهيل حل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة من الحل J591 إلى 8،8-9،0 بإضافة مأخوذة الصغيرة (&lt;10 ميكرولتر) من 0.1 M نا 2 CO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد أن حل الضد هو في درجة الحموضة الصحيحة، إضافة إلى حجم من الحل DFO-NCS الموافق 3-4 أضعاف الزيادة المولي من خالب bifunctional. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لامتحانسبيل، إضافة 4-5 ميكرولتر من 10 ملي (7.6 ملغ / مل) DFO-NCS الحل (40.4 نانومول DFO-NCS) إلى 1 مل من 2 ملغ / مل حل J591 الأجسام المضادة (13.3 نانومول J591). يجب أن لا تتجاوز كمية DMSO في النهائي مائي خليط التفاعل 2٪ ت / ت. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان رد فعل لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C على تهييج كتلة التدفئة في 350 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة عند 37 ° C، وتنقية immunoconjugate الناتجة باستخدام حجم المتاح العمود معبأة مسبقا استبعاد تحلية مع 50،000 الوزن الجزيئي قطع باستخدام 0.5 M HEPES عازلة (7.4 درجة الحموضة) مثل شاطف. وهذه الخطوة تسفر عن 2 مل من محلول من الانتهاء بناء J591-DFO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز J591-DFO بناء على معمل الأشعة فوق البنفسجية فيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب تركيز أعلى للبناء، والتركيز على حل J591-DFO باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي مع 50،000 الوزن الجزيئي قطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين حل الانتهاء immunoconjugate J591-DFO في -20 درجة مئوية في الظلام. <bص /&gt; ملاحظة: هذا هو نقطة توقف مقبولة في الإجراء. </li></ol> 2. Radiolabeling J591-DFO مع 89 عنصر الزركون تنبيه: هذه الخطوة من البروتوكول ينطوي على التعامل والتلاعب من النشاط الإشعاعي. قبل تنفيذ هذه الخطوات أو أداء أي عمل آخر مع الباحثين النشاط الإشعاعي يجب التشاور مع إدارة الصحة والسلامة من الإشعاع مؤسسة وطنهم و. ينبغي اتخاذ جميع الخطوات الممكنة للحد من التعرض للإشعاع المؤين. ملاحظة: في مصلحة الكيمياء الإشعاعية المناسبة لحفظ المذكرة، يجب أن تقاس كمية النشاط الإشعاعي في العينة باستخدام تدريج جرعة وسجلت قبل وبعد خطوات 2،2 حتي 2،13 في البروتوكول أدناه. وهذا سوف يساعد مع تحديد دقيق لعائدات الإشعاعية وأنشطة محددة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل من 0،5-2،0 ملغ من J591-DFO في 200 ميكرولتر من 0.5 M HEPES العازلة، ودرجة الحموضة 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة لحجم &lt;سوب&gt; 89 عنصر الزركون حل 4+ الأسهم (مرفق عادة في 1.0 M حمض الأكساليك) الموافق 1،0-6،0 ميلي كوري (37-222 من mbq) في 2 مل البلاستيك المسمار غطاء أنبوب microcentrifuge. ضبط حجم هذا الحل إلى ما مجموعه 300 ميكرولتر باستخدام حمض الأكساليك 1.0 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة من الحل 89 عنصر الزركون 4+ إلى 6،8-7،5 باستخدام 1.0 M نا 2 CO 3. تبدأ بإضافة 250 ميكرولتر من 1.0 M نا 2 CO 3 إلى 4+ حل 89 عنصر الزركون وبعد ذلك إضافة أصغر (&lt;10 ميكرولتر) مأخوذة من قاعدة لتحقيق درجة الحموضة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المبلغ المطلوب من المعدل درجة الحموضة 89 عنصر الزركون 4+ حل للحل J591-DFO أعدت في الخطوة 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من الرقم الهيدروجيني للخليط التفاعل radiolabeling لضمان أنه يقع ضمن نطاق المطلوب من 6،8-7،5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان رد فعل radiolabeling لمدة 60 دقيقة في RT على تهييج كتلة التدفئة في 350 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 60 دقيقة من الحضانة، وقياس رادiolabeling العائد من رد فعل باستخدام الراديوية TLC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيقا لهذه الغاية، بقعة 1 μCi من خليط التفاعل radiolabeling على المشربة السيليكا TLC القطاع. السماح للقسامة لتجف، تشغيل TLC باستخدام شاطف من 50 ملي DTPA (درجة الحموضة 5.5) وتحليل قطاع TLC باستخدام ماسح ضوئي الراديوية TLC 89 عنصر الزركون 4+ منضمة إلى بناء J591-DFO سوف تظهر في أصل (R و &lt;0.1)، في حين سيتم بالكلاب الكاتيونات المجانية 89 عنصر الزركون 4+ بواسطة DTPA وسوف أزل مع الجبهة المذيبات (R و&gt; 0.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب العائد radiolabeling للتفاعل من خلال دمج radiochromatogram، وتقسيم المنطقة تحت المنحنى من R و 0،0-0،1 من المساحة الكلية تحت المنحنى، وضرب من قبل 100. