We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+to+a+depth+of+1000+&#956;m+in+living+brains+by+use+of+a+Ti:+Al+2+O+3+regenerative+amplifier.">Two-photon imaging to a depth of 1000 &#956;m in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier.</a> Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).</li><li>Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation.">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li><li>Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo,+Deep+Tissue+Three-Photon+Imaging+at+the+1700-nm+Spectral+Window.">In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window.</a> Biomedical Optics. 7 (3), (2012).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).</li><li>Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+diseased+nervous+system.">In vivo imaging of the diseased nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).</li><li>Kerr, J. N. D., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo:+watching+the+brain+in+action.">Imaging in vivo: watching the brain in action.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).</li><li>Lichtman, J. W., DENK, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Big+and+the+Small:+Challenges+of+Imaging+the+Brain's+Circuits.">The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits.</a> Science. 334 (6056), 618-623 (2011).</li><li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake,+Mobile+Mice.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Imaging+of+Neural+Activity+in+Awake,+Head-Restrained+Mice.+.">Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. .</a> Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).</li><li>Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats).">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats).</a> Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).</li><li>Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anesthesia+selectively+disrupts+astrocyte+calcium+signaling+in+the+awake+mouse+cortex.">General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).</li><li>Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clustering+of+Neurons+in+Motor+Cortex+Determined+by+Cellular+Resolution+Imaging+in+Awake+Behaving+Mice.">Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice.</a> Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).</li><li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice.">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).</li><li>Ylera, B., Ert&#252;rk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronically+CNS-Injured+Adult+Sensory+Neurons+Gain+Regenerative+Competence+upon+a+Lesion+of+Their+Peripheral+Axon.">Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon.</a> Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).</li><li>Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+by+in+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+vascular+and+axonal+networks+in+injured+mouse+spinal+cord.">Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459 (2009).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).</li><li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+imaging+reveals+distinct+inflammatory+activity+of+CNS+microglia+versus+PNS+macrophages+in+a+mouse+model+for+ALS.">In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS.</a> Plos One. 6 (3), 17910 (2011).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nature Communications. 3, 1227 (2012).</li><li>Dibaj, P., Steffens, H., Zsch&#252;ntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+rapid+morphological+reactions+of+astrocytes+towards+focal+lesions+in+an+ALS+mouse+model.">In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model.</a> Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).</li><li>Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+a+phase-specific+role+of+STAT3+during+central+and+peripheral+nervous+system+axon+regeneration.">In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+Two-photon+Microscopy.">In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy.</a> J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).</li><li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

