تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي منحة مشروع اكتشاف الاتحاد #1096623.

1. إنشاء متجه إعادة التركيب
<ol><li>تحديد مناطق 150 bp طويلة من homology (يشار إليها باسم الذراعين الأيسر والأيمن) المطلوبة لتسمية N- أو C-terminally الجين الفيروسي من الفائدة (انظر الشكل 1ب).</li>
	<li>تصميم تسلسل oligonucleotide تتألف من 150 نقطة أساس الذراعين اليسار واليمين مفصولة زوج من مواقع تقييد الاختيار. يجب أن يحيط هذا التسلسل بأكمله أيضا بزوج ثان من مواقع التقييد (مختلفة عن الزوج الأول) للسماح بالإدماج في ناقل TDS بمجرد توليفه. الحرص عند تصميم oligonucleotide مع تقييد المواقع التي تسلسل في إطار مع موقع الإدراج المطلوب.</li>
	<li>دمج مواقع تقييد بين الذراعين الأيسر والأيمان عند تصميم oligonucleotide للتوليف، والتي يجب أن تتطابق مع تلك التي تحيط إطار القراءة المفتوحة من العلامة الفلورية للاختيار (انظر الشكل 1ب). فمن الممكن استخدام موقع تقييد نوتي باعتبارها الرابط الأحماض الأمينية الثلاثة بين الذراع اليسرى وبداية العلامة الفلورسنت.</li>
	<li>دمج هذه المواقع تقييد نفسه على جانبي العلامة الفلورسنت بواسطة PCR (انظر الشكل 1c).</li>
	<li>استنساخ جزء توليفها في ناقلات TDS.</li>
	<li>استنساخ العلامة الفلورية في ناقلات إعادة التركيب الناتجة باستخدام مواقع التقييد بين مناطق الذراع الأيسر والأيمن من علم الأوهام (انظر الشكل 1D).</li>
</ol>2. إعادة دمج جيل الفيروسات
<ol><li>وفقا لل الشكل 2، تصيب طبقة أحادية من خلايا BS-C-1 بفيروس vaccinia في الوسائط الخالية من المصل في تعدد العدوى (MOI) > 1.</li>
	<li>1 ساعة بعد العدوى، وخلايا الإنقاذ مع دولبيكو متوسط النسر المعدلة (DMEM) وtransfect مع خليط من البلازميد ناقلات التكميل وكشف العدوى بنسبة 3:1 في وسائل الإعلام الخالية من المصل.</li>
	<li>بعد 24 ساعة، كشط واستعادة الخلايا في DMEM التي لا تحتوي على مصل البقر الجنيني (FBS) وإجراء ثلاث دورات تجميد ذوبان لكسر الخلايا المفتوحة وإطلاق جزيئات الفيروس.</li>
	<li>إجراء فحص البلاك مع تراكب السائل من 10٪ FBS DMEM وGGPT اختيار الكواشف حمض الميكوفينوليك (25 ميكروغرام / مل) وزانثين (250 ميكروغرام / مل) على النحو التالي:<ol>
<li>البذور لوحة 6-جيدا مع طبقة واحدة من خلايا BS-C-1.</li>
		<li>تصيب 100٪ أحاديات الخلية الملتخمة مع التخفيفات التسلسلية للخلايا المذابة بالتجميد التي تحتوي على جزيئات الفيروس لضمان الفصل الكافي بين اللويحات الفردية.</li>
		<li>تراكب مع السائل 10٪ FBS تحتوي على DMEM تحتوي على الكواشف اختيار GPT - حمض الميكوفينوليك وزانثين بتركيزات النهائي من 25 ميكروغرام / مل و 250 ميكروغرام / مل على التوالي.</li>
	</ol></li>
	<li>بعد حضانة 24 ساعة ، وإزالة تراكب السائل واستخدام المجهر الفلورسنت للبحث عن لويحات تظهر مضان أحمر منتشر المقابلة لدمج mCherry من ناقلات TDS في الفيروس. اعتمادا على الجين المستهدف والعلامة الفلورية المختارة ، يمكن أيضا ملاحظة الفلورسنت المترجم للجين الموسوم في نفس اللوحة الحمراء.</li>
	<li>اختيار لويحات متعددة لكل فيروس المؤتلف عن طريق كشط المترجمة مع طرف ماصة و 100 ميكرولتر من 5٪ FBS التي تحتوي على DMEM لنقل الخلايا إلى أنبوب Eppendorf، تليها ثلاث جولات من تجميد ذوبان الخلايا المكشطة لإطلاق الفيروسات المؤتلفة.</li>
	<li>إضافة DMEM تحتوي على تجميد ذوبان الفيروس إلى طبقة واحدة من الخلايا في لوحة 12 جيدا لتضخيم الفيروسات المؤتلفة مع الكواشف اختيار GPT في وسائل الإعلام النمو. كشط التضخيمات الناجحة 24 ساعة بعد العدوى.</li>
	<li>إجراء فحص لوحة لويحات تضخيمها بنجاح عرض مضان أحمر، وهذه المرة مع تراكب agarose واختيار GPT، على النحو التالي:<ol>
<li>البذور لوحة 6-جيدا مع طبقة واحدة من خلايا BS-C-1.</li>