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان العائد radiolabeling غير كافية (عادة نشاط معين النظري لل&gt; 2 ميلي كوري / ملغ)، إرواء رد الفعل مع 5 ميكرولتر من 50 ملي DTPA، ودرجة الحموضة 5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الناتجة immunoconjugate باليودنانوغرام حجم المتاح استبعاد تحلية العمود معبأة مسبقا مع 50،000 الوزن الجزيئي قطع باستخدام شاطف إما 0.9٪ ملحي معقم مع 5 ملغ / مل حمض gentisic أو 0.25 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.5) مع 5 ملغ / مل حمض gentisic . وهذه الخطوة تسفر عن 2 مل من محلول من الانتهاء radioimmunoconjugate 89 عنصر الزركون-DFO-J591. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تنقيتها، تحقق من نقاء الكيمياء الإشعاعية من 89 عنصر الزركون-DFO-J591 باستخدام الراديوية TLC كما هو موضح في الخطوة 2.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب العائد radiolabeling العام للرد فعل بقسمة كمية النشاط وأضاف في البداية إلى حل الضد من كمية النشاط الإشعاعي معزولة مع المنقى 89 عنصر الزركون-DFO-J591 radioimmunoconjugate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نشاط محدد النهائي بقسمة كمية النشاط معزولة مع المنقى 89 عنصر الزركون-DFO-J591 radioimmunoconjugate من قبل الكتلة الأولية من DFO-J591 في رد فعل radiolabeling. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب تركيز أعلى، والتركيز عشره 89 حل عنصر الزركون-DFO-J591 باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي مع 50،000 الوزن الجزيئي قطع. ملاحظة: حمض gentisic المستخدمة في خطوة تنقية النهائية على بعد حاصن الراديو المستخدمة للحد من تدهور الأجسام المضادة بسبب الإنحلال الإشعاعي 46 في حين أن تخزين 89 عنصر الزركون-DFO-J591 radioimmunoconjugate لمدة تصل إلى 48 ساعة عند 4 درجات مئوية. هو ممكن، فمن غير المستحسن. إذا كان radioimmunoconjugate هي خزنها، استخدم 0.25 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.5) مع 5 ملغ / مل حمض gentisic باعتبارها منطقة عازلة تخزين من أجل تقليل خطر بوساطة هيبوكلوريت الإنحلال الإشعاعي. 47 </li></ol> 3. في فيفو PET التصوير مع 89 عنصر الزركون-DFO-J591 تنبيه: كما في القسم بروتوكول 2، وهذه خطوة من بروتوكول ينطوي على التعامل والتلاعب من النشاط الإشعاعي. قبل تنفيذ هذه الخطوات الباحثون أن يتشاور مع إدارة الصحة والسلامة من الإشعاع مؤسسة وطنهم و. جميع possibينبغي أن تؤخذ لو خطوات للحد من التعرض للإشعاع المؤين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الفئران عارية athymic الذكور، الزرع تحت الجلد 5 × 10 6 LNCaP خلايا سرطان البروستاتا والسماح لهؤلاء أن ينمو إلى 100-150 مم 3 طعم أجنبي (بعد 3-4 أسابيع التلقيح). 44 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع radioimmunoconjugate 89 عنصر الزركون-DFO-J591 إلى تركيز 1.0 ميلي كوري / مل في 0.9٪ ملحي معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 200 ميكرولتر من محلول 89 عنصر الزركون-DFO-J591 (200 μCi، 7.4 من mbq). في الوريد الذيل الأفقي من الفئران الحاملة للطعم أجنبي 48 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقطة زمنية التصوير المطلوب (على سبيل المثال، 12، 24، 48، 72، 96، أو 120 ساعة بعد الحقن)، تخدير الماوس مع الأيزوفلورين 2٪: خليط غاز الأكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على السرير من صغير الماسح الضوئي PET الحيوان، والحفاظ على التخدير أثناء الفحص باستخدام الأيزوفلورين 1٪: خليط غاز الأكسجين. قبل وضع الحيوان على السرير الماسح الضوئي، تحقق من التخدير باستخدام طريقة إصبع القدم قرصة وتطبيق ورقةذ مرهم للعين للعيون من الماوس لمنع جفاف أثناء التخدير. 49 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات PET الماوس عن طريق المسح الضوئي ثابت مع حد أدنى من 40 مليون الأحداث المتزامنة باستخدام نافذة الطاقة من 350-700 كيلو ونافذة توقيت صدفة من 6 NSEC 50 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من الاستحواذ على الصورة، لا تترك الماوس غير المراقب وليس لوضعه في قفص مع فئران أخرى حتى استعاد وعيه عليه. </li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في حين أن البناء وradioimmunoconjugates radiolabeling، والتصوير من 89 عنصر الزركون-DFO صفت-عموما إجراءات واضحة إلى حد ما، من المهم للحفاظ على بعض الاعتبارات الرئيسية في الاعتبار خلال كل خطوة من هذه العملية. على سبيل المثال، ربما السبب الأكثر احتمالا للقلق خلال الخطوة الاقتران من ...