هذه التقنية أثبتت هنا تسمح المتكررة، الوقت الفاصل، في الجسم الحي التصوير من ظهري الماوس SC إلى عدة أسابيع بعد الجراحة دون الحاجة إلى عمليات جراحية لاحقة. يمثل هذا الإجراء تحسنا كبيرا خلال دراسات التصوير تكرار جراحة أو على النهج النسيجية portmortem، حيث يتم فقدان المعلومات عن ديناميات الخلوية. لدينا في السابق 30 أثبتت قيمة هذه التقنية لدراسة SCI علم الأمراض في الجسم الحي. تم تحديد أقصى مدى الطولي للتصوير من خلال نمو لذلك، النسيج الليفي كثيفة على السطح الظهري للSC. مع مرور الوقت، وأدى هذا النمو إلى فقدان النقيض من الصورة والقرار. كما تم رأيت هذا النمو في الأعمال التحضيرية الجراحية البديلة 31. الروايات المتناقلة، لاحظنا أن هذا النمو يمكن التقليل من غسل بعناية السطح الظهري SC لإزالة منتجات الدم، وختم سطحقطع العظام مع cyanoacrylate، وختم حواف من الغرفة جيدا مع السيليكون والمطاط الصناعي، والتقليل من الفضاء الخلالي بين SC الظهرية وغطاء زجاجي. في الآونة الأخيرة، فقد ثبت مقاربة أخرى مماثلة لمنطقتنا باستخدام غرفة البولي 32. استخدام البولي هو مفيد لأنه متوافق مع الأشعة السينية وطرائق التصوير الصوتية، وهي ليست الحال بالنسبة لأجزاء لدينا الفولاذ المقاوم للصدأ. ومع ذلك، مع التكنولوجيا الآن في كل مكان من الطابعات 3D، يمكن أن تكون ملفقة أجزاء الغرفة من مجموعة واسعة من المواد لتتناسب مع احتياجات محددة. لقد طبعت مؤخرا جميع أجزاء لدينا في فوتوبوليمير واضح. عيب واحد رئيسي في غرفة مغلقة هو عدم القدرة على إدارة جرعات متكررة من الأدوية أو الأصباغ الخارجية مناسبة لSC التصوير 34. ومع ذلك، من خلال الاستفادة من الاستقرار الميكانيكي للنظام الحالي دينا، ونحن قد استخدمت بالفعل لدينا غرفة الحالية إلى النجاحلاي ترسيخ قسطرة داخل القراب متصلة تحت الجلد المزروع ميناء حقن، مما سمح لتسليم المخدرات في نقاط زمنية متعددة حتى في نظام الدائرة المغلقة (عمل غير منشورة). وعلاوة على ذلك، نظرا لطبيعة وحدات من الصفيحة العلوية، سوف الإصدارات المستقبلية من هذا المستحضر تشمل غرفة الأغلاق للسماح لتطبيق المتكررة من كل من العوامل العلاجية والعلامات الفلورية. ومن الممكن أيضا أن نتصور العليا لوحات مع تصاعد لتسجيل الأقطاب، وتدرج البصرية، ومنافذ لتوصيل الدواء. ان مثل هذه الإضافات من المرجح أن تكون أكثر تحديا لتنفيذ باستخدام نظام أكثر الحد الأدنى من Fenrich وآخرون. 31. وفي الختام، تقدم غرفة لدينا منصة بوابة التي تقوم عليها ويمكن أن تستند التجارب المتنوعة.

