ونود أن نشكر ميكايلا يانسن في مركز جامعة تكساس للتكنولوجيا العلوم الصحية، لوبوك، تكساس، وملادن Yovchev في جامعة بيتسبرغ المركز الطبي، بيتسبرغ، PA لتوفير بسخاء pcDNA 3.1 MYC-صاحب (A) وhEF1α المروج التي تحتوي على البلازميدات . وأيد البحوث ورد في هذه النشرة من قبل كينيدي شرايفر المعهد الوطني يونيس لصحة الطفل والتنمية البشرية من المعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة عدد R01HD037109 (لCCM). كان دعم إضافي من معهد لورا بوش لصحة المرأة (لCCM وPNG). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

1. في السيليكون تصميم من البلازميد والجيل من الاشعال تداخل ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو تجميع كامل تسلسل النوكليوتيدات من بناء وتصميم الاشعال لاستخدامها لتوليد شظايا متداخلة مع نهايات لGA الاستنساخ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم تسلسل النوكليوتيدات المستمر لتمثيل البلازميد النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على أو سرد البلازميدات الفعلية وشظايا الحمض النووي التي سيتم استخدامها كقوالب في PCR. ويمكن أن يؤمر بمثابة شظايا واحد أو عدة الاصطناعية المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (sDNA) - شظايا الحمض النووي التي لا تتوفر بسهولة - مثل مجموعة مختلفة من العلامات والمروجين: ملاحظة. وهذه الشظايا المتاحة تجاريا بتكلفة منخفضة نسبيا، ويمكن أن تصل إلى 2 كيلو بايت في الطول (انظر جدول المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم تسلسل النوكليوتيدات المستمر لبناء تجميعها في الخطوة 1.1 إلى شظايا الحمض النووي مناسبة لPCR. Confirم أن شظايا تطابق البلازميدات المتاحة وشظايا sDNA. تجنب DNA أجزاء أصغر من 200 الإقليم الشمالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوصول إلى الجيل الأداة التمهيدي (انظر الجدول المعدات). حدد القائمة &quot;تعيين تفضيلات&quot;. اختيار الإعدادات المناسبة من خلال النقر على &quot;بادئات أختر&quot; في علامة التبويب &quot;تغيير إعدادات الجمعية جيبسون&quot; نافذة منبثقة. ملاحظة: يمكن أيضا تصميم التمهيدي أن يؤديها من دون استخدام الجيل الأداة التمهيدي. ومع ذلك، فإن استخدام الجيل الأداة التمهيدي يبسط العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البدء في بناء بناء عن طريق اختيار &quot;بناء تعبيد&quot; القائمة. إدراج شظايا الحمض النووي انقسام في التمهيدي بالتتابع الجيل أداة من 5 &#39;إلى نهاية 3&#39;. ملاحظة: جزء DNA تستخدم العمود الفقري البلازميد ويمكن تقسيم ملائم إلى قطعتين. في المنتج النهائي PCR ترتبط 5 &#39;نهاية هذا الجزء الأول و3&#39; نهاية الجزء الأخير معا في واحدة DN المستمروهناك جزء تمثل العمود الفقري النواقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصق جزء DNA الأول تمثل 5 &#39;نهاية DNA ناقلات في شكل FASTA (تمثيل يستند إلى نص من تسلسل النوكليوتيدات) في &quot;أدخل المتجهات أو إدراج مقطع&quot; نافذة منبثقة. تسمية جزء DNA. اختيار الطريقة المناسبة للحصول على جزء DNA، إما PCR، RE دايجست أو التجميعي. انقر فوق علامة التبويب &quot;متابعة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت هناك حاجة لإضافة النيوكليوتيدات إضافية / مواقع تقييد عند تقاطع للبناء النهائي استخدام مساحات &quot;FWD أو القس التمهيدي الفاصل&quot; المنصوص عليها في &quot;إضافة جزء الإدراج إلى التجمع&quot; النافذة. إضافة النيوكليوتيدات إضافية / مواقع تقييد واحد فقط من شظايا الحمض النووي وليس على كل من شظايا. انقر على &quot;تم&quot; علامة التبويب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكرر للجميع من شظايا حتى اكتمال بناء. حدد القائمة &quot;عرض الاشعال&quot; وإعادة النظر في تسلسل التمهيدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكرر للجميع يبني (ناقلات بackbones وإدراج)، أو للشظايا الحمض النووي التي تختلف. </li></ol> 2. التضخيم من شظايا الحمض النووي عن طريق PCR عن طريق حار البدء التدقيق DNA البلمرة (2X ميكس ماجستير) ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو الحصول على DNA كافية للتفاعل التجمع باستخدام PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء الاشعال PCR مصمم في الخطوة السابقة عن المنتجات المحلاة وعلى أصغر نطاق ممكن. تمييع لهم إلى 10 ميكرومتر في الماء أو TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.9، 1 ملم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء شظايا الحمض النووي التي لا تتوفر بسهولة كأجزاء sDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع كل شظايا الحمض النووي، بما في ذلك أجزاء sDNA التي سيتم استخدامها كقوالب للتقارير إنجاز المشروعات إلى 1 نانوغرام / ميكرولتر في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع ردود الفعل PCR في درجة حرارة الغرفة. لفترة وجيزة، واستخدام 2.5 ميكرولتر (من 10 ميكرومتر حل الأسهم) من كل التمهيدي الخاص بكل من الزوج التمهيدي (1)، ميكرولتر (من 1 نانوغرام / ميكرولتر حل الأسهم) من جزء DNA القالب، 25 μلتر من بداية ساخنة تصحيح التجارب المطبعية البلمرة DNA (الحمض النووي بول، 2X مزيج الرئيسي؛ انظر جدول المواد) و 19 ميكرولتر المياه. مزيج من أنبوب من قبل عبها لطيف وجمع قطرات سائلة بواسطة الطرد المركزي وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم