We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

참고 : 관리와이 문서에있는 모든 쥐의 실험 조작은 코넬 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. 수술에 대한 설정 <ol><li> 오토 클레이브 멸균하거나 승인 절차를 사용하여 필요한 모든 도구들을 소독. 최소한, 메스, 가위 바나, 남은 가위, 집게, 보석의 드라이버, 면봉, 견인기 세트, 임플란트 (그림 1A) 및 전달 시스템 (그림 1D, E)를 포함한다. </li><li> 70 % 에탄올 및 / 또는 적절한 소독제로, 어떤 입체경 노브를 포함한 모든 표면을 닦아. </li><li> 사용자 정의 stereotax (그림 1D)를 중첩시키고 멸균 커튼으로 벤치 탑 주변으로 멸균 필드를 만듭니다. 가열 패드 (제어 바람직 피드백) stereotax의 상단에와 멸균 커튼 아래에 배치해야합니다. </li></ol> 2. 준비수술에 대한 마우스 <ol><li> 레이트 호흡하면 약 1 호흡 / 초의 감속까지 유도 챔버 내에 5 % 이소 플루 란 / 산소 하에서 마우스를 마취. </li><li> 이소 플루 란 노출을 계속 코 콘을 사용하여 멸균 필드에서 멀리 준비 영역에 마우스를 전송합니다. 2 %에 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다. 각막 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 사지 당 주입 부피의 약 50 %를 제공, 30 G 바늘과 3/10 CC 주사기 - 근육 (29)를 사용하여 뒷다리에 0.05 ㎎ / 100g 마우스에 글리코 (항콜린 성 약물)을 관리합니다. 주 : 글리코는 마우스가 마취 상태에서 폐 유체 축적을 방지하기위한 것이다. </li><li> 전기 면도기를 사용하여, 2cm 폭 흉부 아치를 중심으로 마우스의 등쪽면, 약 3cm 길이의 부분을 면도. 잘 떨어져 면도 영역에서 어떤 손질 머리를 청소합니다. </li><li> 면도에 피하 및 말초 다음 주사를 관리29 사용하여 패치 - 30 G 바늘과 3/10 CC 주사기 : 1 ㎖ / 100g 마우스 5 % 포도당 생리 식염수에 (수분 공급), 5 ㎎ / ㎏ 마우스 케토 프로 펜 (진통제에 대한 NSAID), 0.2 ㎎ / ㎏ 마우스 덱사메타손 (dexamethasone)을 ( 항 염증 스테로이드)은 염증을 줄일 수 있습니다. </li><li> 면봉 사용, 세척 사이에 1 분을 기다리고, 요오드 및 70 % 에탄올의 세 가지 교류 세척을 수행합니다. </li><li> 절개 부위에 통증을 줄일 30 G 바늘과 면도 패치의 중심에 3/10 공통 주사기 - 피하 사용 29 0.125 %의 부피 바카 인 (말초 신경 블록) 100 ㎕를 관리. </li><li> 사용자 정의 stereotax (그림 1D)로 전송 마우스, 직장 온도계를 삽입하고 bupivicaine을 적용하려면 약 10 분을 기다립니다. </li></ol> 3. 노출 3 인접 흉부 척추의 등 박판을 청소 <ol><li> 메스 블레이드를 사용하여, 관심 (그림 2A)의 척추 위의 작은 (5mm 이하) 절개를 만듭니다. </li><li&gt; 중 집게를 사용하거나 수술 가위의 끝을 삽입하고 핸들을 확산하여, 무딘 절개하여 피부에있는 구멍의 크기를 증가. </li><li> 메스 나 수술 가위를 사용하여 부드럽게 피부와 기본 근육 사이의 결합 근막을 떼어 놓다. </li><li> 가능 (그림 2B)로 큰 작업 영역을 허용, 피부를 다시 개최하기 위해 견인기를 사용합니다. 가슴에 부하를 증가시켜 호흡을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 한 쌍의 집게 그립 상부 근육을 통해 노출 될 입쪽 가장 척추골 사용. 메스를 사용하여 멀리 3 척추 (그림 2C)에서 지느러미 프로세스의 양쪽에 조직을 잘라. </li><li> 메스 블레이드, 면봉, 및 / 또는 뼈 스크레이퍼의 조합을 사용하여, 지느러미 라미 (그림 2D)에서 모든 덮는 조직을 제거합니다. </li><li> 수술 가위를 사용하여 조심스럽게 두 라 테라에 척추에 부착 된 힘줄을 절단척추 (그림 2E)의 L 가장자리. </li><li> 메스를 사용하여 부드럽게 클램핑 깨끗한 표면을 제공하기 위해 가능한 척주의 측면 에지로부터 많은 조직을 제거. </li><li> 조심스럽게 뼈 스크레이퍼 및 / 또는 면봉을 사용하여 남아있는 연부 조직의 척추 시술을 시행. 