Bu eser (LH DK093625 ve DK069909 ve DK047757 JHL için) NIH tarafından desteklenen ve VA (Başarı Ödülü JHL için I01BX000820). Biz gerekli desteği sağlamak için Pennsylvania Zebra balığı Core Üniversitesi&#39;nden Dr. Michael Paketi ve Dr Jie He teşekkür etmek istiyorum.

NOT: Etik Açıklama: Tüm zebrabalıkları deneyler Eastern Virginia Medical School Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Morfolino Hazırlık <ol><li> (Şekil 1A), üreticinin talimatlarına uygun olarak söz konusu gen için tasarım ve sentez için engelleme (AUG-) ve ek yeri engelleyici (Splice-), anti-sens morfolino (MO) oligonükleotidleri. Tablo 1&#39;de üreticinin bilgilerine bakın lütfen. NOT: MOs cam şişelerde liyofilize hisse senetleri olarak sevk edilir. </li><li> 25 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyona kadar MOS yeniden askıya cam şişelere yüksek dereceli steril su ekle. Oligonükleotid tamamen eriyene emin olun. Bazı katı kalıntılar ise, 5 kısaca dk ve vorteks 10 için 65 ° C&#39;de stok oligonükleotid çözeltisi içeren flakon ısı. </li><li> Oda sıcaklığında MO stok solüsyonu saklayın. 4 ° C veya -20 ° C&#39;de saklayın etmeyinC daha düşük sıcaklıklar MO oligonükleotid konteyner duvarına bağlamak için neden olabilir çünkü. Bir spektrofotometre kullanılarak stok çözeltisinin konsantrasyonunu ölçmek, yeni bir MO stok çözeltisi yapılan her zaman (Tablo1 bakınız). </li><li> Istenen doz, yüksek dereceli steril su ile stok çözelti seyreltilerek enjeksiyonu gününde, MO çalışma çözeltisi hazırlayın. % 0.05&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek üzere% 0.5 fenol-kırmızı ekleyin. Örneğin, 15 ng / nL bir konsantrasyon ile 5 ul çalışma solüsyon elde etmek amacıyla 3 ul MO stok çözeltisi ve 0.5 ul% 0.5 fenol kırmızısı su, 1.5 ul ekle. NOT: Bu çalışma konsantrasyonu ile enjeksiyon her damla (500 pl) MO 7.5 ng içerir ve iki damla MO 15 ng içerir. </li></ol> Enjeksiyon Aparatı 2. Hazırlık <ol><li> Satınalma cam (Ayrıntılı bilgi için bakınız Tablo 1 lütfen) iğneler önceden çekti. Alternatif olarak, cam enjeksiyon iğnesi wi çekinBir iğne çektirmesi inci. </li><li> Hava kompresörü açın ve 50 psi basınç ayarı ayarlayın. Diseksiyon mikroskobu ışık kaynağı ve Pico mikro-enjeksiyon pompası açın ve aşağıdaki gibi ayarları: basıncı 20 psi tutun, basınç 10 psi, yolluk 2,5 ve 100 mikro saniye aralığı süresi değerini çıkarma. </li><li> Enjeksiyon çözeltisi 5 ul camını önceden çekti iğne yükleyin ve ucu aşağı bakacak şekilde dikey konumda iğne yerleştirin. Tüm çözüm görünür hava kabarcıkları ile iğne ucu ulaşana kadar bekleyin. Mikroskop yanında uygun bir konumda iğne tutucu yerleştirin ve tutucu içine cam iğne yerleştirin. 45 derece enjeksiyon açısını ayarlayın. </li><li> Yüksek sahneden, mikroskop altında görünümü içine iğne ucu getir, ve ucu ince bölgeye odaklanmak. İnce nokta cımbız ile iğne ucu kırın. </li><li> Bir cetvel ve mikroskop altında yan 0,15 mm tarafının iç çapa sahip bir kılcal tüp yerleştirin;bir sıvı sütununu yapmak için kılcal borunun bir ucuna solüsyonu enjekte edilir. 1 mm uzunluk sıvı kolon başına her 17 damla ulaşmak için çıkarma zamanı ayarlayın, daha sonra her damla hacmi 1 nl sıvı sütunun = π x yarıçapı 2 x uzunluk (damla hacmi () damla / sayımı () &#39;dir. Not: 0.1 mm bir çapı olan bir damla 500 ul bir enjeksiyon hacmi (damla hacmi = 4/3 x π X yarıçapı 3) elde edilir. </li></ol> Morpholinos 3. döllenmiş Zebra balığı Embriyolar hazırlanması ve Enjeksiyon <ol><li> Standart Zebra balığı yetiştiriciliği ve bakım için yayınlanan protokollere göre transgenik zebra balığı üreyen: Tg (GFP wt1b) ayarlayın. Doğal yumurtlama sonra