في وقت واحد في أنابيب منفصلة شظايا الحمض النووي مشابهة من حيث الحجم وفقا لتوصيات لبول DNA. أداء 25-28 دورات PCR أو تحديد عدد الدورات التي تنتج غلة كافية DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل 10٪ من حجم رد الفعل PCR (5 ميكرولتر) على معيار الاغاروز الكهربائي هلام ملطخة إيثيديوم بروميد (0.2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي). تأكد من أن الفرقة DNA واحدة تمثل المنتج PCR مرئيا. تحديد حجم وكمية النسبي للشظايا الحمض النووي DNA باستخدام معايير الوزن الجزيئي. إذا لزم الأمر، كرر PCR للحصول على كمية كافية من شظايا الحمض النووي. </li></ol> 3. DpnI الهضم من المنتجات PCR ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو digeالحادي بلازميد المتبقية قالب DNA من تقارير إنجاز المشروعات في القسم 2. DpnI سوف هضم DNA البلازميد إلا إذا كان ميثليته، مثلما يحدث لالبلازميد الحمض النووي التي تزرع في سد + السلالات البكتيرية. ولذلك، لا تعامل مع DpnI إذا كان سيتم استخدام البلازميد الحمض النووي DNA كما شظية في رد فعل GA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من DpnI انزيم التقييد إلى 45 ميكرولتر من المنتجات PCR المنتجة في القسم 2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. المضي قدما في القسم 4 أو التجميد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. </li></ol> 4. تنقية وتركيز من شظايا الحمض النووي DNA على تنقية الخرز المغناطيسي ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو لتنقية وتركيز المنتجات PCR تم الحصول عليها في أقسام 2 و 3. طرق تنقية PCR أخرى يمكن أن تستخدم أيضا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن تنقية DNA حبات مغناطيسية إلى درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق الخرز من قبل vortexing وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تقارير إنجاز المشروعات واي قبل هضمهاال DpnI إلى 1.5 مل أنابيب وإضافة 81 ميكرولتر من تنقية DNA حبات مغناطيسية إلى كل أنبوب. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب على جامع المغناطيسي لحوالي 2 دقيقة. تجاهل واضح السائل باستخدام ماصة. غسل مرتين مع 200 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للالكريات لتجف. إبقاء غطاء من الأنابيب مفتوحة، مع أنابيب المتمركزة على جامع المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخرز المجففة في 10 ميكرولتر من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. تدور لفترة وجيزة لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب على جامع المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. إزالة 8،5 حتي 10 ميكرولتر من حل واضح ووضعه في أنبوب وصفت ما قبل الجديد. تحديد تركيز شظايا الحمض النووي عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول المعدات). </li></ol> 5. الجمعية الاستنساخ التفاعل والتحول من المنتجات في E. القولونية &lt;ص الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو لحساب 3: 1 نسبة إدراج: ناقلات وتنفيذ رد فعل التجمع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لا يقل عن 100 نانوغرام من جزء DNA التي تمثل العمود الفقري ناقلات أو جزء DNA تحمل علامة انتقائية. حساب الفائض المولي 3 أضعاف عن شظايا الحمض النووي التي سيتم استخدامها كما تدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل فائض المولي-NG في حاجة من كل إدراج معين. ملاحظة: هناك طريقة مريحة للقيام بهذه العمليات الحسابية هو استخدام التطبيق على شبكة الإنترنت (انظر الجدول المعدات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط كميات محسوبة من شظايا الحمض النووي في أنبوب PCR، وضبط مستوى الصوت إلى 10 ميكرولتر. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي GA (2X، انظر جدول المواد). احتضان رد الفعل عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لتجميع 4-6 شظايا أو 15 دقيقة لتجميع شظايا 2-3 في cycler الحرارية PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في التحول من المنتج التجميع في أكفاء E. القولونية أو تجميد المنتجات في -20° C، لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإجراء التحول الذي يصاحب الخلايا المختصة الكهربائية الكيميائية أو. عادة، استخدام 2 ميكرولتر من رد فعل التجمع في رد فعل التحول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التحول الكامل، ونشر الخلايا تحولت على لوحات أجار تستكمل مع المضادات الحيوية الانتقائية المناسبة. </li></ol> 6. البلازميد عزل، تقييد انزيم الهضم وتسلسلها ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو عزل DNA البلازميد من E. القولونية، ثم التحقق من بناء طريق الهضم التقييد والتسلسل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشر عدة مستعمرات واحدة لمحضرات صغيرة وبلازميد العزلة. بين عشية وضحاها LB ثقافة استخدام 2-5 مل السائلة تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة. عزل البلازميدات المقابلة باتباع الإجراء الموضح في عدة الإعدادية مصغرة الذي يتم استخدامه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كمية وتركيز البلازميدات تم الحصول عليها باستخدام الطيفمضواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تقييد الهضم مع واحد أو عدة نوكليازات الاقتطاع الداخلية إلى ~ 0.5 ميكروغرام من البلازميدات المنقى. استخدام أنزيمات التقييد التي توفر نمط متميز من الهضم مميزة ليبني DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد نجاح استنساخ الحمض النووي عن طريق تسلسل الحمض النووي باستخدام بادئات محددة أو القياسية. تحليل البيانات تسلسل للتأكد من دقتها. </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature methods. 