다른 곳에서 수술 가위 (그림 2 층)을 사용하는 모든 부조리 한 조직을 멀리 트림. 주 : 클램핑과 척추가 완전히 노출되는 등의 후궁 절제를 수행하는 두 필수적이다. cauterizer 이후의 출혈을 조절하는데 유용 할 수있다. </li><li> 피부 (도 2F) 이외에 척주를 둘러싼 조직을 다시 잡아 견인기 시프트. </li><li> 배달 게시물에 접지 단자에 임플란트 측면 막대를 연결합니다 (그림 1E와 동일) 이후 홀더에 이러한로드합니다. </li><li> securel를 보유 할 충분한 압력을 적용, 측면 막대를 사용하여 3 척추 클램프Y (그림 2G, H). 3 척추의 레벨 클램핑을 보장하기 위해 집게를 사용합니다. 몇 번의 시도가 필요할 수도 있습니다. 사이드 바는 레벨과 후궁 절제술을 수행 평행 이전에 모두 있는지 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 깨끗한 면봉을 사용하여 클램핑 척추의 등 표면을 건조. </li></ol> 4. 지느러미 후궁 절제술을 수행 <ol><li> 중간 클램프 척추의 경막 외 공간에 vannas 가위의 끝을 삽입하고 가볍게 핸들을 쥐어 짜기; 뼈가 건조하면 등쪽 박판의 길이를 따라 균열한다. 얇은 판을 해제 반대편에서이 절차를 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 신중하게 얇은 판의 주동이의 꼬리 끝에서 모든 결합 조직을 절단하고 그것을 멀리 들어 올려, 집게 등의 프로세스에 의해 느슨한 얇은 판 파지. </li><li> 0.9 %의 식염수 및 / 또는 인공 뇌척수액 (ACSF)를 사용하여, 철저하게 혈액 overlyi을 씻어척수 겨. 초과 액체를 흡수하기 위해 면봉을 사용합니다. </li><li> 위 vannas으로 조심스럽게 위로 임플란트 사이드 봉에 뼈의 측면 에지 트림. 다시 씻어 ​​내고 면봉 식염수 / ACSF를 사용하여 출혈을 제어 할 수 있습니다. </li><li> 30 G 바늘 - 골막의 일부가 분리 및 척수를 덮는다었을 부드럽게 면봉 및 / 또는 29을 사용하여이 조직을 제거. 절차의이 부분에서 척수를 손상하지 않도록주의하십시오. 단단히 감싸 경막과 느슨한 골막을 혼동하지 마십시오. </li><li> 조심스럽게 하나 치과 아크릴 및 시아 노 아크릴 레이트 (도 2I) 모두와 뼈의 나머지 노출 된 가장자리를 밀봉. 접착제가 노출 된 척수에 흘러 가지 않도록 특별한주의하십시오. </li></ol> 5. 인감 상공 회의소 <ol><li> 4 슬롯 사이드 봉 (4)에 구멍을 일렬 것을 개구 위에 놓이는 노출 된 스핀 있도록 신중 상판 놓고알 코드 (그림 1B와 2J). </li><li> 보석의 드라이버를 사용하여 조심스럽게 포셉 또 한 쌍으로 드라이버의 샤프트를 안정화, 첫 번째 나사를 시작합니다. 이 단계에서 나사를 조입니다,하지만 처음 몇 스레드가 활성화되도록 삽입하지 마십시오. 다른 나사 3 개에 대해이 과정을 반복합니다. 참고 :이 단계에서 위치를 조절 나사를 돕기 위해 티타늄 또는 다른 비 자화 집게를 사용하는 것이 유용하다. </li><li> 대신에 4 개의 나사, 나사가 단단히 (그림 2K)을 확보 할 때까지 각각의 작은 단위로 같은 양에 의해 교대로 나사를 조입니다. 상판이 과정에서 휘어 것이 특이 아닙니다. 나사 머리가 손상 될 수 있습니다 과도한 하락 압력 클램프을 제거 및 / 또는 척수 부상의 원인이되므로, 너무 많은 나사를 조이 않도록주의하십시오. </li><li> 척수 및 유리 창 사이의 공간을 채우기 위해 실리콘 엘라스토머를 사용한다. 이 미상 때문에경화시 아세트산을 생산하지 S, KwikSil 브랜드 엘라스토머 및 믹싱 팁을 사용합니다. 노출 된 척수에 실리콘의 자유 부분을 적용합니다. 