The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

The authors have nothing to disclose.

التفاعلات التصوير من أنواع مختلفة من الخلايا في مقصورات الأنسجة الأم أثناء تلت ذلك علم الأمراض في الوقت الحقيقي ولدت اهتماما كبيرا. ضمن شبكة كثيفة من الجهاز العصبي المركزي، خلية خلية الاتصال و الإنذار مع الخلايا المجاورة ضرورية لالوظيفة العادية ولفهم CNS علم الأمراض. هنا، وصفنا استخدام 2 الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر لمراقبة الحركة الخلوية داخل الآفة الميكانيكية في الحبل الشوكي. وبالإضافة إلى نوعية إعداد الجراحة والأنسجة، والاستقرار الميكانيكي للأنسجة أمر بالغ الأهمية لنجاح المجهري الوقت الفاصل، وخاصة عزل الحبل الشوكي من التنفس الحركة قطعة أثرية. يمكن تقييم الاستقرار من خلال البحث عن حركة الحبل الشوكي تحت المجهر تشريح الذي يتوافق مع معدل ضربات القلب أو التنفس من الحيوان. ينبغي تقييم الاستقرار على حد سواء أثناء أداء الجراحة وأيضا على الفور قبل البدء في التصوير. إذا كان أنيمال ليست مستقرة، وينبغي بذل تعديلات على التنسيب وضيق من المشابك الحبل الشوكي. وقد سمحت الخلية من نوع نماذج الفلورسنت معين مراسل الماوس إلى جانب النهج الوهم نخاع العظام تحديد خلايا الوحيدات مقابل الخلايا الدبقية الصغيرة ومحاور عصبية. وقد كشفت الدراسات السابقة أن الدم المستمدة حيدات الخلايا الدبقية الصغيرة وليس مسؤولة عن الأضرار محور عصبي بعد الصدمة الثانوية باستخدام المنهجية الموصوفة هنا 43. ديكستران مترافق صبغ السفينة يسمح للهوية السفينة على حد سواء لتوفير المعالم وتحديد المخالفات في سلامة السفينة. اختيار الفلورسنت نموذج مراسل الماوس المناسب أمر حاسم للسماح التحديد السليم من أنواع الخلايا المراد تصويرها. تطوير نماذج الماوس الفلورسنت التي تتناسب مع الدراسات التي يجري الاضطلاع بها أمر بالغ الأهمية لنجاح التجارب أيضا. التمييز بين اثنين من السكان أكلة من CX3CR1 + / GFP </sup&gt; الخلايا في الجهاز العصبي المركزي تقليديا صعبا. كما هو موضح هنا، وهي تقنية المناعية المشتركة، الوهم التشعيع، ويمكن أن تستخدم للتمييز مقاومة للراديو، الخلايا الدبقية الصغيرة CNS المقيمين من البلاعم المشتقة من نخاع العظام. إجراء أشعة لديه القدرة على إلحاق الضرر حاجز الدم في الدماغ وتغيير الظواهر الخلية، لذلك ينبغي النظر في استخدام هذا النموذج بعناية. مدى هذه التغييرات يختلف مع جرعة التشعيع وكذلك مدة فترة النقاهة، وتأثيرها على نماذج التهابات مختلفة لم يتم دراستها بشكل كامل. آثار الإشعاع على الجهاز العصبي المركزي حاجز الدم في الدماغ يمكن التقليل من يحمي الرأس أثناء التشعيع، ولقد ثبت هذا لتقليل تسلل خلية في الحبل الشوكي بعد التشعيع، حتى لو كان الحبل الشوكي لا محمية مباشرة 52. هنا لاحظنا أن عدد الخلايا التسلل الى الجهاز العصبي المركزي في حالة مستقرة نتيجة لجيل الوهم غير ذات أهمية على النقيض من خدرإيه الخلايا دخول الآفة. وتشمل نماذج بديلة أخرى للنظر في الوهم المخدرات التي يسببها 52 أو نماذج الماوس التعايش الالتصاقي 53. هنا، قدمنا ​​نموذجا إصابة صغيرة محددة وبسيطة وقابلة للتكرار في ذلك من آفة إلى المادة البيضاء الظهري للحبل الشوكي أن من السهل أن الصورة باستخدام المجهر 2 الفوتون. يوفر هذا الأسلوب أيضا آفة قابلة للقياس الكمي لفحص درجة السقم محور عصبي في الأعمدة الظهرية أنه في الأدب وقد يقترن مكملة الأنسجة الثابتة تحليل 16،18،43،48،54. في هذا النموذج، عرض الحيوانات فقط الحد الأدنى من العجز ولا تحتاج إلى رعاية خاصة بعد الاصابة. الدراسات المستقبلية باستخدام تقنيات إصابة العمود سحق والتصوير الظهرية الموصوفة هنا قد تكون أدوات الفحص قوية لتقييم فعالية العلاج لإصابة الحبل الشوكي. ويمكن أن تشمل هذه العلاجات مثبطات جزيء صغير، والمخدرات، ومنتجات الخلية، وترقيع الأنسجة والعلاج اندماجيالصورة. التفاعل بين الضامة، الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية ومن المرجح أيضا أن تلعب دورا في نماذج المرض أخرى في الحبل الشوكي، بما في ذلك التصلب المتعدد، والأورام والتهاب السحايا والتصلب الجانبي الضموري، وربما يكون هذا الأسلوب مفيدا في دراسة هذه الأمراض وكذلك .