نظرا لحساسيتها ملحوظة، تقارب، والانتقائية، ومنذ فترة طويلة تعتبر الأجسام المضادة ناقلات واعدة لتسليم النظائر المشعة للخلايا السرطانية. ومع ذلك، فقد أعاقت تطبيقها في التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) التصوير عن طريق عدم وجود النظائر المشعة الباعثة للبوزيترون مناسبة لوضع العلامات الخاصة بهم. 1-3 واحد من الاعتبارات الأكثر أهمية في تصميم radioimmunoconjugates هو مطابقة الاضمحلال الجسدي متعجلة حياة النظائر المشعة لفي الجسم الحي الدوائية من الأجسام المضادة. وبشكل أكثر تحديدا، والأجسام المضادة وغالبا ما يكون طويلا نسبيا والبيولوجية نصف حياة عدة أيام، وبالتالي يجب أن يكون المسمى مع النظائر المشعة مع مقارنة الجسدية نصف العمر. لتطبيقات التصوير PET، كانت الأجسام المضادة تقليديا رديولبلد مع 64 النحاس (ر 1/2 = 12.7 ساعة)، 86 Y (ر 1/2 = 14.7 ساعة)، أو 124 I (ر = 4.18 1/2 د). 4، 5 ومع ذلك، كل منهذه النظائر المشعة تمتلك القيود الهامة التي تعيق مدى ملاءمتها للتصوير السريري. في حين radioimmunoconjugates المسمى مع 86 Y و 64 النحاس أثبتت واعدة في التحقيقات قبل السريرية، سواء النظائر تمتلك المادية نصف العمر التي هي قصيرة جدا لتكون فعالة للتصوير في البشر. 124 I، في المقابل، لديها ما يقرب من المثالية المادية نصف الحياة ل التصوير مع الأجسام المضادة، لكنها مكلفة ولها خصائص تسوس الأمثل التي تؤدي إلى دقة منخفضة نسبيا الصور السريرية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن 124 radioimmunoconjugates المسمى I تخضع لdehalogenation في الجسم الحي، وهي عملية يمكن ان تخفض نسب النشاط الورم إلى الخلفية. 6،7 محرك الأقراص لإيجاد النظائر المشعة الباعثة للبوزيترون لتحل محل 64 النحاس، 86 Y، و 124 I في radioimmunoconjugates غذى الارتفاع الأخير في البحث على 89 الأجسام المضادة المسمى عنصر الزركون. 8-12 Tكان السبب وراء ظهور 89 عنصر الزركون واضح ومباشر: لradiometal تمتلك الخصائص الفيزيائية الكيميائية شبه مثالية للاستخدام في radioimmunoconjugates PET التشخيص يتم إنتاج 13 89 عنصر الزركون عبر Y 89 (ع، ن) 89 عنصر الزركون رد فعل على سيكلوترون باستخدام. متوفرة تجاريا و 100٪ وفرة بشكل طبيعي 89 هدفا Y. 14،15 وradiometal لديه العائد بوزيترون من 23٪، يضمحل مع عمر نصف من 78.4 ساعة، وتنبعث من البوزيترونات مع الطاقة منخفضة نسبيا من 395.5 كيلو (الشكل 1). 13،16،17 من المهم أن نلاحظ أن 89 عنصر الزركون أيضا تنبعث الطاقة العالية، 909 كيلو γ-ray مع كفاءة 99٪. في حين أن هذا الانبعاث لا تتدخل بقوة مع تنبعث الفوتونات 511 كيلو، فإنه لا تتطلب النظر اضافية فيما يتعلق النقل والمناولة، وقياس الجرعات. على الرغم من هذا التحذير، وهذه الخصائص تسوس يعني في نهاية المطاف أن 89 عنصر الزركون لديه ح أكثر ملاءمة ليس فقطألف الحياة للتصوير مع الأجسام المضادة من 86 Y و 64 النحاس ولكن يمكن أيضا إنتاج