7, 901-903 (2010).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+to+haemopoietic+stem+cells+by+recombinant+retroviruses.">Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses.</a> Molecular biology &amp; medicine. 4, 229-250 (1987).</li><li>Challita, P. M., Kohn, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+from+a+retroviral+vector+after+transduction+of+murine+hematopoietic+stem+cells+is+associated+with+methylation+in+vivo.">Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).</li><li>Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+incorporating+the+immunoglobulin+heavy+chain+enhancer+and+matrix+attachment+regions+provide+position-independent+expression+in+B+lymphocytes.">Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes.</a> Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).</li><li>Meilinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Np95+interacts+with+de+novo+DNA+methyltransferases,+Dnmt3a+and+Dnmt3b,+and+mediates+epigenetic+silencing+of+the+viral+CMV+promoter+in+embryonic+stem+cells.">Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells.</a> EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).</li><li>Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-level+stable+transgene+expressing+human+embryonic+stem+cell+lines+using+Chinese+hamster+elongation+factor-1+alpha+promoter+system.">Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system.</a> Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).</li><li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+different+promoter+systems+for+efficient+transgene+expression+in+mouse+embryonic+stem+cell+lines.">Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem cells. 20, 139-145 (2002).</li><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter.">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PloS one. 5, e10611 (2010).</li><li>Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+human+elongation+factor+1alpha+genes:+EEF1A+maps+to+chromosome+6q14+and+EEF1A2+to+20q13.3.">Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3.</a> Genomics. 36, 359-361 (1996).</li><li>Wallace, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+forms+of+the+64,000+Mr+protein+of+the+cleavage+stimulation+factor+are+expressed+in+mouse+male+germ+cells.">Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).</li><li>MacDonald, C. C., McMahon, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mechanisms+of+alternative+polyadenylation:+testis,+brain,+and+beyond.+Wiley+interdisciplinary+reviews.">Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews.</a> RNA. 1, 494-501 (2010).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> Rna. 19, 1726-1744 (2013).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+the+CPSF73+endonuclease+and+other+polyadenylation+factors+associates+with+U7+snRNP+and+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+for+3'-end+processing.">A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing.</a> Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).</li><li>Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Sequencing+of+RNA+Isolated+by+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+(HITS-CLIP)+to+Determine+Sites+of+Binding+of+CstF-64+on+Nascent+RNAs.">High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs.</a> Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).</li><li>Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CstF-64+supports+pluripotency+and+regulates+cell+cycle+progression+in+embryonic+stem+cells+through+histone+3'+end+processing.">CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing.</a> Nucleic acids research. , (2014).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS one. 3, e3647 (2008).</li><li>Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion(R)+cloning+with+vaccinia+virus+DNA+polymerase.">In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase.</a> Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).</li><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344, 55-58 (2014).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bacterial+cell+controlled+by+a+chemically+synthesized+genome.">Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome.</a> Science. 329, 52-56 (2010).</li></ol>