ومن المفهوم رد فعل التهابي للمرض أو إصابة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) سيئة، وخاصة فيما يتعلق التفاعلات بين الخلايا المناعية والمقيمين داخل الأنسجة. التحقيقات في هذه التفاعلات الخلوية في الحبل الشوكي هي ذات أهمية خاصة في حيوان حي. وفقط يمكن الوصول إليه بسهولة CNS الأبيض مسألة المسالك في الأعمدة الظهرية للنخاع الشوكي، مما يجعل هذه المنطقة الهامة التي لتركيز الجهود على تحسين المنهج التجريبي ممكنا. وكانت هذه التحقيقات محدود بسبب صعوبة التقنية في الوصول وتحقيق الاستقرار في الجهاز العصبي المركزي للتصوير. وقد وصفت التصوير ناري في الحبل الشوكي حركة الخلوية سابقا 1-13، ومع ذلك، فقد تناول عدد قليل من الدراسات في إصابة الحبل الشوكي وراء بضع ساعات بعد إهانة الأولية. الآفة الحبل الشوكي المؤلمة هي بيئة معقدة، مع الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، الخلايا الليفية، الخلايا الاصلية NG2، والخلايا المناعية includiنانوغرام الخلايا الدبقية الصغيرة، العدلات، الضامة، والخلايا T، خلايا B والخلايا الجذعية 14،15. الضامة هي مجموعة فرعية من الخلايا المناعية المسؤولة عن البلعمة في الآفة، التسلل من التداول. وقد تم مناقشة دور هذه الخلايا البلعمية، مع تقارير تشير إلى أن هذه الخلايا يمكن أن تتخذ على كل من الأدوار الضارة واقية في الأنسجة المصابة. وتتراوح هذه الأدوار من زيادة السقم المحاور الثانوية بعد إصابة والتصرف بطريقة أكلة 16-22، ليأخذ على التئام الجروح النمط الظاهري وخفض عجز وظيفي في الحيوان المصاب 21،23،24. في السابق، ومحاولات لتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة الضامة من اعتمدت في المقام الأول على التشكل في الأنسجة السليمة. ومع ذلك، الخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها والضامة تعبر عن العديد من نفس علامات وعرض مورفولوجيا تمييزه بعد إصابة 25-29، مما يجعل الفصل بين الأنشطة المختلفة من هذه الخلايا صعبة لدراسة بسإد على هذه العوامل وحدها 30. هذه الخلايا يمكن فصلها عن طريق التعبير التفاضلية من CD45 باستخدام التدفق الخلوي 33،34، على الرغم من أن هذا النهج هو أقل فائدة في تمييز أنواع الخلايا هذه في الجسم الحي. كما تم استكشاف استخدام التعبير التفاضلية من CCR2 وCX3CR1 في الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة، على الرغم من التغيرات الدينامية في التعبير عن هذه العلامات كما حيدات تفرق في الضامة يمكن تعقيد تحليل دقيق 35،36. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمين في الجهاز العصبي المركزي وتنشأ من الأسلاف الكيس المحي أثناء التطور الجنيني، في حين مستمدة من الأسلاف الضامة نخاع العظم وأدخل CNS المصاب بعد إهانة 31،32. نهج بديل لاستخدام التشكل التمييز بين هذه أنواع الخلايا اثنين هو استبدال نخاع العظام مع الأسلاف من حيوان المانحة تعبر عن علامة يمكن تتبعها في الضامة المستمدة من الأسلاف المانحة، مع الحفاظ على المقيمين CNS، رجب-ient المستمدة الخلايا الدبقية الصغيرة. وتستخدم هذه النماذج خيالية نخاع العظام شائع في العديد من التطبيقات الأخرى 37-40. هذا الأسلوب له المحاذير الفريدة المرتبطة الأضرار التي لحقت سلامة حاجز الدم في الدماغ الناجم عن أشعة أو السامة للخلايا الأدوية المستخدمة للقضاء على الأسلاف نخاع في البلد المضيف، مما يحد من استخدامها في تطبيقات معينة. في الآونة الأخيرة، الفروق الوظيفية بين الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في الجهاز العصبي المركزي هي بداية لتمييزها باستخدام التدفق الخلوي، وتحليل مجموعة رقاقة الجينات وطرق الخيمرية 24،26،41-44، والتي سوف تكون مفيدة جدا في المستقبل. على الرغم من أن فصل هذه الأنواع الخلية اثنين لا يزال صعبا، فهم وظائف فريدة من نوعها المهم في المؤدية إلى علاجات أكثر استهدافا من الاضطرابات التي تنطوي على كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة داخل الجهاز العصبي المركزي. وصف التفاعلات الخلوية داخل الآفة الحبل الشوكي قد حان في المقام الأول من دراسات شملت نماذج ثقافة الخلية. هذا هو درق إلى التحديات المرتبطة التصوير كل من آفة في الحبل الشوكي والخلايا المناعية معا في الحيوانات الحية. وتشمل نماذج القوارض الحالية للإصابة الحبل الشوكي من نوع وشدة متفاوتة نماذج كدمة 45،46، إصابات وخز دبوس 2، تهتك 47، والظهرية إصابة العمود سحق الموصوفة هنا 16،18،48. التهاب السحايا في يزيد مع شدة الإصابة ويطرح تحديات فريدة من نوعها لزرع النوافذ أو