믹싱 팁의 사전 척수 응용 프로그램에 기포가 포함 된 실리콘 없애주의하십시오. </li><li> 신속하게 작업을 조심스럽게 상판의 삽입에 5mm # 0 커버 슬립을 누릅니다. 점차적으로 척수를 둘러싸 액체 엘라스토머를 쥐어 짜기,하지만 척수 압축 (그림 2L)에 포함되지하기에 충분한 압력을 적용합니다. 엘라스토머 시간을 설정하면 너무 커버 슬립이 빠르게 적용되어 있는지 확인, 약 90 초입니다. </li><li> 5.5 - 실패한 밀봉의 경우, 엘라스토머가 설정 될 때까지 부드럽게 집게로 임플란트에서 제거하고 5.4을 반복 기다립니다. </li><li> 치과 아크릴 / 시아 노 아크릴 레이트와 삼출 엘라스토머 에지를 덮고 척수의 표면 위에 어긋남 엘라스토머를 방지하기 위해 가능한 한 많이 둘러싸는 뼈에 부착. </li><li> 견인기를 제거하고 임플란트의 가장자리 주위에 피부를 당기십시오. 시아 노 아크릴 레이트를 사용하면, 임플란트 (도 2 M, N)의 가장자리에 부착 피부. </li><li> 삽입 # 0-80 - 1/4 &quot;상판의 날개 (그림 1C 2 O)에 나사를 설정합니다. </li><li> 치과 아크릴을 사용하여, 상부 판 (도 2P)의 나사 구멍에 틈을 밀봉. </li></ol> 6. 수술 후 케어 <ol><li> 큰 깨끗한 케이지에 마취 및 장소에서 동물을 제거합니다. 케이지는 챔버는 아무것도 걸리지 않습니다 충분히 큰지 확인 케이지에 걸쳐 정상 운동의 과정 동안 (예 : 물병 및 / 또는 식품의 V 모양의 딥 등). 주 : 표준 쥐 케이지가 이상적입니다. </li><li> 동물이 회복하면서 가열 된 표면에 케이지를 놓습니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 마우스를 반환하지 않습니다. </li><li> 동물 beha 확인통증이나 고통과 임플란트 무결성의 흔적이 2 시간의 수술 후 - 1 ~ vior. 참고 : 보통 상태에서, 동물이 이동에 적당한 동요와 ambulate 할 수 있어야한다. </li><li> 무게를 측정하고 동작을 모니터링, 처음 72 시간 동안 12 시간 - 동물마다 8 확인을 계속합니다. 동물이 밤 동안 활성 및 이동되어 있는지 확인합니다. 지상의 형태로 젖은 음식은 물이나 영양 젤, 우 펠렛과 혼합 차우, 마시는 물은 바닥 수준에서 제공되어야한다. 피하 또는 intraperiotoneal 주사에 의한 추가 수화 필요에 따라 제공되어야한다. </li><li> 수술 후, 24 및 48 시간의 시점에서 5 ㎎ / ㎏ 마우스 케토 프로 펜과 0.2 ㎎ / ㎏ 마우스 덱사메타손 피하 관리합니다. 또한, 0.005-0.010 ㎎ / 100g 마우스는 72 시간 동안 피하 주사로 매일 8 시간을 투여해야한다. </li></ol> 7. 생체 이미징 <ol><li> 아래 마우스를 마취호흡 속도까지 유도 챔버에서 5 % 이소 플루 란 / 산소 약 1 호흡 / 초의 감속. </li><li> 피드백 제어 가열 패드 사용자 정의 stereotax (그림 1D)에 마우스를 전송하고 직장 온도계를 삽입합니다. 2 %에 이소 플루 란을 줄일 수 있습니다. </li><li> 사지 당 주입 부피의 약 50 %를 제공, 30 G 바늘과 3/10 CC 주사기 - (29)를 사용하여 뒷다리에 글리코 0.05 ㎎ / 100g 마우스 근육을 관리합니다. </li><li> 피하 식염수 1 ㎖ / (수분 공급) 100g 마우스 5 % 포도당 한 번 시간 당을 관리합니다. </li><li> 수술 (그림 1 층)에 사용되는 포스트 홀더에 나사 챔버 홀더를 삽입합니다. 높이를 조정하고 상판에 고정 나사 위에 게시물을 비틀. </li><li> 두 홀더 부착으로 가슴 자유롭게 영감에 따라 확장 할 수있을 때까지, 포스트 홀더의 홀더를 상승. 참고 : 소유자의 회사 부착하고 가슴 significan의 자유로운 확장 모두TLY 호흡에 의한 움직임 아티팩트를 줄일 수 있습니다. </li><li> 원하는대로 이미지를 수행합니다. </li><li> 이미지가 완료되면, 저급 게시물, 챔버 홀더 비틀어 복구 가​​열 된 표면에 직장 온도계 및 도시 마우스를 제거한다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 마우스를 반환하지 않습니다. </li></ol>