صور عالية الدقة من 124 I، التي تنبعث البوزيترونات مع طاقات أعلى من 687 و 975 كيلو فضلا عن عدد من الفوتونات مع الطاقات داخل 100-150 كيلو من والتي تم إنشاؤها بوزيترون الفوتونات 511 كيلو. 13 وعلاوة على ذلك، و 89 عنصر الزركون هو أيضا أكثر أمانا للتعامل، وأقل تكلفة لإنتاج، وresidualizes في الأورام بشكل أكثر فعالية من نظيره اليود المشع لها. 18،19 احد الحد المحتمل من 89 عنصر الزركون هو أنه لايوجد وisotopologue العلاجية، على سبيل المثال، 86 Y (PET) مقابل 90 Y (العلاج). هذا يحول دون بناء متطابقة كيميائيا، وكلاء التصوير بديلة التي يمكن استخدامها كما الكشافة قياس الجرعة لنظرائهم العلاجية. وقال ان التحقيقات تشير إلى أن 89 الأجسام المضادة المسمى عنصر الزركون لديها إمكانات كبديل التصوير لمدة 90 Y- و 177 immunoconjugates لو المسمى.20،21 من وجهة نظر كيميائية، كمعدن المجموعة الرابعة، و 89 عنصر الزركون موجود باعتباره الموجبة +4 في محلول مائي. اكتمال شحن عنصر الزركون 4+ أيون للغاية، كبير نسبيا (نصف قطرها الأيونية فعالة = 0.84 Å)، ويمكن أن تصنف على أنها الموجبة &quot;من الصعب&quot;. على هذا النحو، فإنه يسلك تفضيل بروابط تحمل ما يصل إلى ثمانية الصعبة، والجهات المانحة الأكسجين الأيونية. بسهولة خالب الأكثر شيوعا في 89 radioimmunoconjugates عنصر الزركون المسمى هو ديفيروكسامين (DFO)، وهي مشتقة من حاملة الحديد، خالب احلقي تحمل ثلاث مجموعات hydroxamate. يجند ينسق مستقر الموجبة عنصر الزركون 4+ بسرعة وبطريقة نظيفة في RT في مستويات الحموضة ذات الصلة من الناحية البيولوجية، ويبقى مجمع عنصر الزركون-DFO الناتجة مستقر على مدى عدة أيام في المياه المالحة، مصل الدم، والدم كله. 22 دراسة الحسابية تشير بقوة أن DFO يشكل مجمع hexacoordinate مع عنصر الزركون 4+ التي يتم تنسيقها مركز المعادن إلى ثلاثة كتبها neutراؤول وثلاثة المانحين الأكسجين الأيونية ليجند فضلا عن اثنين من المياه بروابط خارجية (الشكل 2). 23،24 السلوك في الجسم الحي من radioimmunoconjugates توظيف اقتران سقالة 89 عنصر الزركون-DFO كان عموما ممتازة. ومع ذلك، في بعض الحالات، والتصوير والدراسات biodistribution الحادة وقد كشفت مستويات النشاط مرتفعة في عظام الفئران حقن مع 89 الأجسام المضادة المسمى عنصر الزركون، البيانات التي تشير إلى أن 89 osteophilic يتم تحرير عنصر الزركون 4+ الموجبة من خالب في الجسم الحي، وبعد ذلك mineralizes في العظام. 25 مؤخرا، عددا من التحقيقات في تطوير رواية 89 عنصر الزركون 4+ chelators بروابط خاصة فيما ظهرت ثمان جهات مانحة الأوكسجين في الأدب. 24،26،27 ومع ذلك، في الوقت الحاضر، DFO هو خالب معظم العاملين على نطاق واسع في 89 radioimmunoconjugates عنصر الزركون المسمى بهامش واسع. مجموعة متنوعة من مختلفوقد استخدمت استراتيجيات bioconjugation إرفاق DFO إلى أجسام، بما في ذلك bioorthogonal بنقرة والكيمياء، ورد فعل ثيول التفاعلي DFO يبني مع cysteines في الأجسام المضادة، ورد فعل تنشيط DFO الحاملة للاستر يبني مع lysines في الضد 4،28-. 