العمليات الجراحية للتصوير المسلسل. بعض هذه التحديات تشمل تسلل الخلايا البلعمية، وكذلك توليد الأنسجة الليفية عبر موقع الجراحية. بعض هذه القضايا يمكن التغلب عليها من خلال خلق الآفات الصغيرة والتي تغطي النخاع الشوكي يتعرض مع الملابس الجراحية غير مناعة بين الجافية والعضلات paraspinous للسماح لجراحة إعادة فتح اللاحقة، كما هو الحال هنا لدراسة ظهري العمود إصابة سحق . القدرة على صورة فقط الجزء الظهري من زيادة ونقصانكما يحد الحبل آل اختيار الإصابة، منذ نماذج كدمة تسبب في المقام الأول الأضرار التي لحقت الحبل المركزي، وغالبا ما تشفق على الجزء الأكثر الظهري من الأعمدة الظهرية، وخصوصا في نقاط زمنية مبكرة بعد اصابة 45،49. لذلك، نحن تصف نموذجا إصابة بسيط هو أن تعطي، قابلة للتكرار، الآفة على شكل مستطيل نظيفة يمكن أن يكون مفيدا لكل من مراقبة حركة الخلية داخل الآفة والكمي سهل من موقف محور عصبي نسبة إلى الآفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="594">
	<tbody>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:125px;">Name</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:64px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:240px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">CX3CR1 GFP mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">5582</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Thy-1 YFP H mice</td>
			<td style="width:165px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:64px;">3782</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:125px;">Mouse pie cage</td>
			<td style="width:165px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:64px;">MPC 2 set</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">60mm2 petri dish</td>
			<td style="width:165px;">Corning</td>
			<td style="width:64px;">430166</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Falcon 40 um cell filter</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;">08-771-1</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:125px;">1x15mL and 1x50mL conical tube</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">16 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305177</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">1ml syringe</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">309628</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">A10492-01</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">HBSS</td>
			<td style="width:165px;">Gibco</td>
			<td style="width:64px;">1E+07</td>
			<td style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:125px;">RPMI media</td>
			<td rowspan="2" style="width:165px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;">R8758</td>
			<td rowspan="2" style="width:240px;">For bone marrow isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">F4/80 antibody</td>
			<td style="width:165px;">Ebioscience</td>
			<td style="width:64px;">12-4801 PE</td>
			<td style="width:240px;">For FACS verification of chimeras</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30-gauge insulin syringe&#160;</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">328280</td>
			<td style="width:240px;">For tail vein injection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Spinal Cord Clamps</td>
			<td style="width:165px;">Narshinge</td>
			<td style="width:64px;">STS-A</td>
			<td style="width:240px;">For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic powder&#160;</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1320</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td>
			<td style="width:165px;">Lang Dental</td>
			<td style="width:64px;">REF1404</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Gelfoam gelatin sponges</td>
			<td style="width:165px;">Pfizer</td>
			<td style="width:64px;">9E+06</td>
			<td style="width:240px;">For imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">4-0 Ethilon sutures</td>
			<td style="width:165px;">Ethilon</td>