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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites.">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+imaging+reveals+distinct+inflammatory+activity+of+CNS+microglia+versus+PNS+macrophages+in+a+mouse+model+for+ALS.">In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS.</a> Plos One. 6 (3), 17910 (2011).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nature Communications. 3, 1227 (2012).</li><li>Dibaj, P., Steffens, H., Zsch&#252;ntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+rapid+morphological+reactions+of+astrocytes+towards+focal+lesions+in+an+ALS+mouse+model.">In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model.</a> Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).</li><li>Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+a+phase-specific+role+of+STAT3+during+central+and+peripheral+nervous+system+axon+regeneration.">In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+the+Mouse+Spinal+Cord+Using+Two-photon+Microscopy.">In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy.</a> J. Vis. Exp. 59, 2760 (2012).</li><li>Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber.">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows.">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model.">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081 (2013).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis.">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826 (2013).</li><li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular,+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes.">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li></ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

여기에 입증 기술은 반복, 시간 경과를 허용, 몇 주에 밖으로 지느러미 마우스 SC의 생체 내 이미징은 이후 수술 절차가 필요없이 작동 가능 게시합니다. 이 절차를 반복 수술 영상 검사를 통해 또는 휴대 역학에 대한 정보가 손실 portmortem 조직 학적 접근 방법을 통해 상당한 개선을 나타냅니다. 우리는 이전에 (30)는 생체 내에서 SCI 병리학을 공부하는이 기술의 가치를 증명하고있다. 영상의 최대 길이 범위는 SC의 등 표면 위에 고밀도의 섬유 조직의 성장에 의해 결정 하였다. 시간이 지남에 따라,이 성장은 이미지 콘트라스트와 해상도의 손실의 결과. 이러한 성장은 다른 수술 준비 (31)에서 볼 수있다. 일화, 우리는주의 깊게의 표면을 밀봉, 혈액 제품을 제거하기 위해 지느러미 SC 표면을 세척하여 이러한 성장이 최소화 될 수 있음을 발견했다시아 노 아크릴 레이트와 잘라 뼈, 실리콘 엘라스토머와 잘 챔버의 가장자리를 밀봉하고, 등쪽 SC과 커버 유리 사이의 격자 공간을 최소화한다. 최근 폴리 카르 보 네이트를 사용하여 챔버 자체와 유사한 또 다른 방법 (32)을 보여왔다. 우리의 스테인레스 스틸 부품의 경우가 X 선 및 음향 영상 방식과 호환 때문에 폴리 카보네이트의 사용은 유리하다. 그러나, 3 차원 프린터의 현재 유비쿼터스, 챔버 부품은 필요에 맞는 다양한 재료로부터 제조 될 수있다. 우리는 최근에 명확한 포토 폴리머 우리의 모든 부분을 인쇄했습니다. 밀폐 된 챔버의 한 가지 중요한 단점은 약물이나 SC 영상 (34)에 적합한 외생 염료의 반복 투여 량을 관리 할 수 없다는 것입니다. 그러나, 우리의 현재 시스템의 기계적 안정성을 활용하여, 우리는 이미 성공에 우리의 현재 챔버를 사용했다LY 심지어 밀폐 챔버 방식 (출판 서적)에서 여러 시점에서 약물 전달을 허용 피하 주입 주입구에 접속 막내 카테터를, 앵커. 또한, 인해 상판의 모듈 형 특성으로 이러한 준비의 미래 버전 치료제 및 형광 라벨 모두의 반복 응용 프로그램 수 있도록 다시 봉합 할 수있는 챔버를 포함 할 것이다. 이는 약물 전달 용 전극, 광학 삽입하고, 포트를 기록하기위한 설치대 가기 판을 구상 할 수있다. 이러한 추가 가능성 Fenrich 등. (31)의 더 멀 시스템을 사용하여 구현하기가 더 어려울 수있다. 결론적으로, 우리의 챔버는 다양한 실험의 기반이 될 수있는 게이트웨이 플랫폼을 제공합니다.