30 بسهولة الاستراتيجية الأكثر شيوعا، ومع ذلك، فقد تم استخدام مشتق ثيوسيانات الحاملة للDFO، DFO-NCS (الشكل 2). 22 هذه خالب bifunctional متاحة تجاريا بقوة وبشكل موثوق يشكل مستقرة، والروابط التساهمية ثيوريا مع lysines لل الأضداد (الشكل 3). على مدى السنوات القليلة الماضية، تم الإبلاغ عن مجموعة واسعة من 89 radioimmunoconjugates عنصر الزركون-DFO المسمى في الأدب. وكانت التحقيقات قبل السريرية وفيرة خاصة، ويضم الأجسام المضادة التي تتدرج من المعروف ستوكسيماب، بيفاسيزوماب، وتراستوزوماب إلى الأجسام المضادة أكثر مقصور على فئة معينة مثل استهداف CD105 TRC105 وfPSA استهداف 5A10. 30-36 وفي الآونة الأخيرة، ظهر عدد قليل من التجارب السريرية المرحلة المبكرة باستخدام الأجسام المضادة 89 عنصر الزركون-DFO المسمى في الأدب. محاكمات تحديدا، قد نشرت مجموعات في هولندا توظيف 89 عنصر الزركون-DFO-cmAb U36 و 89 عنصر الزركون-DFO-إبريتوموماب تيوكسيتان، و 89 عنصر الزركون-DFO-تراستوزوماب. 21،32،37 بالإضافة إلى ذلك، مجموعة من التجارب السريرية الأخرى مع 89 radioimmunoconjugates ZR المسمى تجري حاليا، بما في ذلك التحقيقات هنا في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان باستخدام PSMA استهداف 89 عنصر الزركون-DFO-J591 للتصوير سرطان البروستاتا واستهداف HER2 89 عنصر الزركون-DFO-تراستوزوماب للتصوير سرطان الثدي 23، 30 وبالإضافة إلى ذلك، في حين لا تزال الأجسام المضادة رديولبلد الأكثر شيوعا 89 المواد المشعة المسمى عنصر الزركون، كما استخدمت على نحو متزايد في radiometal مع ناقلات أخرى، بما في ذلك الببتيدات والبروتينات والمواد النانوية. 38-43 </sup&gt; على نمطية هذه المنهجية وضع العلامات عنصر الزركون-DFO 89 هو رصيدا هائلا. ذخيرة من الأجسام المضادة التي تستهدف العلامات البيولوجية هو الآخذة في التوسع، والمصلحة في أداء في مجال التصوير PET الجسم الحي باستخدام هذه التركيبات ينمو على قدم وساق. ونتيجة لذلك، فإننا نعتقد أن تطوير المزيد من الممارسات وبروتوكولات موحدة يمكن أن تستفيد هذا المجال. وقد تم بالفعل نشرت بروتوكول تجريبي ممتاز مكتوبة لDFO-NCS تصريف الافعال و 89 عنصر الزركون radiolabeling التي كتبها Vosjan، وآخرون. 22 ونحن نرى أن المظاهرة البصرية التي يقدمها هذا العمل يمكن أن يزيد من يساعد المحققين جديد لهذه التقنيات. في البروتوكول في متناول اليد، وسوف تستخدم استهداف مستضد غشاء الأجسام المضادة J591 البروستات محددة كنظام نموذج لتوضيح (1) bioconjugation من خالب bifunctional DFO-ثيوسيانات إلى الضد، (2) radiosynthesis وتنقية من 89 ZR-DFO-ماب radioimmunoconjugate،و (3) في الجسم الحي التصوير PET مع 89 عنصر الزركون-DFO-ماب radioimmunoconjugate في نموذج الفئران من مرض السرطان. 23،44،45