			<td style="width:64px;">1667G</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Reflex Clips, 7mm</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS750344</td>
			<td style="width:240px;">For surgery. Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">14061-09</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">45/5 Forceps, Dumoxel</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11251-35</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Rongeurs</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">16021-14</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:165px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">305106</td>
			<td style="width:240px;">For making access holes in dura</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Forceps Dumont #4 Biology tips</td>
			<td style="width:165px;">Dumont</td>
			<td style="width:64px;">11242-40</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Needle Drivers</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12002-12</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Michel Wound Clip Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:64px;">INS700753</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Wound clip remover</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">12033-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">O-rings for Forceps</td>
			<td style="width:165px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:64px;">11200-00</td>
			<td style="width:240px;">For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Cordless Rechargable Animal trimmer</td>
			<td style="width:165px;">Wahl</td>
			<td style="width:64px;">Series 8900</td>
			<td style="width:240px;">for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Vetbond</td>
			<td style="width:165px;">3M</td>
			<td style="width:64px;">1469SB</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:125px;">Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td>
			<td style="width:165px;">Purdue Products L.P.</td>
			<td style="width:64px;">NDC 67618-150-08</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Nair Hair remover lotion</td>
			<td style="width:165px;">Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td style="width:64px;">NRSL-22329-05</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:125px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:165px;">Butler Schein</td>
			<td style="width:64px;">NDC 11695-6776-2</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Marcaine</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">6E+06</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">Bupernex</td>
			<td style="width:165px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:64px;">121-7793</td>
			<td style="width:240px;">Drugs &#8211; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="345" rowspan="6" style="height:345px;width:125px;">aCSF</td>
			<td rowspan="6" style="width:165px;">Chemicals from Sigma</td>
			<td style="width:64px;">119 mm NaCl</td>
			<td style="width:240px;">For surgery</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:64px;">26.2 mM NaHCO3</td>
			<td style="width:240px;">From Cold Spring Harbor Protocols</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:64px;">2.5 mM KCl</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:64px;">1 mM NaH2PO4</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:64px;">1.3 mM MgCl2</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:64px;">10 mM glucose&#160;</td>
			<td style="width:240px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:125px;">TRITC-dextran 150,000 MW</td>
			<td style="width:165px;">Sigma</td>
			<td style="width:64px;">T1287</td>
			<td style="width:240px;">For intravenous administration to label vasculature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