그대로 생물 생체 현미경 시간 경과는 면역 조직 화학 염색과 같은 기존의 단일 시점 분석에 액세스 할 수없는 복잡한 생물학적 과정의 직접 시각화 할 수 있습니다. 구체적으로, 다중 광자 현미경 (MPM) (1)는 2,3- 최대 4 1mm 초과 촬상이 달성 된 설치류 신피질로, 조직을 산란 이미징을 허용한다. 하나의 절차 개월 주 동안 뇌에 광 액세스 할 수 있습니다 5-7있는 수술 준비와 결합하면, 이러한 현미경 접근 방식이 건강하고 병에 걸린 상태 8-11 뇌의 동적 프로세스를 연구하는 데 사용되었다. 또한, 분석 프로토콜은 행동 동안에 셀룰러 - 해상도 이미징 기능을 허용 웨이크 (즉, 비 마취) 동물에서 생체 내 이미징 제공 12,13 개발되었다. 이러한 프로토콜은 comparis 사용되어왔다신경 활성 상관 (14)의 기능은, 마취 된 동물에서 깨어 15 시그널링 성상 세포는 칼슘, 작업 별 신경 클러스터 (16)의 식별 및 신경 세포의 능력은 휘스커 자극 17에 객체 위치를 판별한다. 질병기구 (18)와 같은 급성 축삭 변성의 식별 (AAD)를 허용 마우스 척수 (SC)에인가 된 건강 및 병리 기전, 생체 내 이미징 경과 해명이 접근법의 전위를 부여. 후속 연구는 후근 신경절 (DRG) 축삭 재생 (19), 축삭 재생 (20)에 혈관의 역할, 부상 (21)에 대응 아교 화성, 실험자가 면역 뇌척수염의 T - 세포 이동 (EAE) (22), 활동에 주변 병변의 효과를 조사 amyotroph에 대한 응답으로 미세 아교 세포의 23, 24 및 성상 세포 (25)IC 측삭 경화증 (ALS), SC 손상 (SCI) 26 후 축삭 발아에서 STAT-3의 역할 및 EAE 27 축삭 손실 및 복구 메커니즘. 이러한 방법의 성공에도 불구하고, 이러한 모든 연구 시점 액세스에게의 수를 제한하는 모든 촬상 시점에서 동물의 수술 개구 반복 필요한 다른 이에 단기 역학 연구를 제한 한 촬상 세션 중 하나에 한정하거나시켰다 혼동 및 실험적 인공물의 가능성을 증가시킨다. 이러한 수술에 대한 프로토콜은 이전에 28,29 발표되었다. 최근에, 우리는 반복 수술이 필요없이 여러 주 동안 마우스 SC에서 시간 경과 MPM 이미징을 활성화 만성 척추 챔버의 주입하는 기술 (30)을 발표했다. 간단히 말해서,이 수술 준비는 낮은 흉부 척추 후궁 절제술 및 네 부분으로 된 챔버의 주입을 수행 포함되어 있습니다. 챔버 포함후궁 절제술을 둘러싼 척추 및 유리 커버 슬립 위에 배치 SC 실리콘 엘라스토머를 클램프로 고정 세 맞춤 스테인리스 가공 부품. 이 기술은 반복 수술이 필요없이 건강하고 부상당한 상태에서 수술 후 이상 오주 밖으로 루틴 이미징 허용. 촬상 시점의 개수는 동물이 마취 유도를 허용 할 수있는 주파수로 제한되었다. 이미징 수명 SC의 표면 위에 고밀도의 섬유 조직의 성장에 의해 제한되었다. 또, 외과 용 임플란트가 운동 기능에는 장기적인 효과를 가지고 있다는 것을 확인. 당초 발행 된 이후에, 또한 SC 장기 이미징을 가능 대안 적 방법은 다른 장소 31-33 설명되었다. 이 프로토콜은 우리가 개발 한 척추 실을 주입에 대한 우리의 과정을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:68px;">Company</td>
			<td style="width:115px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:201px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">15000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">forceps, scissors, scalpel, etc.</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">multiple&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -magnetic fixator</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -retractor</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-09</td>
			<td>other retractors may also be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">retractor kit -elastomer</td>
			<td style="width:68px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:115px;">18200-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">feedback controlled heating blanket</td>
			<td style="width:68px;">CWE Inc.</td>
			<td style="width:115px;">Model: TC-1000 Mouse&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Part No. 08-13000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">stereotax</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">spinal chamber holders</td>
			<td style="width:68px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cyanoacrylate glue</td>
			<td style="width:68px;">Loctite</td>
			<td style="width:115px;">Loctite 495</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8101</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td>
			<td style="width:68px;">Teets</td>
			<td style="width:115px;">Mfg. Part: 8501</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Glycopyrrolate</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:68px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ketoprofen</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:68px;">MWI Veterinary Supply</td>
			<td style="width:115px;">MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Elastomer</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">KwikSil Mixing Tips</td>
			<td style="width:68px;">World Precision Inc.</td>
			<td style="width:115px;">KWIKMIX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