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-SCN-Bn-DFO</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-705</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[89Zr]Zr-oxalate</td>
			<td>Various, including Perkin-Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Caution: Radioactive material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01&#160;</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>Cut into strips 0.5 cm wide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

وتقارب استثنائية، والنوعية، والانتقائية من الأجسام المضادة تجعلها جذابة للغاية للناقلات المواد المشعة PET التي تستهدف الورم. نظرا لقدرتها على التنوع نصف الحياة لعدة أيام، ويجب أن يكون المسمى الأجسام المضادة مع النويدات المشعة الباعثة للبوزيترون مع الاضمحلال الجسدي نصف حياة طويلة نسبيا. تقليديا، والنظائر الباعثة للبوزيترون 124 وقد استخدمت I (ر = 4.18 1/2 د)، 86 Y (ر 1/2 = 14.7 ساعة)، و 64 النحاس (ر 1/2 = 12.7 ساعة) لتسمية الأجسام المضادة ل PET التصوير. وفي الآونة الأخيرة، ومع ذلك، فقد شهد مجال زيادة كبيرة في استخدام الباعثة للبوزيترون radiometal 89 عنصر الزركون في PET كلاء التصوير القائم على الأجسام المضادة. 89 عنصر الزركون هو النظائر المشعة المثالي تقريبا للتصوير PET مع immunoconjugates، كما أنها تمتلك نصف المادي -life (ر 1/2 = 78.4 ساعة) والتي تتوافق مع الدوائية في الجسم الحي من الأجسام المضادة وتنبعث منخفض نسبيا الشمبوزيترون RGY التي تنتج صور عالية الدقة. وعلاوة على ذلك، والأجسام المضادة يمكن أن توصف بشكل مباشر مع 89 عنصر الزركون باستخدام خالب ديفيروكسامين المستمدة حاملة الحديد (DFO). في هذا البروتوكول، وسيتم استخدام استهداف مستضد غشاء الأجسام المضادة J591 البروستات محددة كنظام نموذج لتوضيح (1) bioconjugation من خالب bifunctional DFO-ثيوسيانات إلى الضد، (2) radiosynthesis وتنقية من 89 Zr- DFO-ماب radioimmunoconjugate، و (3) في الجسم الحي التصوير PET مع 89 عنصر الزركون-DFO-ماب radioimmunoconjugate في نموذج الفئران من مرض السرطان.