الوقت الفاصل في الجسم الحي المجهري في الكائنات سليمة تمكن رؤية مباشرة من العمليات البيولوجية المعقدة التي لا يمكن الوصول إليها لالتقليدي تحليل نقطة لمرة واحدة، مثل المناعية. على وجه التحديد، المجهري متعدد الفوتون (MPM) 1 يسمح للتصوير في نثر الأنسجة، مثل القشرة المخية الحديثة القوارض، حيث تحقق التصوير تصل إلى 2،3 والتي تزيد من 4 1 مم. عندما جنبا إلى جنب مع الاستعدادات الجراحية 5-7 التي إجراء واحد يسمح بالوصول البصري إلى الدماغ لمدة أسابيع أو شهور، وقد استخدمت هذه الأساليب المجهر لدراسة العمليات الدينامية في الدماغ في الدول السليمة والمريضة 8-11. وبالإضافة إلى ذلك، تم وضع بروتوكولات 12،13 التي توفر للتصوير في الجسم الحي في مستيقظا (أي غير تخدير) الحيوانات، والسماح لالخلوية القرار التصوير وظيفية خلال المقايسات السلوكية. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لcomparisإضافات من مترابطة نشاط الخلايا العصبية 14، نجمية الكالسيوم مما يشير إلى 15 في الحيوانات تخدير ومستيقظا، وتحديد مهمة محددة مجموعات الخلايا العصبية 16، وقدرة الخلايا العصبية لتميز موقع الكائن على الخط الطولي التحفيز 17. ونظرا للإمكانات هذا النهج لتوضيح آليات صحية ومرضية، والوقت الفاصل بين التصوير في الجسم الحي تم تطبيقها على الحبل الشوكي الماوس (SC)، والسماح لتحديد انحطاط محور عصبي حاد (AAD) كآلية المرض 18. التحقيق دراسات لاحقة آثار الآفات المحيطية على العقد الجذرية الظهرية (DRG) محور عصبي تجديد 19، ودور الأوعية الدموية في محور عصبي تجديد 20، الكيميائي الدبقية ردا على إصابة 21، والهجرة T-خلية في التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) 22، والنشاط من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية 23،24 25 ردا على amyotrophالتصلب الجانبي جيم (ALS)، ودور STAT-3 في تبرعم محور عصبي بعد SC إصابة (SCI) 26، وآلية من فقدان محور عصبي والانتعاش في EAE 27. وعلى الرغم من نجاح هذه المناهج، وجميع هذه الدراسات تقتصر على إما جلسة التصوير واحدة، مما يحد من الدراسات لديناميكية على المدى القصير، وإلا اللازمة المتكررة الفتحات الجراحية للحيوان في كل نقطة زمنية التصوير، مما يحد من عدد من النقاط الزمنية الوصول إليها ويزيد من احتمال من التحف التجريبية التباس. وقد نشرت البروتوكولات لهذه العمليات الجراحية سابقا 28،29. في الآونة الأخيرة، نشرنا تقنية 30 لغرس غرفة العمود الفقري المزمنة التي مكنت الوقت الفاصل بين التصوير MPM في SC الماوس فوق أسابيع عدة دون الحاجة إلى تكرار عملية جراحية. لفترة وجيزة، وشملت هذه إعداد الجراحية أداء الثقب في العمود الفقري الصدري السفلي وغرس غرفة من أربعة أجزاء. الغرفة شملتثلاثة أجزاء الفولاذ المقاوم للصدأ خصيصا تشكيله التي فرضت فقرات المحيطة الثقب، وساترة الزجاج توضع فوق SC والمضمون مع سيليكون المطاط الصناعي. هذه التقنية سمحت للتصوير روتيني إلى أكثر من 5 أسابيع بعد العمل الجراحي في حالات صحية والجرحى دون الحاجة لتكرار عملية جراحية. عدد نقاط وقت التصوير كان محدود فقط من التردد الذي الحيوان يمكن أن يتسامح مع تحريض التخدير. تم تصوير حياة محدودة بسبب نمو، النسيج الليفي كثيفة على سطح SC. وبالإضافة إلى ذلك، نحن التحقق من أن عملية الزرع الجراحي لم يكن لها تأثير على المدى الطويل على وظيفة الحركة. منذ نشر لدينا الأولي، وقد وصفت النهج البديلة أيضا تمكين التصوير طويل الأجل في أماكن أخرى SC 31-33. يوضح هذا البروتوكول إجراءاتنا لزرع الغرفة العمود الفقري وضعنا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:68px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:201px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">15000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">forceps, scissors, scalpel, etc.</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">multiple&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -magnetic fixator</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -retractor</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-09</td>
			<td>other retractors may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -elastomer</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">feedback controlled heating blanket</td>
			<td style="width:68px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:115px;">Model: TC-1000 Mouse&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Part No. 08-13000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">stereotax</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber holders</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:68px;">Loctite</td>
			<td style="width:115px;">Loctite 495</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8101</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8501</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycopyrrolate</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:68px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ketoprofen</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Elastomer</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Mixing Tips</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIKMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