embriyolar toplamak ve E3 su ile dolu bir 10 cm Petri için (5 mM NaCI, 0.17mm KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4) &#39;de muhafaza edin. Hemen 13 MO enjeksiyon başlatın. Mikroskop altında embriyo morfolojisi izlemek ve emin olun MO enjeksiyon tek olanHücre sahne, ya da dört-hücre aşamasında daha sonra. <ol><li> Ile 10 cm&#39;lik bir petri tabağına embriyoların transferi olukları agar kama şeklinde tasarlanmış olmasıdır. Ekstra E3 suyu aspire ve yavaşça olukları içine embriyolar basın. </li><li> Mikroskop altında 1-hücre aşaması embriyo görselleştirmek için mikropipet ile embriyolar işleyin. Yumurta sarısı (1 damla = 500 ul) içine MO bir iki damla enjekte koryon ve yumurta sarısı nüfuz. E3 su ile 10 cm&#39;lik petri enjekte embriyolar transfer ve 28.5 ° C&#39;de inkübe. </li></ol></li><li> Enjeksiyondan sonra, ölü embriyolar kaldırmak ve enjekte edilen embriyoların sayısını kaydetmek. Çanak, her 24 ila 48 saat içinde E3 suyu değiştirin. </li></ol> 4. Fenotip Kurtarma Deneyler <ol><li> Kurtarma MO dayanıklı nedenle, farklı bir birincil baz çifti yapısı (genellikle 3-7 baz çifti uyumsuzlukları) sahiptir ve başka türlerden, bir ortolog seçin. Örneğin, bu deneyde, seçtikfare fare Wnt5a mRNA dizisi Zebra balığı diziden farklı olduğu için. </li><li> Ileri primer translasyon sitesi ve mRNA kodlama bölgesinin sonuna yakın bir ters primer olarak başlayan bir primer tasarımı. Ileri primer dizisinin 5&#39;-ucunda, bir T7 yükseltici seri ekleyin. Bu deneyde, aşağıdaki primer dizileri kullanılır; ileri: 5&#39;taa tac gac tca cta etiketi gga cta TGA tgc tgc TGA agc TGA a- 3 &#39;ve ters: 5&#39;tca CTT DHA gac gta ctg gtc- 3&#39;. </li><li> Yukarıda tasarlanmış bir primer grubu (her bir primerden 0.5 uM) ve Aşağıdaki PCR programı ile fare Wnt5a cDNA sekansını ihtiva eden 0.1 ug şablon DNA ile birlikte 50 ul Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) yapın: 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 1 döngü; 95 ° C (30 saniye), 58.5 ° C (30 saniye), 72 ° C (1 dakika) 35 döngü; ve son uzatma adımı, 7 dakika boyunca 72 ° C&#39;de dayanıklılığı. </li><li> T bitirdikten sonraO döngüsü, bant doğru boyutta olduğundan emin olmak için% 1 agaroz jel üzerinde PCR ürünü 2 ul çalıştırın. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir PCR saflaştırma kiti ile PCR ürünü saflaştırılır. Bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonu kontrol edin. -20 ° C&#39;de saflaştırılmış PCR ürünü depolamak ya da doğrudan bir sonraki aşamada başlıklı RNA transkripsiyonu kullanın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir başlıklı bir RNA sentez takımı ile mRNA başlıklı in vitro sentez. 20 ul RNazsız su içinde seyreltilir ve mRNA konsantrasyonunu belirlemek. -80 ° C de, RNA ve mağaza alikosu. </li><li> Enjeksiyon gününde, RNaz içermeyen steril su ile bir mRNA çalışma çözeltisi hazırlayın. 40 ug RNA, spesifik ya da toksik etkilere yol açmaz olan en yüksek doz genel olarak bir RNA olduğuna dikkat edin. Buz üzerinde çalışma çözüm tutun. MO ile embriyo ve daha sonra kurtarma mRNA, enjekte veya birlikte hem eş-enjekte. Örneğin, mRNA HAZIRLIK konsantrasyonuHer bir enjeksiyonun aşama 4.5 ed 0.08 ug / ul son konsantrasyon için RNazsız su içinde 4.33 ul mRNA (0.4 ug), 0.67 ul, 0.6 ug / ml, sonra bir damla (500 ul) 40 ug içeren mRNA. Aşama 3&#39;te tarif edildiği gibi MO hazırlayın. </li></ol> Floresan Görüntüleme Enjekte Embriyolar 5. hazırlanması <ol><li> 28.5 ° CO kuluçkalandıktan sonra / N, floresan mikroskopi kullanılarak pronephros yapının gözlenmesini etki melanization önlemek için E3 su ile% 0.003, N-feniltiyoüre (PTU) ekleyin. Erken embriyo gelişimini etkiler çünkü Ancak, gastrulasyon önce PTU eklemeyin. </li><li> 48 hpf, elle ince cımbız ile embriyolar dechorionate. Bir ışık diseksiyon mikroskobu altında 48 ve 72 hpf embriyoların görüntüleri çekmek. NOT: Bu resimler anestezi olmadan alınabilir. </li><li> , Flöresanlı mikroskop altında görüntüleme yerleştirerek embriyolar anestezi için yaklaşık 10 dakika önce160 ug / ml tampon Tricaine içeren 10 cm&#39;lik bir petri kabı. 5-10 dakika bekleyin, sonra hafifçe hareket etmeyecek ve bu nedenle anestezi çalıştığını onaylamak için zebrafish dokunun. </li><li> Embriyolar anestezi sonra, (Tablo 1 bakınız)% 3 metil selüloz onları monte ve onları mikroskop altında yüzüstü pozisyonda yönlendirmek. </li><li> Bir floresan mikroskop altında pronephros yapısını dikkate alınmalıdır (Tablo 1 bakınız) ve farklı büyütme (10X ve 20X) ile fotoğraf çekmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+deficiency+causes+ciliary+abnormalities+and+cystic+kidneys.">Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys.</a> J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).</li><li>Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pronephros:+a+model+for+understanding+cystic+kidney+disease.">Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease.</a> Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).</li><li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age,+kidney+weight,+and+body+surface+in+normal+man.">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).</li><li>Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+number+in+patients+with+primary+hypertension.">Nephron number in patients with primary hypertension.</a> N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).</li><li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+number,+renal+function,+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice.">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li><li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish:+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration.">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li><li>Igarashi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+nonmammalian+organisms+for+studies+of+kidney+development+and+disease.">Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+a+novel+Nek-family+kinase+causes+cystic+kidney+disease+in+the+mouse+and+in+zebrafish.">A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish.</a> Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).</li><li>Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrocystin-4+is+required+for+pronephric+duct-dependent+cloaca+formation+in+zebrafish.">Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Wnt5a+in+prostate+gland+development.">The role of Wnt5a in prostate gland development.</a> Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).</li><li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt/planar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2.">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease.">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Polikistik böbrek hastalığı (PKD) insanlarda son dönem böbrek hastalığının önde gelen nedenlerinden biridir ve ilerici kist oluşumu, böbrek genişlemesi, ve anormal tübül geliştirme 14 ile karakterizedir. Otozomal dominant PKD (polikistik böbrek), genetik hastalık olan ya PKD1 mutasyonu, polikistin-1 (PC1) veya PKD2 kodlayan polikistin-2 (PC2) kodlayan, polikistik böbrek sonuçlanır. Diğer birçok gen, birincil cilium bulunan proteinleri kodlayan özellikle, böbrek kist gelişimi dahil o...