الخطوة الأولى في هذا البروتوكول الاقتران من DFO-NCS إلى الأجسام المضادة هي عادة قوية جدا وموثوق بها. عموما، يمكن الحصول على النقى المعدلة خالب immunoconjugate في&gt; 90٪ العائد، وسوف باستخدام 3 حكمه ضرس DFO-NCS في رد فعل اقتران الأولي تسفر عن درجة-من وضع العلامات من خالب من حوالي 1.0-1.5 D...

Watch this Scientific Journal Video about The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies at JoVE.com

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

وBioconjugation وRadiosynthesis من<sup&gt; 89</sup&gt; الأجسام المضادة عنصر الزركون-DFO المسمى

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Chemistry

Unit 1

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Fundamentals of Chemistry

SCIENTISTS IN ACTION

16.9K Views.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

Video: The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

اوريغامي الملهمة التجميع الذاتي للجزيئات منقوشة واعادة التشكيل

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

عزل وتوصيف المواد الكيميائية من الدهن من البكتيريا سالبة الجرام

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and cleaves intracellular proteins that are essential for neurotransmitter release. BoNT is comprised of a heavy chain (HC), which mediates host cell binding and internalization, and a light chain (LC), which cleaves intracellular host proteins essential for acetylcholine release. While therapies that inhibit toxin binding/internalization have a small time window of administration, compounds that target intracellular LC activity have a much larger time window of administrations, particularly relevant given the extremely long half-life of the toxin. In recent years, small molecules have been heavily analyzed as potential LC inhibitors based on their increased cellular permeability relative to larger therapeutics (peptides, aptamers, etc.). Lead identification often involves high-throughput screening (HTS), where large libraries of small molecules are screened based on their ability to modulate therapeutic target function. Here we describe a FRET-based assay with a commercial BoNT/A LC substrate and recombinant LC that can be automated for HTS of potential BoNT inhibitors. Moreover, we describe a manual technique that can be used for follow-up secondary screening, or for comparing the potency of several candidate compounds.

The botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) is a metalloprotease that enters motor neurons, cleaves its substrate SNAP-25, and disrupts neurotransmission, thereby resulting in flaccid paralysis. Utilizing a high-throughput-compatible FRET-based assay, large libraries of small molecules can be screened for their impact on BoNT/A LC enzymatic activity.

A منصة القائم على الحنق عالية الإنتاجية التي تتلاءم مع تحديد وتوصيف البوتولينوم السموم العصبية ضوء سلسلة المغيرون

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

تشكيل الهياكل الجزيئية البيولوجية أمرت قبل التجميع الذاتي من الببتيدات قصير

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

التجميعي تقسيم وبركة وتوصيف الببتيد المكتبة أميد العالي

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

تخليق البروتين Bioconjugates<em&gt; عبر</em&gt; سيستين-maleimide الكيمياء

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

نظرة ثاقبة لتفاعلات الأحماض الأمينية والببتيدات مع المواد غير العضوية عن طريق جزيء واحدة قوة التحليل الطيفي

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

NMR الطيفي كأداة قوية لتقييم السريع من الدهون الملف من السمك ملاحق النفط

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

توليف وتحليل الطيف الكتلي اليغو-بيبتويدس

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...