Open Access publication and production fees were supplied by New England BioLabs Inc.

الاستخدام الناجح للGA الاستنساخ ينبغي أن يسبق دائما إلى تصميم دقيق للبناء كاملة (الشكل 2 والشكل 3). ينصح التحقق دقيق لتسلسل التمهيدي التي صممها جيل الأداة التمهيدي أيضا إلى حد كبير. قد يتم إنشاء الاشعال لGA دون استخدام الجيل الأداة التمهيدي. ومع ذلك، استخدام الأداة هو التوصية للغاية، لأنه يبسط عملية. عموما، يجب أن يكون التمهيدي لGA استنساخ اثنين من سلاسل مختلفة وظيفيا. تسلسل الحمض النووي الأول هو تفتيت محددة، ويسمح للالتضخيم من شظية باستخدام PCR. تسلسل الثاني يتداخل مع جزء المجاور، وهو أمر ضروري لGA التجمع. ومن شأن تسلسل الحمض النووي جزء معين نموذجي يكون 18-22 الإقليم الشمالي في الطول. يجب تسلسل الحمض النووي جزء محددة تستخدم لتضخيم DNA نفسه يكون درجات الحرارة ذوبان مماثلة والمحتوى GC. وينبغي أن يكون تسلسل متداخلة على الأقل من 15الإقليم الشمالي في الطول مع درجة حرارة انصهار لا يقل عن 48 ° C. سوف تجميع أكثر من 4 شظايا الحمض النووي تتطلب تسلسل تداخل أن تكون على الأقل 20 الإقليم الشمالي. سوف التداخل أطول تسمح خصوصية زيادة من الصلب مما أدى إلى شظايا الحمض النووي تجميعها أكثر بشكل صحيح. فمن المستحسن لتجنب متواليات التي تميل في GC أو AT المحتوى في تطوير متواليات متداخلة، لأن تسلسل منحرفة قد بخرق التجمع DNA الصحيح. نقترح أيضا باستخدام كعنصر تحكم السلبية، التي لا ينبغي أن تنتج أي المستعمرات البكتيرية المقاومة للأدوية، مجرد جزء DNA الموافق العمود الفقري ناقلات في رد فعل GA. بدلا من ذلك، واحدة من شظايا الحمض النووي التي تضم &quot;إدراج&quot; قد حذفت من رد فعل GA، والتي ينبغي أن يؤدي أيضا إلى أي المستعمرات البكتيرية المقاومة للعقاقير. السبب لن تنمو المستعمرات سيكون عدم وجود نهايات متداخلة من شظايا الحمض النووي المجاورة، والتي سوف تجعل التجمع من مجمعات للبلازميد مؤسسة التدريب الأوروبية. في وصف البروتوكول، وتداخل متواليات من 25 الإقليم الشمالي لتوليد استخدمت مجموعات التمهيدي، نظرا لوجود عدد من شظايا الحمض النووي المستخدمة (الشكل 3). على توصية من أداة موقع الجيل التمهيدي (انظر الجدول المعدات) هو استخدام لا يقل عن 20 متواليات متداخلة الإقليم الشمالي لتجميع 4-6 شظايا الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يعد تداخل تسلسل وضمان تكامل السليم للحمض النووي (انظر الشكل 1) زيادة عدد المنتجات تجميعها بدقة. حاليا، تتوفر عدة نظم لاستنساخ سلس. ومع ذلك، فإن بعض هذه النظم لا تزال تستخدم أنزيمات التقييد (أي، جولدن جيت استنساخ 18). ويستخدم آخرون يمزج الملكية من الانزيمات بناء على فيروس اللقاحية البلمرة DNA واحدة حبلا الحمض النووي ملزمة البروتين من نفس المصدر البيولوجي 19. كلا النظامين تقتصر بالمقارنة مع GA قبل شورطول ثالثا تداخل متواليات. لأن تسلسل متداخلة أقصر قد لا توفر خصوصية كافية لالخطوة الصلب من شظايا الحمض النووي المجاورة، مما يجعل التجمع السليم لأكثر من 23 شظايا الحمض النووي إشكالية. هذه العيوب ليست موجودة في نظام GA. وينبغي النظر في حجم شظايا الحمض النووي ليتم تضخيمها أيضا حتى لا يتجاوز حجم amplifiable موثوق بواسطة PCR (أي أقل من 8 KBP في الطول). حتى مع تحسن في وظيفة بلمرة DNA في السنوات ال 10 الماضية، وسوف تتضخم شظايا الحمض النووي كبيرة مع أقل كفاءة ودقة. إذا لزم الأمر، يمكن الحصول على شظايا الحمض النووي أكبر من مصادر أخرى بديلة لPCR، على سبيل المثال، من خلال عزل البلازميد والهضم DNA المناسب مع الانزيمات قيود. على وجه التحديد، لبروتوكول موضح في مخطوطة الحالية، لدينا عقلانية لاستخدام PCR واستند على حجم شظايا الحمض النووي المتاحة، التي كانت كلها أقل من5 KBP. إذا كان هناك أكثر من منتج واحد PCR التي حددها الاغاروز الكهربائي للهلام، ويوصى هلام تنقية حجم جزء المرغوب فيه باستخدام أي من تقنيات البيولوجيا الجزيئية المتاحة أو مجموعات المناسبة. في البروتوكول الحالي يتم استخدام البلمرة DNA بالحرارة (انظر جدول المواد). لكن أي البلمرة DNA توفير الدقة العالية والعائد سوف تكون مناسبة ليتم استخدامها مع هذا البروتوكول. إذا عالية الدقة بلمرة DNA مختلفة من وصفها في البروتوكول متوفرة، استخدم إعداد الشروط كما هو موضح في كتيبات منها. في البروتوكول الحالي، E. المختصة كيميائيا وتستخدم خلايا القولونية التي يتم توفيرها مع عدة GA. بدلا من ذلك، الكهربائية المختصة كيميائيا أو E. سلالات القولونية مثل DH5α أو DH10B يمكن استخدامها. الجمعية استنساخ مزيج الرئيسي 2X سهل الاستخدام مع الحد الأدنى من التدريب العملي في الوقت المحدد. ومع ذلك، مطلوب pipetting لدقيقة بسبب كميات صغيرة شمال شرقeded إلى أن تكون مختلطة معا. تحتاج جيدة تقنية البيولوجيا الجزيئية إلى أن تمارس في كل الأوقات أيضا. استنساخ GA يوفر إمكانيات غير محدودة لبناء شظايا الحمض النووي، والبلازميدات وناقلات، والتي هي أطول من 3 KBP في الحجم. وبالإضافة إلى ذلك فإن لها تأثيرا أوسع في مجال البيولوجيا الاصطناعية، لأنه يسمح تركيب وتجميع، على سبيل المثال، البكتيري (الفطرانية الميكوبلازما) الجينوم بأكمله أو الخميرة (خميرة الخباز) كروموسوم 20،21. تقنية ينطبق أيضا على الاستنساخ التقليدية يحتاج لتوليد بنيات سلس. وفي الختام، GA الاستنساخ يوفر بديلا سريعا وموثوقة ومرنة لإجراء استنساخ الحمض النووي التقليدي.