ويظهر رسم تخطيطي تصور ظهري العمود سحق الآفة في الشكل 1A. بعد الآفة، ويتم إعداد الحيوان واستقرت لintravital المجهري باستخدام المشابك الشوكي (الشكل 1B). صورة اتخاذها على الفور بعد الإصابة ظهري العمود سحق تظهر آفة مستطيلة واضحة للعيان مع ملقط طينة نقطة الإدراج التي يمكن تحديدها بشكل واضح. وقطعت محاور في مكان الاصابه عبر فترة من كامل العمود الظهري (الشكل 1C). سلامة الأوعية الدموية لا تزال سليمة، والكشف عن أي دليل على تسرب السفينة صبغ من قبل مضان. لإجراء التصوير التسلسلي للنفس الآفة على مدى الأسابيع، والعضلات والجلد يمكن خياطة على الثقب لاحقا إعادة التعرض. وينظر الآفة مماثل التشكل في نقاط زمنية لاحقة (أرقام 1D، E). بعد 5 أيام الإصابة، والمواقع ملقط الإدراج لا تزال مرئية ولكن بدأت الآفة إلى زيادة في حجم درق إلى إصابة الثانوية الناجمة عن الالتهاب. وقد تراجع عن محاور في نهاية الذيلية للآفة من موقع الأولي للإصابة من خلال عملية تسمى &quot;السقم محور عصبي&quot;. المحاور في نهاية منقاري الآفة أظهرت ولري مثل انحطاط (الشكل 1D، E). بين أيام 5 و 22 بعد الإصابة، قد استقر حجم الآفة. وفي الوقت نفسه، تدفق أعداد كبيرة من CX3CR1 + الخلايا يمكن أن ينظر إلى التسلل داخل وحول الآفة سحق خلال هذه النقاط الوقت، على الرغم من أن هوية هذه الخلايا (الخلايا الدبقية الصغيرة مقابل الضامة) لا يمكن تمييزها في إعداد كما هو مبين في الشكل (1). من أجل التمييز بين سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة داخل سحق الآفة المكروية، تم استخدام نموذج الوهم الإشعاع (الموضحة في الشكل 2A). أولا، يتم استبدال خلايا نخاع العظام من السلف CX3CR1 + / GFP الماوس مع سل غير الفلورسنت المانحةليرة سورية، وبالتالي GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة CNS المقيمة الوحيدة مرئية بواسطة التصوير الفلورسنت. ويمكن التأكد من كفاءة نخاع إعادة التدفق الخلوي فحص الدم المحيطي بعد 8 أسابيع زرع نخاع (الشكل 2B، C). في الشكل 2B، F4 / 80 الضامة وإيجابية GFP، سلط الضوء باللون الأزرق، يتم الكشف عنها في CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 الماوس خيالية، فيها بعض GFP حيدات إيجابية سلبية ولكن F4 / 80 موجودة أيضا. في الشكل 2C، لا F4 إيجابي مزدوج / 80 وخلايا إيجابية GFP وغادر بعد استبدال CX3CR1 + / GFP نخاع العظام المتلقي مع النوع البري نخاع العظام. قبل الإصابة، وتوزع بالتساوي الخلايا الدبقية الصغيرة داخل الحبل الشوكي، وعرض يستريح، مورفولوجيا متشعبة (الشكل 2D). بعد 8 أيام الإصابة، ويمكن الكشف سوى عدد قليل من الخلايا الدبقية الصغيرة في وحول الآفة. تعرض هذه الخلايا الدبقية الصغيرة في التشكل متموريات الحركة (الشكل 2E). الثاني، العظاميتم استبدال خلايا نخاع السلف في الماوس غير الفلورسنت من قبل خلايا نخاع من CX3CR1 + / GFP الماوس، ومن ثم يجعل نخاع العظم تستمد CX3CR1 + حيدات / الضامة وضوحا من قبل GFP مضان (الشكل 2A). قبل الإصابة، وGFP الوحيد + خلايا الكشف عن هم إلى حد كبير حول الأوعية، والتي تم الإبلاغ عن أن يكون نخاع العظام تستمد وتتحول باستمرار على على أساس منتظم 28 (الشكل 2F). بعد إصابة سحق، يمكن أن ينظر CX3CR1 خلايا + / GFP على طول داخل الأوعية الدموية المحيطة الآفة (الشكل 2H-J)، وملأت مركز الآفة مع تسلل الضامة CX3CR1 + / GFP (الشكل 2G). وقت التصوير مرور الأعمدة الظهرية يمكن أن يؤديها لمدة تصل إلى 6 ساعات. في الشكل 3، وتبين لنا من CX3CR1 غير خيالية + / GFP الماوس مباشرة بعد الإصابة التي الخلايا من التداول