Balığı (Danio rerio) embriyo yaygın böbrek gelişim ve polikistik böbrek hastalığı çalışmak için bir model olarak kullanılmıştır. Orada bir hayvan modeli olarak zebrafish kullanarak pek çok avantajı vardır: genetik etkileşimlerin incelenmesinde fizibilite protein demonte için antisens morpholinos (MO) kullanma yeteneği fırsat hızlı bir şekilde embriyo sayıda tahlil edilmesi ve organ fenotipleri görüntüleme kolaylığı larva 1 yaşayan. pronephros omurgalılarda geliştirmek için ilk böbrek ve larva zebrafish 2 işlevseldir. zebra balığı pronephros yapısının memeli metanephros nispeten basit karşılaştırıldığında, üçüncü ve son böbrek, memelilerde geliştirmektir. nefron zor tek nefron yapısını gözlemlemek için yapım, 500,000-1,000,000 nefron 3,4 ve yaklaşık 13.000 nefron 5 olan her bir fare böbrek arasındaki içeren her insan böbreği ile, böbrek çalışma birimi in insan ya da fare böbrekler. zebra balığı iki nefron vardır ve her zebra balığı nefron glomerülleri ve fareler ve insanlarda 6 ve benzeri özelleştirilmiş böbrek hücre tiplerinin tübüllerde bulunan tüm ana bileşenleri içerir. Kapalı bir sistem 7 çünkü böyle Xenopus gibi diğer omurgalı modellere göre, zebra balığı nefron daha yakından memeli nefron benzer. Son yıllarda, zebra balığı genom genetik araçlar, geniş mutan kaynakları ve zebra balığı modelleri transgenik raportör hatları koleksiyonları geniş giriş sağlayan dizilenmiştir. 12-72 saat sonra döllenme (hpf) arasında Zebra balığı pronephros formları şeffaf embriyolar kolayca görülebilir. Wilm tümörü proteini WT1 böbrek gelişimi için önemli bir faktördür. Wt1b promoteri Tg kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade eden transjenik zebrabalıkları hatları (wt1b GFP) GFP Expre göstermektedirsalgılanması, özellikle 17 hpf 8 başlayarak, Zebra balığı embriyolarının Pronephric bölgelerde yer. Nefronofitizi (NPHP), otozomal resesif kistik böbrek hastalığı, NPHP genlerinin 9 mutasyonlar neden olur. (Wt1b GFP) morfolino tarafından demonte NPHP4 Tg kist oluşumuna yol açtı. Balık 10 Bu nedenle, bu transjenik balık böbrek gelişimi esnasında böbrek yapıları ve kist oluşumunun gözlenmesi için uygun bir modeldir. Daha da önemlisi, böbrek gelişim modülatörlerinin etkisi, zaman ve iş gücü verimli bir şekilde, bu suşu kullanılarak incelenebilir. Gen modülasyonu sonrası böbrek kist oluşumuna görselleştirmek için bir model olarak, balık: Bizim kağıt Tg (GFP wt1b) kullanımını tarif etmektedir. Biz zebrafish Wnt5a geni yıkmak için başlangıç ​​ve bağlayıcı sitesi, anti-duyu MOS kullanılır. Wnt5a çeşitli organ ve hücre sonrası gelişiminde önemli bir rol oynar, Wnt ailesinin bir kanonik salgılanan bir glikoprotein olup,Fonksiyon 11. Wnt5a renal tübüler uzama esnasında yönlendirilmiş hücre bölünmesi bir rol oynadığı tespit edilmiştir düzlemsel hücre polarite (PCP) yol da dahil olmak üzere olmayan doğal Wnt yollar üzerinden çalışır. Wnt5a, bundan başka Vangl2 stabilite 12 teşvik VANGL düzlemsel hücre kutup protein 2 (Vangl2) ile bir kompleks oluşturarak Wnt5a sinyal çeviren tirozin kinaz benzeri reseptör (Ryk) ile bir kompleks oluşturarak Wnt / PCP yolu düzenler. PCP yolunda kusurlar rastgele hücre bölünmesi sonucu ve böbrek kist oluşumuna neden olabilir. Wnt5a demonte aşağıdaki böbrek kist oluşumunu gözlemlemek için Zebra balığı çizgi: Biz Tg (GFP wt1b) kullanılır. Tg (wt1b: GFP) Zebra balığı modeli canlı görüntüleme ve böbrek yapısının zamanında gözlem izin verir. Wnt5a demonte sonra, böbrek kist oluşumu 24 hpf başlayan bulundu; 72 hpf, kistler glomeruli ve proksimal tübüllerde bulunamadı. Bu yöntem aynı zamanda s kullanılabilirböbrek kist oluşumuna neden olabilir creen diğer genler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1135">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">0.5% Phenol-Red</td>
			<td style="width:229px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">P0290</td>
			<td style="width:491px;">Color indicator for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Morpholino</td>
			<td style="width:229px;">Genn Tools, LLC</td>
			<td style="width:195px;">(customized)</td>
			<td>Customized designed to the gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Pre-pulled needle</td>
			<td style="width:229px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:195px;">MINJ-PP</td>