تعتمد إجراءات استنساخ DNA التقليدية على استخدام الانزيمات تقييد ليلتصق الحمض النووي والحمض النووي يغاز للانضمام إلى شظايا الحمض النووي معا. جيل من بنيات التعبير مخصص يحتوي شظايا الحمض النووي مختلفة هو إجراء متسلسل يتضمن الانقسام من الحمض النووي مع واحد و / أو نوكليازات الاقتطاع الداخلية المتعددة والإدراج لاحق من شظايا الحمض النووي من خلال ربط. العيب الرئيسي من هذا الإجراء هو أن إنزيمات تقييد مناسبة لواحدة من شظايا الحمض النووي قد يكون من الصعب تحديد (أي، قد يكون لديك عدة مواقع الانقسام) تقديم استنساخ DNA الناجح للبروتين كامل طول الاهتمام مستحيلة. ولذلك، جيل التعبير العرف يبني تحت تنظيم النسخي من نوع محدد المروجين خلية فعالة مع تخصيص البروتين علامات يتطلب تصميم دقيق للغاية. وإنما هو أيضا تقنية الزمنية وتستغرق والعمل. في الآونة الأخيرة، وصفت عدة تقارير منهجيات لتجميع multipلو مختلفة شظايا الحمض النووي الاصطناعي في تسلسل مستمر في نفس الوقت في أي ردود فعل واحد أو خطوتين من دون استخدام تقييد الانزيمات 1-3. والاستنساخ رد فعل من خطوة واحدة (باستثناء جميع الخطوات التحضيرية)، ويعتمد على استخدام مزيج من نوكلياز خارجية DNA، البلمرة DNA، DNA يغاز 2،3 وينتهي متداخلة من شظايا الحمض النووي (الشكل 1). حيث لا يوجد استخدام الانزيمات التقييد، شظايا الحمض النووي من أي حجم وتكوين تسلسل (باستثناء تسلسلات متكررة جدا) يمكن أن تنصهر معا في بناء سلس. في الآونة الأخيرة، عدة التجارية (جيبسون التجمع؛ GA) أصبحت لردود الفعل استنساخ خطوة واحدة المتاحة. هذه المجموعة تسمح التجمع كفاءة السريع وتكلفة أي شظايا الحمض النووي في ناقل واحد مع المروجين مخصصة وعلامات البروتين. والمتاحة على نطاق واسع ناقلات التعبير البلازميد استعمالها للتعبير عن البروتينات الخارجية في الثدييات نماذج ثقافة الخلية غالبا ما تكون تحت ريج النسخيulation من الفيروس المضخم للخلايا الفيروسية (CMV) أو قردي فيروس 40 (SV40) المروجين. توفر هذه المروجين الفيروسي التعبير عابرة القوي للبروتينات الخارجية في معظم نماذج الثدييات القائمة على الثقافة الخلية. ومع ذلك، جيل من خطوط الخلايا معربا عن ستابلي البروتينات الخارجية غالبا ما يكون غير ناجحة بسبب إسكات النسخي من CMV أو المروجين SV40 خلال 4،5 عملية التأسيس. وبالإضافة إلى ذلك، فإن SV40 وCMV الفيروسي المروجين لا تشجع بما فيه الكفاية للتعبير عن البروتينات الخارجية في الخلايا اللمفاوية من النسب أو الخلايا الجذعية الجنينية 6،7. الحل لبقصور المروجين الفيروسي هو استخدام قوي التأسيسي المروجين غير الفيروسية 8-10. واحد يتميز جيدا المروج غير الفيروسية التأسيسي قوي المنشأ البشري هو عامل استطالة 1α (hEF1α) المروج (تشارك hEF1α في الحفز للجمعية التي تعتمد على GTP من أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال لريبوسوم 11). ومع ذلك،ناقلات التعبير التي تحتوي على مروج hEF1α ليست كما المتاحة على نطاق واسع للمروج الفيروسي تحتوي على البلازميدات، وخاصة تلك التي تحتوي على أيضا 3 × FLAG في نهاية محطة الأمينية من البروتين من الفائدة. وتشارك 64،000 ميغاواط بروتين عامل تحفيز الانقسام (CstF-64) في 3 &quot;معالجة نهاية معظم من mRNAs 12،13، بما في ذلك تعتمد على التكرار من mRNAs هيستون 14،15. وأعرب عن CstF-64 في جميع الأنسجة الجسمية 12. في عزر الاعتراف RNA بربط سلاسل RNA GU الغنية على محاضر الوليدة المصب للانشقاق وتذييل بعديد الأدينيلات الموقع 16. هذا الربط من CstF-64 إلى ما قبل مرنا يعزز الانقسام endonucleolytic كفاءة نص الناشئ. هنا، يتم وصف بروتوكول يستخدم PCR التضخيم من شظايا الحمض النووي، وهو جيبسون عدة التجمع الاستنساخ (والذي يتضمن الخلايا البكتيرية المختصة كيميائيا) لإنتاج ناقلات مخصصة ل3xFLAG الموسومة م[أوس] CstF-64 أو متحولة CstF-64 إلى الأمينية نهاية طرفية في ظل تعبير عن hEF1α المروج 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="553">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:196px;">Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA)</td>
			<td style="width:71px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">DNA purification magnetic beads</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Plasmid Isolation Mini Kit</td>
			<td style="width:71px;">Omega Bio-Tek Inc</td>
			<td style="width:119px;">D6942-01</td>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E5510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0494S</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">DpnI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NheI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NotI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">HindIII</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>NanoDrop device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">EditSeq</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">SeqBuilder</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Word</td>
			<td style="width:71px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of&#160; Microsoft Office</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBuilder</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>primer generation tool: http://nebuilder.neb.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBioCalculator</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of plasmid vectors expressing flag-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1&#945; promoter using gibson assembly

جيبسون التجمع (GA) الاستنساخ يوفر بديلا السريع، وموثوق بها، ومرنة لأساليب استنساخ DNA التقليدية. كنا GA لخلق البلازميدات مخصصة للتعبير عن الجينات الخارجية في الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs). التعبير عن الجينات الخارجية تحت سيطرة SV40 أو المروجين الفيروس المضخم للخلايا البشرية يقلل بسرعة بعد ترنسفكأيشن إلى mESCs. وهناك علاج لهذا التعبير تقلص هو استخدام البشري استطالة عامل 1 ألفا (hEF1α) المروج لدفع التعبير الجيني. ناقلات البلازميد التي تحتوي على hEF1α ليست كما المتاحة على نطاق واسع SV40- أو البلازميدات التي تحتوي على CMV، وخاصة تلك التي تحتوي على N-أيضا محطة 3xFLAG-العلامات. بروتوكول الموصوفة هنا هو طريقة سريعة لخلق البلازميدات معربا-FLAG الموسومة CstF-64 وCstF-64 متحولة تحت تنظيم التعبيري من المروج hEF1α. يستخدم GA مزيج من نوكلياز خارجية DNA، البلمرة DNA ويغاز DNA لجعل استنساخ تداخل نهايات شظايا الحمض النووي الممكنة.واستنادا إلى السلطات الوطنية المعينة قالب كان لدينا المتاحة، قمنا بتصميم يبني لدينا ليتم تجميعها في تسلسل واحد. تصميم لدينا تستخدم في أربعة أجزاء DNA: pcDNA 3.1 ناقلات العمود الفقري، hEF1α المروج جزء 1، hEF1α المروج جزء 2 (الذي يتضمن 3xFLAG العلامة شراؤها باعتبارها جزء DNA الاصطناعية المزدوج تقطعت بهم السبل)، وإما CstF-64 أو محدد CstF-64 متحولة. تم تحميلها متواليات من هذه الشظايا إلى جيل أداة التمهيدي لتصميم الاشعال PCR المناسبة لتوليد شظايا الحمض النووي. بعد PCR، كانت مختلطة مع شظايا الحمض النووي تم تجميعها متجه تحتوي على علامة انتقائية ورد فعل الاستنساخ GA. تم عزل البلازميدات من المستعمرات البكتيرية تحولت الفردية. وقد تم الشاشة الأولى من البلازميدات من تقييد الهضم، تليها التسلسل. في الختام، GA يسمح لنا لخلق البلازميدات مخصصة للتعبير الجينات في 5 أيام، بما في ذلك بناء شاشات والتحقق.