باتباع الإجراء أعلاه، يجب على كل مرحلة من مراحل عملية جراحية تحاكي نتائج كل مرحلة من مراحل عملية جراحية المبين في الشكل 2. يجب توخي الحذر خاصة عند تطبيق المطاط الصناعي السيليكون للقضاء على فقاعات الهواء تحت الزجاج أو على الأقل ضمان أنهم تقع في محيط منطقة الفائدة (الشكل 2L). لجراح ذوي الخبرة، والمضاعفات الجراحية التي تتطلب القتل الرحيم إما أثناء الجراحة أو خلال أول 24 ساعة postsurgery تحدث في حوالي 20٪ من العمليات. تنشأ هذه المضاعفات الأكثر شيوعا من نزيف مفرط الأنسجة اللينة أو عدم إرفاق آمن الغرفة إلى العمود الفقري. في غرف زرعها بنجاح، يبقى نافذة عادة شفافة بصريا لأسابيع متعددة (الشكل 3). وعلى الرغم من أفضل الجهود، يشكل، ليفي، ونمو الأورام مبهمة في كثير من الأحيان في غضون بضعة أيام، مما أدى إلى obscuri جزئينانوغرام من النافذة (الشكل 3C - F، خط متقطع الأسود). الهياكل الفلورسنت من الصعب أن نرى باستخدام 2PEF المجهري تحت هذا النسيج الليفي. نجد التوزيع ذات النسقين النتائج، مع ما يقرب من 50٪ من النوافذ زرعها بنجاح المتبقية واضحة لأكثر من 5 أسابيع بعد العمل الجراحي، وحوالي 50٪ تصبح التعتيم ضمن 1 - 3 أسابيع. للنوافذ التي لا تزال واضحة، ومعظم الأماكن داخل نافذة عرض تجربة فقط على درجة متواضعة من اتساع الأوعية الدموية في أو فوق الجافية (الشكل 3D - F، النجمة الخضراء)، والتي لا تعيق 2PEF التصوير. وأظهرت دراستنا السابقة 30 زيادة في الخلايا الدبقية الصغيرة ولكن ليس كثافة نجمية تحت النافذة وفقرات المجاورة، مشيرا إلى التهاب خفيف مماثل لتلك التي شوهدت في الجمجمة الاستعدادات نافذة 5. في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتين أصفر فلوري (YFP) في مجموعة فرعية من ظهري gangl الجذرIA (DRG) الخلايا العصبية (خط YFPH، جاكسون مختبرات)، وكانت محاور بوضوح مميزة لعدة أسابيع بعد العملية (الشكل 4A و ب) وطالما أربعة أشهر في حيوان واحد (لا تظهر البيانات). وقدمت الأوعية الدموية (4A الشكل وباء) مرئية عن طريق حقن-orbitally الرجعية الفلورسنت تكساس الأحمر المسمى ديكستران في بلازما الدم. تم تصور الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في الفئران معربا عن GFP في CX3CR1 الضربة القاضية في الماوس (CX3CR1-GFP، جاكسون مختبرات) عبروا إلى خط YFPH (الشكل 4C). وعلى النقيض من قرار تدهورت بشكل متواضع على مر الزمن (الشكل 4C) بسبب تشكيل لفرط ليفي وصفه سابقا 30. نحن تصويرها بشكل روتيني لمدة 3 ساعة في جلسة واحدة دون وفيات وبقدر ما كل 12 ساعة. مدة الدورة وتردد محدودة بسبب التسامح من الحيوان لتحريض التخدير، يصاحب ذلك مع الاعتبارات الأخلاقية المصاحبة بالألم والضيق للحيوانات المختبر. &lt;<html> ص الطبقة = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Figure1. جناح العمليات الجراحية المخصصة يسهل تسليم الغرفة خلال زرع واستقرار الغرفة خلال جلسات التصوير لاحقة. اثنين من الجانب القضبان والصفيحة العلوية (A) يتم تجميعها (ب) باستخدام مسامير صغيرة في غرفة العمود الفقري (C). يسمح جدول الجراحي على مشاركات قابلة للتمديد (D) لتسليم وتحامل من الجانب القضبان إلى فقرات باستخدام دبابيس عقد (E). جلسات التصوير لاحقة بدلا من استخدام الخيوط المشاركات داخليا لنعلق على غرفة عبر مجموعة مسامير على الأجنحة للزرع (F). لقد تم تعديل لوحة (ب) من هذا الرقم من فارار وآخرون، طرق الطبيعة، 2012 30 بإذن من الطبيعة المجموعة النشر.96 / 52196fig1large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> الشكل 2. يتم تنفيذ الثقب الظهرية ويتم زرع في غرفة التصوير المزمنة لتوفير الوصول البصري إلى الحبل الشوكي. ووصف الإجراء في المونتاج. أولا، والجلد (لوحات A، B، أقسام بروتوكول 3،1-3،4) والعضلات (C؛ 3.5) وتراجع لفضح فقرات الأساسية الثلاث. تتم إزالة الأنسجة المغطي هذه الفقرات الثلاث (D، E، F، 3،6 حتي 3،10) والعمليات الجانبية يتم كشط نظيفة قبل أن يتم فرضت أنها على كلا الجانبين (G، H، 3.12). بعناية، والصفيحة الظهرية للفقرة المركزية تتم إزالة وحواف العظام مختومة (I </stronز&gt;. 