ويمكن رؤيةن تتحرك للخروج من الأوعية الدموية نحو جوهر الآفة وتتحرك داخل موقع الإصابة (الشكل 3A، B، التكميلي الفيلم 1). تحليل الصور باستخدام كثافة مضان لتحديد الخلايا يمكن تتبع مسارات التي اتخذتها الضامة (الشكل 3A، B، التكميلي الفيلم 1). وتظهر الاحصاءات المستمدة من تحليل التصوير متوسط ​​الحركة الضامة في الآفة هي 3.6 ميكرون / دقيقة (الشكل 3D). وأخيرا، في 22 أيام بعد الإصابة، محاور، الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة لا يزال من الممكن الكشف عن داخل الآفة مما يدل على مجال التصوير غير مستقرة على مدى فترات طويلة من الزمن (فيلم التكميلي 2). <img alt="الشكل (1)" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1: إنشاء والتصوير المتتابع للإصابة العمود الظهري سحق. (A) والظهريةيتم تنفيذ إصابة العمود سحق من خلال إزالة عملية الظهري للفقرة على مستوى الفائدة. يتم إدراج ملقط في العمود الظهري للحبل الشوكي 1 ملم، وبصرف النظر ثم يتم إغلاق 3 مرات لإنتاج الآفة هو مبين في الأرجواني. (B) ثم يتم وضع الحيوان مع الحبل الشوكي المشابك للحصول الاستقرار للتصوير حيوي داخلي. (C) مباشرة بعد الإصابة، ملقط المواقع الإدراج (بيضاوي أحمر) ومستطيلة حجم الإصابة سحق (مربع رمادي) يمكن تحديدها بشكل واضح. ويمكن رؤية محاور في الجذور الظهرية (السهام البيضاء)، وكذلك نهايات الجرحى من المحاور على الجانب الذيلية الآفة (رؤساء السهم شغل). (D) بعد 5 أيام الإصابة، ملقط المواقع الإدراج (بيضاوي أحمر )، ومدى الآفة (مربع رمادي) لا يزال من الممكن تصور بسهولة. وزاد الآفة في حجم منذ إهانة الأولية. محاور تمر ولري مثل التنكس يمكن رؤية منقاري إلى الآفة (رؤساء السهم مفتوح) في additiإلى محاور في الجذور الظهرية (السهام البيضاء) ونهايات محاور أصيب (السهام البيضاء). (E) بعد 22 يوما الإصابة، موقع الآفة لا يزال التعرف ذات أبعاد مشابهة للإصابة بعد 5 أيام. لاحظ عدد كبير من CX3CR1 + الخلايا في وحول موقع بجروح. الميزات وصفت هي نفسها كما في (D). جميع الحانات النطاق = 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل 2: بناء الفئران خيالية لتتبع CX3CR1 + / GFP معربا عن الخلايا الدبقية الصغيرة أو العظام الضامة CNS المقيمين المشتقة من نخاع في الآفة ظهري العمود سحق. (A) رسم تخطيطي لتوليد الفئران خيالية مع أي CX3CR1 + / GFP تعبر عن ميلcroglia أو الضامة. أولا، والمشع خاصتك-1 YFP H الفئران وأعيد نخاع العظام مع خلايا نخاع معزولة عن CX3CR1 + / GFP الماوس، مما أدى إلى الماوس خيالية الذي الضامة هي GFP +. ثانيا، المشع خاصتك-1 YFP الفئران H / CX3CR1 + / GFP وإعادة تشكيل نخاع العظام مع خلايا نخاع معزولة عن ماوس غير الفلورسنت، وإنتاج الماوس خيالية الذين الخلايا الدبقية الصغيرة هي GFP +. (ب) مثال من التدفق الخلوي البيانات مع الخلايا F4 / 80 + وCX3CR1 GFP + في الدم من حيوان خيالية مع CX3CR1 + / GFP نخاع المزروع المانحة إلى المشع C57BL / 6 المتلقي. وتظهر الخلايا المشتقة من المانحين إيجابية CX3CR1 التي هي ايجابية لكلا GFP وF4 / 80 في الزرقاء أبرز المنطقة. (C) مثال من التدفق الخلوي البيانات مع F4 / 80 + وCX3CR1 GFP + الخلايا في الحيوانات خيالية مع C57BL6 نخاع المانحة زرع إلى الأشعة تحت الحمراءالمشعة CX3CR1 + / GFP المتلقي. لاحظ عدم وجود مزدوج إيجابي CX3CR1 + / GFP وF4 / 80 الخلايا داخل الأزرق أبرز المنطقة. (D) ان اثنين من الفوتون قطة مجهرية حيوي داخلي على فأرة الحاسوب من نظام خيالية الأول، والتي تبين GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة مع التشكل متشعبة داخل الظهرية العمود (رأس السهم). ويتخلل هذه الخلايا بين المحاور (الأصفر) في جذر ظهري والعمود الظهري. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. (E) التصوير حيوي داخلي من نفس الماوس في (B) 8 أيام بعد إصابة العمود الظهري تكشف عن عدد قليل CX3CR1 + الخلايا الدبقية الصغيرة مع أجسام الخلايا الكبيرة ومتموريات الحركة على شكل التي تفتقر العمليات (رأس السهم). شريط النطاق = 100 ميكرومتر. (F) لقطة من الماوس من مخطط خيالية الثاني في (A)، والتي تبين GFP ضئيل + الضامة، ضمن لحمة الجهاز العصبي المركزي. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. (G) التصوير حيوي داخلي من نفس الماوس في (F) بعد 8 أيام إصابة العمود الظهري يكشف اللهالدو تدفق الضامة في وحول الآفة. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. (H) صورة التكبير أعلى من CX3CR1 + الدم الخلايا المشتقة في اتصال مع السفن في الحيوان لم يصب. شريط النطاق = 30 ميكرومتر. (I) وإعادة بناء خلايا CX3CR1 في اتصال مع السفينة، ينظر اليها من داخل السفينة. مقياس شريط = 30 ميكرون. (J) وإعادة بناء خلايا CX3CR1 في اتصال مع السفينة، ينظر إليها من خارج السفينة. شريط النطاق = 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> الشكل (3) :. بيانات تتبع خلية تمثيلية في CX3CR1 غير خيالية + / GFP الماوس مباشرة بعد العمود الظهري سحقالاصابة. (A) لقطة من CX3CR1 + الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة محاور تلف حول (الصفراء) من فيلم التكميلي 1 مباشرة بعد اصابة في العمود الظهري سحق. (B) مسارات (الرمادية) التي اتخذتها CX3CR1 + الخلايا في (A) خلال 110 دقيقة دورة التصوير حيوي داخلي. (C) وهناك وقت التمثيل مشفرة من المسارات في (B). يتم تلوين المسارات على أساس وقتهم داخل كله فيلم 110 دقيقة، كما هو مبين في شريط الوقت. (D) الرسم البياني من الحركة العامة للCX3CR1 + الخلايا. جميع الحانات النطاق هي 30 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الفيلم التكميلي 1: فيلم حيوي داخلي الممثل فورا بعد إصابة العمود الظهري سحق في متغايرة مزدوجة خاصتك-1 YFP / + <stرونغ&gt; / CX3CR1 GFP / + الماوس. تم إجراء التصوير الشوكي حيوي داخلي مباشرة بعد عمود إصابة سحق الظهرية على مستوى T11. وتظهر اللوحة اليمنى حركة CX3CR1 + الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة. وتظهر مسارات حركة الخلية من المسارات بيضاء على اللوحة اليمنى. يقع إصابة في الزاوية اليسرى العليا. ويمكن رؤية CX3CR1 + خلايا الانتقال إلى موقع الإصابة على طول هذه المسارات. وتظهر المحاور باللون الأصفر. = شريط نطاق 40 ميكرون. مجموع الوقت: 110 دقيقة. قراءة السرعة: 300X. الفيلم التكميلي 2: فيلم حيوي داخلي الممثل في 22 يوما بعد الآفة العمود الظهري سحق في متغايرة مزدوجة خاصتك-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + الماوس يظهر هنا هو الفيلم الممثلة المأخوذة في الماوس بعد 22 أيام من سحق العمود الظهري الأولي إصابة في T11 مستوى العمود الفقري. وينجيقع URY في الزاوية اليمنى العليا من الإطار. محاور (الصفراء) تصاعدي ترد rostrally في أسفل اليمين. وصفت الأوعية الوريد الظهري والدم مع TRITC-ديكستران (الحمراء). CX3CR1 + الخلايا داخل هذه الخطوة الآفة بسرعة أبطأ مقارنة بتلك مباشرة بعد الإصابة. = شريط نطاق 50 ميكرون. مجموع الوقت: 90 دقيقة. قراءة السرعة: 600X.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury at JoVE.com