전술 한 절차에 따라, 수술의 각 단계는도 2에서 설명한 수술의 각 단계에 대한 결과를 모방한다. 특별한주의가 유리 아래 기포를 제거하는 실리콘 엘라스토머를 도포 할 때 수행되거나 적어도 이들이 있는지 확인해야 관심 영역 (도 2L)의 주변에 위치. 숙련 된 외과 의사의 경우, 수술 중 또는 최초의 24 시간 postsurgery 내에서 하나 안락사를 요구하는 수술 합병증에 작업의 약 20 %를 발생합니다. 이러한 합병증은 가장 자주 과도한 연조직 출혈 또는 안전하게 척추에 실을 부착 실패에 발생한다. 성공적으로 이식 실에서, 창은 일반적으로 여러 주 (그림 3)에 대한 광학적으로 투명 남아있다. 최선의 노력에도 불구하고, 불투명, 섬유, 종양 성장은 종종 부분 obscuri 결과, 몇 일 이내에 형성윈도우의 NG (그림 3C - F, 검은 점선). 형광 구조는 섬유 조직이 밑에 2PEF 현미경을 사용하여 참조하기 어렵다. 우리는 성공적으로 이식 윈도우의 약 50 %가 수술 후 5 개 이상의 주 동안 분명 남은, 결과의 바이 모달 분포를 발견하고, 약 50 %는 1에서 난독 화되는 것을 - 3 주. 2PEF 영상을 방해하지 않습니다 -보기 창의 경험 또는 경질 (F, 녹색 별표 그림 3D) 위의 신생 혈관 만 적당한 수준 내에서 분명, 대부분의 장소로 남아 창하십시오. 우리의 이전 연구 (30)는 두개 창 제제 5에서 본 것과 유사한 가벼운 염증을 나타내는 창에 인접 척추골의 밑에 미세 아교 세포의 증가하지만 성상 세포 밀도를 나타냈다. 후근 gangl의 서브 세트에 옐로우 형광 단백질 (YFP)를 발현하는 트랜스 제닉 마우스에서IA (DRG) 뉴런 (YFPH 라인; 잭슨 연구소), 축삭 명확 수술후 주간 구별되었다 (도 4A 및 B) 및 하나만큼 동물에서 몇 달 같이 (데이터는 미도시). 혈관 (도 4A 및 B)은 혈장에 표지 된 덱스 트란 레트로 공전 주입 텍사스 레드 형광에 의해 가시화 하였다. 미세 아교 세포는 CX3CR1 녹아웃 마우스에 GFP를 발현하는 생쥐에서 가시화되었다 (CX3CR1-GFP, 잭슨 연구소)가 YFPH 라인 (그림 4C)을 건넜다. 대비와 해상도로 인해 이전에 30 설명 섬유질과 성장의 형성에 시간 (그림 4C)을 통해 겸손하게 악화되었다. 우리는 일상적으로 매일 12 시간만큼 자주 사망하지 않고 단일 세션에서 3 시간 동안 몇 군데. 세션 지속 시간 및 주파수는 실험 동물에 통증과 고통을 수반하는 윤리적 고려 사항 마취 유도, 수반에 대한 동물의 허용 오차에 의해 제한된다. &lt;<html> 유지-together.within 페이지를 = &quot;항상&quot;&gt; : FO P 클래스 = &quot;jove_content&quot; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> 그림 1. 커스텀 수술실는 주입 중에 챔버 전달을 용이하게하고 후속 이미징 세션 동안 챔버를 안정화시킨다. 두 사이드 바 천판 (A)는 척추 챔버 (C)에 작은 나사를 사용하여 (B) 조립된다. 연장 포스트 (D)와 수술대 구금 핀을 사용하여 척추 (E)에 사이드 바의 클램핑 전달을 허용한다. 이후 영상 세션 대신 임플란트 (F)의 날개에 고정 나사를 통해 챔버에 연결하기 위해 내부적으로 스레드 게시물을 사용합니다. 이 그림의 패널 B는 자연 출판 그룹의 허가 파라 외., 자연 방법 2012 년 30에서 수정되었습니다.96 / 52196fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> 도 2는 등쪽 후궁 절제술이 수행되고 만성 촬상 챔버 척수 광학 접근을 제공하기 위해 주입된다. 몽타주 절차에 대하여 설명한다. 