4. 6). يتم تطبيق الصفيحة العلوية (J؛ 5.1) ومسامير تثبيتها في مكانها (K، 5.3) لتأمين غرفة قبل ختم الغرفة مع المطاط الصناعي السيليكون والزجاج غطاء (L، 5.5). بعد إزالة المسامير تسليم (M، 5.8)، يتم لصقها على الجلد على جانبي الغرفة (M، N، 5.8) ويتم إدراج مجموعة مسامير في أجنحة (O؛ 5.9). وأخيرا، وأغلقت فتحات المسمار مع الاكريليك الأسنان (P؛ 5.10). ويتم وضع الماوس في قفص نظيفة لاسترداد <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> وما زالت هناك غرفة في العمود الفقري المزمنة الشكل 3. اوف شفافة بصريا<html> إيه أسابيع متعددة. صور الضوء الأبيض من الحبل الشوكي، والتي تتراوح بين عدة دقائق (A) إلى ثلاثة أسابيع بعد العمل الجراحي (F). معالم الأوعية الدموية يمكن تمييزها في جميع نقاط الوقت (الأسهم الصفراء). وينظر تغيير يذكر في postsurgery يوم واحد (B). فرط كثيفة ليفي (C - F، يحدها خط متقطع على أسفل اليمين) هو الحاضر في وقت مبكر من ثلاثة أيام والنتائج في التعتيم الجزئي للمنطقة التصوير. اتساع الأوعية الدموية معتدل (D، E، F، النجمة الخضراء) موجود أيضا، ولكن لا تحجب الأوعية الدموية الأصلي في ضوء أبيض أو 2PEF التصوير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" />الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; الشكل 4. غرفة في العمود الفقري المزمنة تسمح المتكررة التصوير متعدد الفوتون دون الحاجة لتكرار عملية جراحية. التصوير المتكرر من الفئران المعدلة وراثيا معربا عن YFP في مجموعة فرعية من المحاور DRG (الأخضر) في حبلات الظهري من العمود الفقري الحبل والأوعية الدموية (أحمر) وصفت من قبل داخل الأوعية الدموية حقن صبغة (A، B). ويمكن أيضا أن يتم تعقب نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة (البنفسجي) على مر الزمن في Thy1-YFP / CX3CR1-GFP الفئران المعدلة وراثيا المزدوج (C). في حين محاور والخلايا الدبقية الصغيرة لا تزال مرئية، وعلى النقيض من قرار انخفاض طفيف مع مرور الوقت (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

في هذا الفيديو، ونحن تصف الإجراء لزرع غرفة التصوير الضوئي مزمنة على الحبل الشوكي الظهري على فأرة الحاسوب الحية. تتم مراجعة الغرفة، إجراء العمليات الجراحية، والتصوير المزمن وأظهر.

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من الحبل الشوكي ماوس

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

a-procedure-for-implanting-spinal-chamber-for-longitudinal-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

13.9K Views.  Cornell University.  في هذا الفيديو، ونحن تصف الإجراء لزرع غرفة التصوير الضوئي مزمنة على الحبل الشوكي الظهري على فأرة الحاسوب الحية. تتم مراجعة الغرفة، إجراء العمليات الجراحية، والتصوير المزمن وأظهر. 

Video: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

التصوير نشر في الحبل الشوكي الجرذ عنق الرحم

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

فيفو في الأسلوب الثنائي-اللون لتصوير الأوعية الدموية ديناميات بعد إصابة الحبل الشوكي كونتوسيفي

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

إعداد نشط إيقاعي في الحبل الشوكي الدماغ القوارض الولدان المختبر وشريحة رقيقة

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...