ويرد سير العمل من البروتوكول الذي تم المتبعة في الشكل 2A. أردنا أن استنساخ CstF-64 ومتحولة CstF-64 بروتينات تنصهر ل3xFLAG العلامة تحت تنظيم التعبيري من hEF1α المروج (الشكل 2B) والشكل (3). كان البلازميد التي تحتوي على hEF1α تليها 3xFLAG العلامة غير متوفرة بالنسبة لنا. ومع ذلك، كانت البلازميدات التالية متوفرة: pcDNA 3.1 MYC-صاحب (A؛ هدية سخية من ميكايلا يانسن)، hEF1α تحتوي على البلازميد (هدية سخية من ملادن Yovchev) والفأرة CstF-64 البلازميدات 12 (الشكل 3). تم تجميع تسلسل كامل لبناء (ق) باستخدام تطبيقات النوكليوتيدات وتحرير النص (الشكل 3؛ انظر الجدول المعدات). وفي وقت لاحق، تم تقسيم تسلسل (ق) في أربع قطع مريحة (الشكل 2B، وكتل حمراء والشكل 3) المقابلة لالسلطات الوطنية المعينة بلازميد المتاحة. التضخيم صوقد صممت rimers باستخدام الجيل التمهيدي أداة (انظر الجدول المعدات) مع قيود 4-6 شظايا مع الحد الأدنى من التداخل من 25 الإقليم الشمالي، التي أنشئت في &quot;تغيير إعدادات الجمعية جيبسون&quot; نافذة منبثقة. وأدرجت NheI وNOTI مواقع تقييد في تصميم التمهيدي لغرض تحديد البلازميدات تجميعها بشكل صحيح. يقع الموقع NheI في تسلسل التمهيدي بين pcDNA 3.1 و 5 &#39;نهاية المروج hEF1α. يقع الموقع NOTI بعد توقف كودون (UGA) من CstF-64 وpcDNA 3.1 ناقلات العمود الفقري. على الهضم في وقت واحد مع كل من الانزيمات جزء DNA تتكون من hEF1α المروج، 3xFLAG وCstF-64 أو متحولة CstF-64 سيتم الافراج عنهم (انظر أدناه والشكل 2B). وقد أمر الاشعال في أصغر نطاق ممكن والمحلاة. الجزء الثاني من المروج hEF1α تحتوي على 3xFLAG العلامة DNA جزء (490 سنة مضت، الشكل 2B، الشكل 3) تم شراؤها باعتباره sDNA جزء واحد (قه ه جدول المواد). وتضخمت شظايا الحمض النووي المستخدمة في رد فعل التجمع باستخدام بول الحمض النووي (انظر الجدول من المواد). وتضخمت شظايا الحمض النووي من hEF1α المروج جزء 1، جزء 2 hEF1α المروج، كامل طول ومتحولة CstF-64 في وقت واحد في أنابيب منفصلة لمدة 28 دورات (الشكل 4A)، بناء على توصيات من المورد للبول DNA (انظر جدول المواد ، لكل تمسخ دورة كان 7 ثانية في 98 ° C، الصلب و 45 ثانية في 55 درجة مئوية، واستطالة 90 ثانية في 72 ° C). في البداية، تم تضخيمه العمود الفقري pcDNA 3.1 لمدة 22 دورات (باستخدام نفس الشروط المذكورة أعلاه باستثناء الوقت استطالة، والتي كان من المقرر ان 3 دقائق عند 72 ° C). ومع ذلك، كان العائد DNA الناتجة لا يكفي لاستخدامها في رد فعل التجمع (الشكل 4A). ولذلك، تم إجراء تضخيم إضافي للحصول على DNA كافية. المنتجات PCR الحصول علىيجب أن يتم هضمها إد من قالب البلازميد مع DpnI انزيم التقييد لإزالة DNA البلازميد، والتي لولاها تلوث الناجم المنتجات رد فعل التجمع وسوف تنتج المستعمرات إيجابية كاذبة المقاوم للأدوية البكتيرية. ولذلك، تم هضم منتجات PCR مع DpnI تقييد الانزيم، الذي يشق DNA البلازميد مميثل ونصفي ميثليته عزل من سد + E. سلالات القولونية. المنتجات PCR تم الحصول عليها باستخدام شظايا الحمض النووي الاصطناعية، كقوالب لا تحتاج إلى أن يتفاعل مع DpnI منذ DNA تصنيعه كيميائيا لا تحتوي على قواعد مميثل أو نصفي ميثليته. وتنقيته شظايا الحمض النووي وتتركز على تنقية DNA حبات مغناطيسية (انظر جدول المواد) كما هو موضح في الخطوة بروتوكول 4. تم الجمع بين تقارير إتمام المشروعات لpcDNA 3.1 ناقلات العمود الفقري معا وتم تعديل مبلغ تنقية DNA حبات مغناطيسية تستخدم وفقا لذلك. تم تحديد العائد DNAباستخدام مقياس الطيف الضوئي (الجدول 1 والجدول المعدات). تم تجميع ردود الفعل التجمع من أجل CstF-64 ومتحولة CstF-64 يبني على الجليد (الجدول 1). تم استخدام فائض المولي 3 أضعاف من شظايا الحمض النووي تعتبر &quot;إدراج&quot; (الجدول 1، الشكل 3). تم تعديل الحجم النهائي من شظايا الحمض النووي مختلطة إلى 10 ميكرولتر مع الماء و10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي التجمع (2X) وأضيف. كانت مختلطة ردود الفعل وحضنت عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تم تجميع رد فعل السيطرة إيجابي أيضا وفقا لتوصية دليل عدة GA وحضنت في وقت واحد مع CstF-64 ومتحولة CstF-64 ردود الفعل. على النحو الموصى به في البروتوكول، تم تحويل 2 ميكرولتر من كل من ردود الفعل التجميع في E. المختصة كيميائيا زودت القولونية مع عدة التجمع الاستنساخ (انظر جدول المواد). وقد أجريت عملية التحول من كما هو موضح في عدةدليل. تم اختيار الحيوانات المستنسخة إيجابية على الأمبيسلين أجار لوحات / LB. وقد تم اختيار 6 المستعمرات في كل رد فعل التجمع بشكل عشوائي ليتم نشرها. تم عزل البلازميد السلطات الوطنية المعينة باستخدام طقم مصغرة بلازميد العزلة (انظر جدول المواد). وفي سيليكون والهضم من يبني مع تقييد الانزيمات أدى NheI ونوتي في اثنين من شظايا بأحجام من 4،590 سنة مضت، 3،032 شركة بريتيش بتروليوم لCstF-64 و 4،590 سنة مضت، 2،711 بي بي لمتحولة CstF-64 (الشكل 