			<td style="width:491px;">If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">T7 mMessage Kit</td>
			<td style="width:229px;">Ambion</td>
			<td style="width:195px;">1344</td>
			<td>For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">N-Phenylthiourea</td>
			<td style="width:229px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">P7629</td>
			<td>For prevention of melanization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Tricaine</td>
			<td style="width:229px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">A5040</td>
			<td>Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Methyl Cellulose</td>
			<td style="width:229px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">M-0387</td>
			<td>For position of zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">28104</td>
			<td>For purification of PCR product for cap RNA synthesis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:195px;">U1511</td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Tag DNA Polymerase</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:195px;">10342-053</td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Equipment</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">NanoDrop sepctrophotometer</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:195px;">ND-1000</td>
			<td>For measure morpholino and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Air Compressor</td>
			<td style="width:229px;">Werther International, Inc.</td>
			<td style="width:195px;">Panther Compact 106</td>
			<td>Air source for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Pico micro-injection pump</td>
			<td style="width:229px;">World Precision Instruments Inc</td>
			<td style="width:195px;">PV830 Pnematic PicoPump</td>
			<td>Other types of microinjection system can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Micro-manuplator</td>
			<td style="width:229px;">World Precision Instruments Inc</td>
			<td style="width:195px;">MMJR</td>
			<td>Right-handed (MMJL for left handed)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Needle holder</td>
			<td style="width:229px;">World Precision Instruments Inc</td>
			<td style="width:195px;">5430-ALL</td>
			<td>To hold needle for micromanipulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dumont Tweezers</td>
			<td style="width:229px;">Fine Surgical Tools</td>
			<td style="width:195px;">11253-20</td>
			<td>For breaking off the needle tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica M205C&#160;</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>For observing and imaging zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Fluorscence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio Obserer D1m &#160;</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>For imaging zebrafish pronephros</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Capillary tube (I.D 0.15 mm)</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td style="width:195px;">CV1525Q-100</td>
			<td>For measure the volume of each injected drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a possible zebrafish model of polycystic kidney disease: knockdown of wnt5a causes cysts in zebrafish kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Wnt5a yıkmak çeviri MO engelleme getirerek elde edildi (Ağustos-MO) veya bir hücre aşamada Zebra balığı embriyolarının için ekson / intron sınır ekleme MO (ekleme-MO). Ağustos-MO nedenle, hem anne ve zigotik Wnt5a mesajını engeller, başlangıç ​​kodonu hedef ve. ek yeri MO, üçüncü parça verici bölge hedef ve Wnt5a (Şekil 1A) yalnızca zigotik transkript inhibe eder. AUG- ve splice- morphants kıvırcık kuyruk altındaki vücut ekseni ve kalp çevresi ödem...

Watch this Scientific Journal Video about A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys at JoVE.com

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Polikistik Böbrek Hastalığı Olası Zebra balığı Modeli: demonte<em&gt; Wnt5a</em&gt; Zebra balığı Böbrekler Kistler Nedenler

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

a-possible-zebrafish-model-polycystic-kidney-disease-knockdown-wnt5a

Research

JoVE Journal

Medicine

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

11.0K Görüntüleme.  Eastern Virginia Medical School. We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish. 