نود أن نشكر اندريا تيديشي للمساعدة في تحديد التجارب الأولية الشذرة في المختبر ويندنر ريكو لمساهمته في تهذيب شروط الشذرة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة Hertie ؛ المنحة فورتشن ، جامعة توبنغن ، ومنح دي DFG 1497/1-1 (منح جميع لسيمون دي جيوفاني).

1. الوركي واصابة في العمود الظهري العصبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع الحيوان على منشفة الجراحية وتحت عليه thermopad موجود في جميع أنحاء الإجراء الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الماوس عند 37 درجة مئوية. جميع الحيوانات هي تخدير للجراحة مع إدارة مستمرة isoflurane 2 / الإخراج. يتم تعقيمها الأدوات الجراحية قبل الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإصابة الوركي ، وحلق كل من الخلف بعناية ، واكتمال إزالة الشعر مع مزيل الشعر عامة قبل تطهير الجلد بالكحول تليها 3 مرات Betadyne. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما يتعرض له العصب الوركي من خلال جعل شق 4 ملم والخلفي الموازي للعظم الفخذ في منتصف الفخذ خلال الجلد والعضلات من خلال نشر وبصرف النظر عن الفخذية ذات الرأسين مع ملقط الغرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العصب الوركي يتعرض المصاب بعد ذلك ، ويتم إغلاق الجلد مع مقاطع خياطة اثنين. </li></ol> ملاحظة : يتم إجراء شق نفسه لفضح العصب الوركي ، ولكن مغلقة خياطة الجرح ترك العصب سليما للضرر صورية. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاصابة في العمود الظهري ، وحلق ذقنه بعناية الجزء الخلفي من الماوس ، والانتهاء من إزالة الشعر مع مزيل الشعر عامة قبل تطهير الجلد مع رذاذ الكحول / ممغنطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتعرض الحبل الشوكي عن طريق شق 2.5 سم من حوالي T7 إلى T13. وتنتشر على الجلد على حدة ، ويتم إزالة النسيج الضام على طول فقرة من T9 إلى T11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ استئصال الصفيحه على مستوى T10 </li></ol> ملاحظة : بالنسبة لمعظم التجارب ، يعتبر استئصال الصفيحه الاصابة الشام. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضاف بضع قطرات من Xylocain للأنسجة الحبل لتخدير ، وإزالة جافية ، مع إيلاء اهتمام لا للمس الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصاب الأعمدة الظهرية وخياطة العضلات وثيق ، مع إيلاء الانتباه مرة أخرى على عدم لمس الحبل الشوكي. أخيرا ، يتم خياطة الجلد مغلقة مع مقاطع خياطة. وينبغي أن تدار البوبرينورفين (0.1 وزن الجسم ملغ / كلغ) مرتين يوميا لمدة 48 ساعة أو حتى لم تعد هناك حاجة. </li></ol> 2. عبر ربط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح DRG L4 L5 من الفئران والجرحى بعد euthanization. جمع ما مجموعه 16 DRG في الجليد الباردة HBSS مثبطات الأنزيم البروتيني + كوكتيل (2 و 2 DRG جرح الشام من كل حيوان لما مجموعه 4 الحيوانات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DRG الطرد المركزي لفترة وجيزة ، ثم إزالة بعناية HBSS وإضافة 500 ميكرولتر من الفورمالدهيد + 1 ٪ في برنامج تلفزيوني الكوكتيل ومثبطات الأنزيم البروتيني احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li></ol> خطوة حاسمة. استخدام الطازجة والبيولوجيا الجزيئية الصف الفورمالديهايد. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 125 ملم من جليكاين لوقف التثبيت واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ، نضح قبالة العازلة ، ويغسل النسيج مرتين مع 500 ميكرولتر الجليد الباردة + كوكتيل PBS مثبطات الأنزيم البروتيني. </li></ol> 3. إعداد نواة لونين والقص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة PBS ، إضافة 400 ميكرولتر من تحلل SDS العازلة ، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge قبل المبردة ، وتعطيل الأنسجة مع ما يقرب من 30 جلدة مع micropestle. </li></ol> خطوة حاسمة. انحلال واختلال النسيج حيوية لتحقيق عائد جيد من لونين crosslinked. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن العينة مع 8 البقول ، كل 10 ثانية في الانتاج بنسبة 70 ٪ (Bandelin ، Sonoplus GM70). </li></ol> تحذير ، ويجب أن يكون الأمثل والقص من لونين للصوتنة معينة إعداد ويجب أن يتم التحقق السليم للتجزئة لونين قبل تشغيل التجربة الفعلية للملكية الفكرية (انظر القسم 3). ويمكن أيضا ملاحظة. تجزؤ من لونين ستؤديها الهضم micrococcal (MNase) nuclease. وكقاعدة عامة ، يفضل تجزئة للأنسجة التي صوتنة الثابتة ، في حين يفضل الهضم MNase الأصلي للأنسجة مناعي لونين. عبر ربط ، ويمكن تخزينها لونين في المنفصمة -80 درجة مئوية لتصل إلى 2 أشهر ، ولكن تجنب تكرار تجميد / الذوبان دورات. 4. تحليل الهضم لونين (مستحسن) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكروليتر من عينتك لونين المنفصمة لتحليلها. إضافة 200 ملم من كلوريد الصوديوم في العينة وعكس عبر الارتباط يحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 2H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الحمض النووي (انظر القسم 8) وتشغيل agarose هلام 1 ٪. وينبغي أن تكون مجزأة الحمض النووي يصل طولها إلى حوالي 200-1000 سنة مضت (الشكل 1). </li></ol> قد تنبيه. الإفراط في تفتيت لونين يؤدي إلى انخفاض إشارة ، في حين أن تجزئة غير مكتملة سوف يؤدي إلى تقلص القرار وخلفية ازدياد. 5. مناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد من ردود الفعل مناعي (انظر الملاحظة أدناه) ، ويقسم بالتساوي في أنابيب عينات جديدة. جعل حجم كلما يصل إلى 500 ميكرولتر مع العازلة الشذرة مثبطات الأنزيم البروتيني + كوكتيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 5 ميكرولتر من عينتك المخفف ونقل في أنبوب جديد. هذا هو نموذج الإدخال 1 ٪ ، وسيتم تخزينها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها (المادة 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل مناعي ، إضافة الأجسام المضادة المناسبة أو العادي السيطرة على احتضان IgG و 4 درجات مئوية خلال الليل مع التناوب. </li></ol> ملاحظة. متى يجب تحديد عدد مناعي ، ومراقبة إيجابية (مثل الأجسام المضادة هيستون H3) والسيطرة السلبية (مفتش عادي) ينبغي النظر فيها. كمية من الأجسام المضادة المستخدمة لكل الملكية الفكرية يتفاوت بين الأضداد ، ويجب أن تحدد تجريبيا. ومع ذلك ، فإنه عادة ما يكون ضمن مجموعة من 2-10؟ ز / مناعي. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الضد الخاص immunoprecipitate / بروتين / الحمض النووي معقد ، إضافة 30 ميكرولتر من رقاقة الخرز الصف بروتين G المغناطيسي واحتضان لمدة 2 ساعة بمعدل 4 درجات مئوية مع التناوب. </li></ol> 6. غسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمنسدلة معقدة الكروماتين حبة محدد ، وضع على الرف الأنبوب المغناطيسي. انتظر حتى حل واضح وإزالة بعناية ثم طاف بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من يغسل الملح منخفضة (العازلة CHIP) إلى الخرز واحتضان عند 4 لمدة 3-5 دقائق مع دوران درجة مئوية ، ثم المنسدلة الخرز ونضح قبالة يغسل كما في الخطوة 6.1. كرر هذه الخطوة من أجل ما مجموعه 3 يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الملح العالية العازلة يغسل (العازلة CHIP + 350 مم كلوريد الصوديوم) إلى الخرز واحتضان لمدة 3-5 دقائق مع التناوب ، ثم المنسدلة الخرز ونضح قبالة يغسل كما في الخطوة 6.1. </li></ol> 7. شطف والتراجع عبر ربط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ عينات المدخلات الخاصة بك من -20 درجة مئوية ، إضافة 150 ميكرولتر من شطف العازلة الشذرة وتوضع جانبا في درجة حرارة الغرفة حتى الخطوة 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من 1X الشذرة العازلة شطف IP لكل عينة من الخطوة 6.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأنابيب في thermomixer وأزل لونين من الخرز التي يحتضنها العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع vortexing لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المنسدلة الخرز على الرف المغناطيسي ، ونقل بعناية لونين eluted (طاف) في أنابيب جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على جميع الأنابيب ، بما في ذلك نماذج الإدخال ، إضافة 200MM من كلوريد الصوديوم و 40 ميكروغرام / رد فعل K بروتين واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li></ol> ملاحظة يمكن تنفيذ الخطوة شطف في درجة حرارة الغرفة ، أيضا ، لكنها قد لا تكون فعالة قدر. 8. الحمض النووي الانتعاش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 حجم الكلوروفورم الفينول / لعينات من الخطوة الخاص 7.5 و دوامة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في السرعة القصوى في microcentrifuge في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة بعناية مائي (العلوي) في المرحلة أنابيب جديدة ، إضافة 1 حجم كلوروفورم إلى المرحلة المائية ، ودوامة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في السرعة القصوى في microcentrifuge في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية استعادة مائي (العلوي) مرحلة جديدة في أنابيب ، ثم تضاف 300mM من NaOAc ، 20 ميكروغرام / رد فعل من الجليكوجين ، و 2.5 حجم الجليد الباردة الإيثانول بنسبة 100 ٪. </li></ol> هناك حاجة إلى تنبيه ، وإضافة الناقل ، مثل الجليكوجين ، لتعزيز ترسيب الحمض النووي شظايا صغيرة نسبيا الحجم. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لترسيب الحمض النووي. </li></ol> ملاحظة يمكن أيضا أن يتم تنفيذ الخطوة هطول الأمطار ليلا -20 درجة مئوية. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينات في السرعة القصوى في microcentrifuge لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وطاف غسل الكريات DNA عجل مع 300 ميكرولتر من الجليد الباردة الايثانول 70 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينات في السرعة القصوى في microcentrifuge لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية أكبر قدر ممكن من طاف والسماح للالكريات الهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend في 20 ميكرولتر من العقيمة O. 2 H نماذج جاهزة الآن لPCR ، أو يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية. </li></ol> 9. ممثل النتائج ويرد ممثل نتيجة تجربة رقاقة في DRGs التالية الآفة الوركي (الشكلان 1 و 2). أولا ، نعرض الحمض النووي للتجزئة يبلغ طوله حوالي 200-1000 سنة مضت (الشكل 1). ثانيا ، نحن يبرهن على وجود إشارة PCR الشذرة التالية من المروج القريبة من بروتين النمو المصاحب - 43 (GAP - 43) فقط عند إصابة العصب الوركي (4 حارات ، الشكل 2 ، 5 &#39;). أي إشارة PCR موجود عند الحيوان يتلقى اصابة صورية فقط (حارة 3) ، وعند استخدام المصل العادي مفتش للملكية الفكرية (حارة 5 و 6). لاختبار لخصوصية من الأضداد ، قمنا بتحليل عينات من الحمض النووي نفسه ، ولكنها تستخدم مجموعة مراقبة التمهيدي الذي يكتشف في منطقة 3&#39; - UTR من الجينات لدينا مصلحة حيث لا يتوقع حدوث الإشغال. إشارات PCR غائبة عن جميع الممرات (ممرات 3-6 و الشكل 2 ، 3 &#39;) ، باستثناء إشارة الدخل ، تمثل عينات من الحمض النووي غير IP مثل PCR الضوابط القياسية (حارة 1-2 ، فيقوإعادة 2). يمكن تنفيذ هذا الإجراء الشذرة التالية إما اصابة في العمود الفقري الظهري أو الوركي ، الملخصة في التخطيطي (الشكل 3). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> هلام Agarose الرقم 1. الحمض النووي عبر ربط عكس التي تم المنفصمة التي صوتنة إلى النطاق المناسب للأطوال شظية. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. نصف الكمية من الأنسجة نتائج PCR DRG التالية آفة العصب الوركي تبين أن البروتين p53 الأسيتيل بربط GAP - 43 منطقة المروج القريبة بعد 48 ساعة من الإصابة في العصب الوركي. PCR السيطرة من المعرض DRG الأنسجة نفسها التي البروتين p53 الأسيتيل لا ربط المنطقة السيطرة على الحمض النووي الموجود في المنطقة ، غير مترجمة 3&#39; (UTR) من الجينات GAP 43 (S = الشام ، وأنا = جرحى). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. رسم تخطيطي عامة توضح موقع من المواقع المصابة على العصب الوركي ، والعمود الظهري.