2B) والشكل (4B). الهضم مع تقييد الانزيمات أدى HindIII ونوتي في ثلاثة أجزاء مع الأحجام التالية: 5،872 سنة مضت، 1005 سنة مضت، و745 سنة مضت (CstF-64) و5،872 سنة مضت، 1005 سنة مضت، و 424 سنة مضت (متحولة CstF-64، والشكل 2B الشكل 4C). في الواقع، والهضم من البلازميدات معزولة عرض أنماط مميزة المتوقع (الشكل 4B، C). لاحظ أن جزء DNA 424 شركة بريتيش بتروليوم التي تنتجها الهضم مع HindIII وNOTI من متحولة CstF-64اتسخت البلازميدات على الشكل 4C ضعيفة نظرا لصغر حجمها. تم إرسال 2 من 6 البلازميدات معزولة عن التسلسل. نحن التسلسل المروج hEF1α، وCstF-64 أو متحولة CstF-64 أجزاء من يبني للتحقق من عدم وجود الحذف، الإدراج أو بدائل. ونحن نوصي بشدة تسلسل يبني DNA الناتجة عن هذا أو أي بروتوكول PCR القائم. أظهر تسلسل أن واحدا من كل بلازميد التسلسل الوارد تسلسل المتوقع في منطقة hEF1α، 3xFLAG العلامة وCstF-64 أو متحولة CstF-64. كل من البلازميدات أخرى كان طفرة نقطة أدخلت خلال التضخيم من جزء DNA المقابل. التعبير عن البلازميد التي تحتوي على CstF-64 في الخلايا الجذعية الجنينية، أنتجت كمية وفيرة من البروتين خارجي مشابه لنوع البرية التعبير 17. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" width="450" /> الشكل 1. تمثيل تخطيطي لآلية الجمعية جيبسون. شظايا الحمض النووي مع التداخل نهايات تم تجميع isothermally في تسلسل مستمر واحد. تداخل ينتهي أولا ويمضغ الظهر بنسبة 5 &quot;نوكلياز خارجية، والتي هي الحرارة تدريجيا المعطل. وبالتالي، فإن شظايا الحمض النووي مع نهايات مختلفة متداخلة يصلب isothermally. سوف البلمرة DNA في ملء الفجوات ويغاز DNA بالحرارة ligates النكات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" width="650" /> الشكل 2. (A) مخطط انسيابي للبروتوكول وصفها لتجميع الاستنساخ. (ب) تمثيل البلازميد، PGA-CstF-64 تم إنشاؤها باستخدام GA عدة الأحمر - شظايا الحمض النووي المستخدمة في رد فعل التجمع: pcDNA3.1؛ hEF1α المروج جزء 1 (hEF1a - 1)؛ hEF1α المروج جزء 2 (hEF1a - 2) أمر باعتباره DNA الاصطناعية. الماوس CstF-64 (mCstF-64). الزرقاء - إطارات القراءة المفتوحة. البنفسجي - المروجين الفيروسية وغير الفيروسية. الخضراء - انشقاق وتذييل بعديد الأدينيلات المناطق <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" width="650" /> وتمثل الشكل 3. تصميم وتركيب جبسون CstF-64 البلازميد. الأسود صناديق شظايا الحمض النووي التي كانت متاحة لتصميم جيبسون التجمع واحد CstF-64 في تسلسل سيليكون. وفي وقت لاحق، تم تقسيم تسلسل في أربع قطع DNA، والتي تم تضخيمها من قبل PCR. ملاحظة أنه نظرا لصغر حجم 3xFLAG العلامة صمم تسلسل باعتباره sDNA جنبا إلى جنب مع العلاقات العامة hEF1α<html> جزء omoter 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig4highres.jpg" width="650" /> بداية ساخنة باستخدام عالية الدقة مزيج الرئيسي 2x لشظايا الحمض النووي المستخدمة في ردود الفعل التجمع الشكل 4. PCR من شظايا الحمض النووي المستخدمة في الاستنساخ وردود الفعل التمثيلي الهضم انزيم التقييد من البلازميدات التي تم الحصول عليها (A) تقارير إنجاز المشروعات التمثيلية: (B) الممثل. البلازميدات من hEF1α، كامل طول CstF-64، pcDNA 3.1 بناء (PGA-CstF-64) وhEF1α، متحولة CstF-64، pcDNA 3.1 بناء (PGA-mutCstF-64) يتفاعل مع NheI وNOTI. (C) نفس البلازميدات كما في B هضمها مع HindIII وNOTI الانزيمات.&quot;_blank&quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم شظايا الحمض النووي </td><td> حجم المتوقعة (بي بي) </td><td> Concn. (نانوغرام / ميكرولتر) </td><td> المخفف إلى (نانوغرام / ميكرولتر) </td><td> ميكرولتر المستخدمة في GA CstF-64 من المخفف </td><td> ميكرولتر المستخدمة في GA mutCstF-64، من المخفف </td><td> نسبة المولي (الإضافية: مركزنا) </td></tr><tr><td> pcDNA 3.1 (ناقلات) </td><td> 4،618 </td><td> 158 </td><td> مخفف </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> hEF1_ المروج جزء 1 </td><td> 825 </td><td> 213 </td><td> 75 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ المروج جزء 2 لCstF-64 </td><td> 516 </td><td> 229 </td><td> 50 </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> Cstf-64 </td><td> 1،796 </td><td> 161 </td><td> مخفف </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ المروج جزء 2 لمتحولة CstF-64 </td><td> 516 </td><td> 199 </td><td> 50 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> متحولة CstF-64 </td><td> 1،448 </td><td> 201 </td><td> 171 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. العائد من شظايا الحمض النووي بعد التركيز على حبات مغناطيسية، تخفيف واقامة ردود الفعل التجمع.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1Î± Promoter Using Gibson Assembly at JoVE.com