먼저, 피부 (패널 A는, B, 프로토콜 절 3.1-3.4) 및 근육 (C; 3.5) 세 하부 척추를 노출 시키도록 후퇴된다. 이들 세 개의 척추를 덮는 조직이 제거된다 (D, E, F, 3.6-3.10)가 양면 (; 3.12 G, H)에 고정되기 전에 처리 및 횡 깨끗 긁어. 조심스럽게 척추 중앙의 등쪽 라미 제거하고, 뼈의 가장자리 (I 봉인 </strong&gt;; 4. 6). 상판 (J; 5.1)를 적용하고 나사 위치 (K 5.3)에 고정 실리콘 엘라스토머 및 커버 유리 (; 5.5 L)와 챔버를 밀봉하기 전에 실을 확보. 전달 핀 (M; 5.8)가 제거 된 후, 피부는 챔버의 측면에 접착된다 (M, N 5.8) 및 세트 스크류는 날개 (O 5.9)에 삽입된다. (P, 5.10) 마지막으로, 나사 슬롯이 치과 아크릴로 밀봉된다. 마우스가 복구하는 깨끗한 케이지에 위치 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> 그림 3. 만성 척추 챔버는 광학적으로 투명 오븐을 유지여러 주 어. 몇 분 (A)에서 수술 후 삼주 (F)에 이르기까지 척수의 백색광 이미지. 혈관 랜드 마크는 모든 시점 (노란색 화살표)에서 식별 할 수 있습니다. 작은 변화는 하루 postsurgery (B)에서 볼 수있다. 조밀 한 섬유 자라 (C - 오른쪽 아래에 점선으로 경계 F는) 선물로 초기 세 가지로 일 이미징 영역의 부분 난처 결과입니다. 가벼운 혈관 신생 (D, E, F, 녹색 별표)도 존재하지만. 백색광 또는 2PEF 영상의 원본 혈관을 가리지 않는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 그림 만성 척추 챔버는 반복 수술이 필요없이 반복 다중 광자 이미징을 허용 4.. 척추의 등 funiculi에서 DRG 축삭 (녹색)의 부분 집합에 YFP을 표현 형질 전환 마우스를 반복 영상 코드 및 혈관 내 주입 염료 (A, B)에 의해 표지 된 혈관 (빨간색). 미세 아교 세포 (자주색)의 활동도 Thy1-YFP / CX3CR1-GFP 형질 전환 마우스 더블 (C)에서 시간 경과를 추적 할 수있다. 축삭과 미세 아교 세포가 계속 볼 수 있지만, 시간이 지남에 따라 적당한 콘트라스트와 해상도 감소 (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 척수의 영상

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

14.0K 조회수.  Cornell University.  이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다. 

비디오: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

연구

신경과학

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

쥐 자궁 경부 척수에 확산 이미징

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

에 비보 듀오 컬러 이미징 혈관 역학 Contusive 척수 상해를 따르는 방법

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

마우스에 있는 Laminectomy 및 척수 창 이식

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

리듬-액티브의 준비 체 외 신생아 설치류 Brainstem-척수와 얇은 슬라이스

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...