<ol>
	<li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice.">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li><li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).</li><li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(&amp;mu;ChIP.">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&amp;mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li><li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Makwana, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration.">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li><li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+p53-CBP/p300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression,+axon+outgrowth,+and+regeneration.">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li><li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways.">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا البروتوكول يوفر طريقة مباشرة لنسأل عن البيئة خلال لونين محواري التجديد في الجهاز العصبي الكبار التالية محواري إصابة. اشتماله على نموذج إصابة DRG مع مناعي لونين للتحقيق في بيئة النسخي وجينية لاحقة للاصابة إما إلى الجهاز العصبي المحيطي أو الجهاز العصبي المركزي. ان?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> 10X الشذرة العازلة </td><td> خلية اشارة </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2X الاحتياطي الشذرة شطف </td><td> خلية اشارة </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> الشذرة الصف بروتين G الخرز المغناطيسي </td><td> خلية اشارة </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> ماجنا الرف قبضة (8 إضافة) </td><td> ميليبور </td><td> 2-40 </td></tr><tr><td> كلوروفورم </td><td> ميرك </td><td> الامم المتحدة 1888 </td></tr><tr><td> 37 ٪ فورمالدهايد </td><td> روث </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10X جليكاين الحل </td><td> خلية اشارة </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> الجليكوجين </td><td> سيغما </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> هيستون H3 الأضداد (الأرنب) </td><td> خلية اشارة </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> الأرنب العادي مفتش </td><td> خلية اشارة </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> الفينول / الكلوروفورم / كحول أيزو أميلي </td><td> روث </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> أقراص مثبطات الأنزيم البروتيني كوكتيل </td><td> روش </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> بروتين كاف (20 ملغ / مل) </td><td> خلية اشارة </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS تحلل العازلة </td><td> ريف </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> المعدات اللازمة </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury

المحاوير في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تجديد في حين أن أولئك في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) لا تتجدد على نطاق محدود بعد الاصابه (تنغ وآخرون ، 2006). فمن المسلم به أن يتم تنشيط البرامج الترانسكربتي ضرورية لنمو وneurite محواري عند الاصابة في الجهاز العصبي المحيطي (Makwana وآخرون ، 2005). إلا أن الأدوات المتاحة لتحليل الخلايا العصبية في الجسم الحي تنظيم الجينات محدودة وصعبة في كثير من الأحيان. في العقد الجذرية الظهرية (DRG) تقدم نموذجا ممتازا إصابة النظام لأن معصب كلا من الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي من محوار متشعبة مصدره سوما نفسه. والعقد يمثل مجموعة متميزة من الهيئات الخلية حيث تحدث عن الأحداث النسخي ، وبالتالي توفير منطقة محددة بوضوح من النشاط الترانسكربتي التي يمكن بسهولة وإزالته من بتكاثر الحيوانات. وينبغي أن إصابة الألياف العصبية في الجهاز العصبي المحيطي (مثل العصب الوركي) ، حيث تجدد المحاور لم يحدث ، تكشف عن وجود مجموعة من برامج النسخ التي تختلف عن تلك الاستجابة لاصابة مماثلة في الجهاز العصبي المركزي ، حيث التجديد لا يأخذ مكانه (الحبل الشوكي على سبيل المثال ). ويمكن وصف مواقع لعامل النسخ ملزمة ، وتعديل هيستون الحمض النووي الناجم عن إصابة الجهاز العصبي المركزي أو الجهاز العصبي المحيطي إما باستخدام لونين مناعي (رقاقة). هنا ، نحن تصف بروتوكول الشذرة الثابتة باستخدام الأنسجة DRG الماوس التالية محواري إصابة. هذا المزيج يوفر وسيلة قوية لتحديد خصائص بيئة لونين المؤيدة للتجديد اللازمة لتعزيز تجدد المحاور.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

نقدم طريقة للمناعي لونين من الجذر الظهراني الأنسجة العقد التالي محواري إصابة. ويمكن استخدام النهج لتحديد مواقع محددة ملزمة عامل النسخ والتعديل اللاجينية الهامة هيستون والحمض النووي للتجديد المحاوير بجروح في كل من الجهاز العصبي المحيطي والمركزي.

مناعي لونين من الظهرية جذر الأنسجة العقد التالي من الإصابات محواري

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K Views.  University of Tuebingen. نقدم طريقة للمناعي لونين من الجذر الظهراني الأنسجة العقد التالي محواري إصابة. ويمكن استخدام النهج لتحديد مواقع محددة ملزمة عامل النسخ والتعديل اللاجينية الهامة هيستون والحمض النووي للتجديد المحاوير بجروح في كل من الجهاز العصبي المحيطي والمركزي.

Video: Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

التصوير حيوي داخلي من محور عصبي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في ماوس الظهرية الإصابات سحق العمود

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

البثق الهيدروليكي من الحبل الشوكي وعزل الظهرية جذر العقد في القوارض

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

الظهرية جذر حقن العقدة وظهري الجذر سحق إصابة نموذجا لالحسية أكسون التجديد

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

عزل العقد الجذرية الظهرية والثقافة الأولية لدراسة الإفراج عن ناقل عصبي

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

تنقية الخلايا الليفية وخلايا شوان من الأعصاب الحسية والحركية في المختبر

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

إثراء مزارع الخلايا العصبية للعقد الجذرية الظهرية للفأر البالغ عن طريق التحفيز المناعي

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...