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

جيل من البلازميد ناقلات معربا عن بروتينات الموسومة FLAG تحت تنظيم الاستطالة الإنسان عامل-1α المروج عن طريق الجمعية جيبسون

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

generation-plasmid-vectors-expressing-flag-tagged-proteins-under

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

36.7K Views.  Texas Tech University Health Sciences Center. Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning. 

Video: Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

التحول من الحمض النووي البلازميد في كولاي استخدام أسلوب الصدمة الحرارية

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

جيل من صنع الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة الدموية المحيطية باستخدام Lentiviral STEMCCA المتجهات

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

طرق لاكتشاف المروج البديل الاستخدام وتنظيم الترانسكربتي من الفئران Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed specifically for this protocol and allows for the quantification of terminator efficiency. As a proof of concept, six terminators were bioinformatically identified in the mycobacteriophage Bernal13. Once identified, terminators were then made as oligonucleotides with the appropriate sticky ends and annealed together. Using Golden Gate Assembly (GGA), terminators were then cloned into pGR-Blue. Under visible light, false positive colonies appear blue and positively transformed colonies are white/yellow. After induction of an arabinose inducible promoter (pBad) with arabinose, colony strength can be determined by measuring the ratio of green fluorescent protein (GFP) produced to red fluorescent protein (RFP) produced. With pGR-Blue, the protocol can be completed in as little as three days and is ideal in an educational setting. Additionally, results show that this protocol is useful as a means for understanding in silico predictions of terminator efficiency related to the regulation of transcription.

This protocol utilizes Golden Gate Assembly and the plasmid pGR-blue to rapidly quantify the strength of terminators found in silico.

سرعة التحقق من صحة ترمينتورس استخدام الموارد الوراثية النباتية الأزرق البلازميد والجمعية جولدن جيت

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the original plasmid recovery method and introduces restriction enzyme digestion to ease DNA ligation reactions (required for chimera assembly). For this protocol, users clone wildtype genes into the same plasmid (pUC18 or pUC19). After the in silico selection of amino acid sequence regions where chimeras should be assembled, users obtain all the synonym DNA sequences that encode them. Ad hoc Perl scripts enable users to determine all synonym DNA sequences. After this step, another Perl script searches for restriction enzyme sites on all synonym DNA sequences. This in silico analysis is also performed using the ampicillin resistance gene (ampR) found on pUC18/19 plasmids. Users design oligonucleotides inside synonym regions to disrupt wildtype and ampR genes by PCR. After obtaining and purifying complementary DNA fragments, restriction enzyme digestion is accomplished. Chimera assembly is achieved by ligating appropriate complementary DNA fragments. pUC18/19 vectors are selected for CAPRRESI because they offer technical advantages, such as small size (2,686 base pairs), high copy number, advantageous sequencing reaction features, and commercial availability. The usage of restriction enzymes for chimera assembly eliminates the need for DNA polymerases yielding blunt-ended products. CAPRRESI is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI), a protocol based on the insertion of restriction enzyme sites into synonym DNA sequences and functional plasmid recovery. This protocol is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

كابريسي: الجمعية الكيميرا بواسطة الانتعاش البلازميد والقيود إنزيم إدراج الموقع

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

نبات مروج التحليل: تحديد وتوصيف للعقيدات الجذرية المروج محددة في الفول المشتركة

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

استخدام البروتينات النووية الذاتية من الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج بالانزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...