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

التصوير حيوي داخلي من محور عصبي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في ماوس الظهرية الإصابات سحق العمود

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Views.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Video: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

مناعي لونين من الظهرية جذر الأنسجة العقد التالي من الإصابات محواري

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

استنساخه سحق الفأر العصب الوركي وتقييم لاحق للتجديد من قبل الجامعة جبل تحليل العضلات

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

الظهرية جذر حقن العقدة وظهري الجذر سحق إصابة نموذجا لالحسية أكسون التجديد

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.

التصوير الانتشار المتقدم في الحصين من الفئران مع إصابات الدماغ صدمة خفيفة

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large percentage of TBI patients requiring hospitalization. DAI involves widespread axonal damage from shaking, rotation or blast injury, leading to rapid axonal stretch injury and secondary axonal changes that are associated with a long-lasting impact on functional recovery. Historically, experimental models of DAI without focal injury have been difficult to design. Here we validate a simple, reproducible and reliable rodent model of DAI that causes widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

This protocol validates a reliable, easy-to-perform and reproducible rodent model of brain diffuse axonal injury (DAI) that induces widespread white matter damage without skull fractures or contusions.

تحريض من منتشر إصابة الدماغ أكسونال في الفئران على أساس تسارع التناوب

Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Diffuse axonal injury (DAI) is the predominant mechanism of injury in a large ...