وقد تورطت الأدلة الناشئة مساهمة الضامة جذر الظهرية الضامة في تطوير الألم العصبي وإصلاح محور عصبي في سياق إصابة الأعصاب. مرغوب في ظاهري بسرعة استجابة الضامة جذر الظهرية لتحديد العوامل العصبية غير معروف. هنا نُظهر كيف أن مختبرنا يعزل الضامة بسرعة وفعالية من جذر الظهرية ganglia باستخدام بروتوكول انفصال ميكانيكي خال من الإنزيم.
هذا البروتوكول هو أقل استهلاكا للوقت مقارنة مع بروتوكولات الأنزيمية القياسية، ولقد استخدمنا بشكل روتيني لدينا تحليل الخلايا تنشيط الفلوريس. قبل البدء في التجربة، إعداد حل العمل للتدرج المتوسط الكثافة من خلال خلط تسعة مجلدات من المتوسطة مع حجم واحد من الكالسيوم والمغنيسيوم خالية HBSS والحفاظ على الجليد. تأكد من أن الماوس هو تخدير كامل من عدم وجود استجابة لقرصة مخلب الخلفي.
تبدأ عن طريق وضع الماوس تخدير داخل غطاء محرك الدخان الكيميائية في موقف supine مع أربعة الكفوف المضمونة مع الشريط. استخدام ملقط لرفع الجلد تحت القفص الصدري. وبعد ذلك مع مقص الجراحية، وجعل شق صغير لفضح الكبد والحجاب الحاجز.
باستخدام نفس المقص، وقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري. ثم افتح التجويف الجنبي لفضح القلب النابض. المقبل مع مقص القزحية، وقطع بسرعة الملحق الأذيني الأيمن.
بمجرد ملاحظة النزيف ، أدخل إبرة 30 قياسًا في الطرف الخلفي للبطين الأيسر وحقن ببطء 10 ملليلترات من PBS 1X المبرد مسبقًا لبث الحيوان. لإجراء استئصال لامينك dorsal، ضع الماوس في وضعية التعرض. استخدام مشرط حجم 11 لجعل اثنين من الشقوق الجانبية العميقة الطولية بدءا من منطقة الصدر وصولا الى المنطقة sacral.
ثم إزالة الجلد تعريض طبقة العضلات الظهرية. ثم مع فريدمان بيرسون rongeur، وتقشر قبالة الأنسجة الضامة والعضلات حتى يتعرض عمليات العمود الفقري lumbosacral والعمليات العرضية الثنائية. أولاً، استخدم رونغور فريدمان بيرسون لفتح العمود الفقري الظهري بعناية، ثم التبديل بين رونغيور فريدمان بيرسون ومقص الربيع ناي لإزالة العظام الفقرية، مما يعرض الحبل الشوكي بأعصاب العمود الفقري السليمة المرفقة.
تشريح بعناية ipsilateral و contralateral ررج القطنية. وضعه في ملليلتر واحد من الكالسيوم البارد الجليد والمغنيسيوم خالية من 1X HBSS في التجانس الأنسجة دونسي. التجانس الأنسجة DRG في التجانس Dounce مع آفة فضفاضة لمدة 20 إلى 25 مرة.
ضع مصفاة خلايا نايلون معقمة سعة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم بـ 50 ملليلتر. استخدام 800 ميكرولترات من الجليد رمز HBSS 1X لبرلل مصفاة الخلية. استخدام ماصة لجمع تعليق الأنسجة المجانسة من التجانس على مصفاة الخلية الرطبة، وجمعه في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
شطف المهووس مرتين مع 800 ميكرولترات من الجليد البارد HBSS 1X، وجمع السائل في نفس أنبوب مخروطي 50 ملليلتر لزيادة العائد. إضافة 1.5 ملليلتر من الجليد الباردة الكثافة متساوي المدى التدرج المتوسطة في أنبوب قارورة البوليسترين خمسة ملليلتر العقيمة. نقل تجانس الخلية من أنبوب مخروطي 50 ملليلتر في هذا الأنبوب قارورة.
وماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا. إضافة 500 ميكرولترات إضافية من 1X HBSS لختم أعلى. الطرد المركزي الخلايا في 800 مرة G لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية.
الطامح بعناية عظمى تحتوي على الميلين في الوسط دون إزعاج بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على مصل الأبقار الجنينية 5٪ إلى بيليه، وإعادة تعليق الخلايا DRG. ثم إضافة ألفا ماوس CX3CR1 APC الأجسام المضادة للخلايا واحتضان في الظلام في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
غسل الخلايا مرة واحدة مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في 360 مرة G لمدة ثماني دقائق في أربع درجات مئوية. التعرق المابير ، ومن ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لتحليل الحقائق.
بعد الحقن داخل الصفتون من FK ملزمة بروتين ملطف AP في الفئران MaFIA لنضوب الضامة، كان هناك خسارة كبيرة من الخلايا الإيجابية GFP في DRGs من الفئران AP المعالجة مقارنة الفئران المعالجة مركبة تسيطر عليها. وكشف تحليل الحقائق عن استنفاد ناجح للسكان المرتفعين في فئران المعالجة بـ AP وأظهر الجودة العالية للخلايا المعزولة. 4٪ من مجموع الخلايا المعزولة من DRG من الحيوانات المعالجة مركبة كانت الضامة GFP عالية.
في المقابل فقط 0.4٪ من إجمالي خلايا DRG كانت الضامة GFP عالية في الماوس AP المعالجة. كانت خلايا DRG المعزولة ميكانيكيًا من الفئران من النوع البري ملطخة بالأجسام المضادة للماوس CX3CR1-APC. 6٪ من خلايا DRG كانت الضامة CX3CR1 إيجابية.
عندما تم تقييم صلاحية الخلية مع يوديد بروبدييوم، كشفت أن أكثر من 80٪ من خلايا DRG المعزولة حديثا كانت قابلة للحياة. إذا لوحظت غلة الخلية غير المرضية، قد يشتبه في التجانس غير الكافي أو المفرط للأنسجة DRG. بالإضافة إلى ذلك، قد يتطلب تشريح DRG ممارسة متكررة للمبتدئين.
من المحتمل أن يتم توسيع تطبيق بروتوكول لدينا لدراسة الخلايا الأخرى غير الخلايا العصبية مثل الخلايا الأقمار الصناعية والخلايا التائية. قد يكون من الضروري إجراء المزيد من الدراسات لتأكيد فعالية عزل الخلايا.