		<li>تنفيذ تخفيف المسلسل من الفيروسات المؤتلفة وتصيب الآبار مع تخفيف متزايد من الفيروسات في FBS الحرة DMEM.</li>
		<li>1 ساعة بعد العدوى، وإزالة وسائل الإعلام السائلة وتراكب كل بئر مع 0.5٪ agarose في الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) التي تحتوي على 2.5٪ FBS، 292 ميكروغرام / مل L-الجلوتامين، 100 U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتوميسين، جنبا إلى جنب مع الكواشف اختيار GPT.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 أيام بعد العدوى، واختيار لويحات عرض الفلورسينس التي هي على حد سواء الأحمر ولون علامة الفلورسنت المختار لتضخيم مرة أخرى، وهذه المرة مع عدم وجود اختيار GPT.</li>
	<li>إجراء المقايسة لوحة المقبل مع تراكب agarose مع عدم وجود تحديد.</li>
	<li>اختيار لويحات التي فقدت مضان أحمر منتشر ولكن الاحتفاظ بفلورنس المترجمة المقابلة لعلامة الاختيار.</li>
	<li>مواصلة تنقية البلاك مع عدم وجود اختيار للحصول على مخزون نقي من الفيروسات المؤتلفة التي فقدت الجينات اختيار mCherry وgpt ولكن الاحتفاظ مضان المترجمة المقابلة للوسم المختار. فحص المخزونات نقية عن طريق فحص البلاك ، يجب أن يكون لجميع اللوحات نمط افتراضي مماثل للبلاك.</li>
	<li>استخدام فحص PCR من الحمض النووي الجينومي لضمان المخزونات الفيروسية نقية.<ol>
<li>تصميم التمهيديات التي تحيط موقع إدراج الجينات الفلورية والمبرمجين التي تضخيم الجين الفلورسنت إدراج نفسها. مجموعات مختلفة من هذه التمهيديات سوف تنتج amplicons PCR من شأنها أن تكشف عن إدراج الجينات وتشير إلى النقاء.</li>
		<li>تضخيم المخزونات الفيروسية ليتم فحص PCR في بئر واحد من طبقة أحادية من 12 جيدا من خلايا BS-C-1.</li>
		<li>24 ساعة بعد العدوى، كشط الخلايا المصابة في 250 ميكروغرام من DMEM.</li>
		<li>خلايا الطرد المركزي المصابة (18000 × غرام لمدة 10 دقائق و 4 درجات مئوية) ، وإزالة الكريات الخلية الفائقة وإعادة الإنفاق في 500 ميكرولتر TE (10 mM Tris-HCl و 1 mM EDTA ، pH 8) مع 0.1٪ (v /v) SDS. دوامة إلى خلايا الليس.</li>
		<li>إضافة 500 ميكرولتر فينول-الكلوروفورم-إيزاميل أكوهول، عكس لخلط. جهاز الطرد المركزي (18000 × غرام لمدة 4 دقائق و 4 درجات مئوية). خذ الناسخ وكرر.</li>
		<li>تنفيذ هطول الأمطار الإيثانول على supernatant بإضافة 1 مل 100٪ الإيثانول (المبردة) و خلات الصوديوم 50 ميكرولتر، عكس لخلط.</li>
		<li>اترك عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أجهزة الطرد المركزي (18000 x ز لمدة 30 دقيقة، 4 درجة مئوية)، وإزالة جميع السائل والسماح الحمض النووي عجلت للهواء الجاف. ريسوسبند في 50 ميكرولتر TE.</li>
		<li>استخدم هذا كقالب لفحص الحمض النووي الجينومي PCR.</li>
	</ol></li>
</ol>3. جيل من الفيروسات المؤتلفة تحمل أكثر من علامة واحدة
<ol><li>Coinfect نفس الخلية monolayer مع الفيروسات المؤتلفة الفلورسنت لإنشاء مزدوجة أو ثلاثية وصفت الفيروسات أو تكرار الإجراء من البروتوكول 1) مع علامة مختلفة.</li>
	<li>تنقية الفيروسات على أساس البلاك النمط الظاهري أو فحص PCR من الحمض النووي الجينومي عزل الفيروس.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventures+with+poxviruses+of+vertebrates.">Adventures with poxviruses of vertebrates.</a> FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).</li><li>Goebel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+DNA-Sequence+of+Vaccinia+Virus.">The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus.</a> Virology. 179, 247-266 (1990).</li><li>Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide-sequence+of+42+kbp+of+vaccinia+virus-strain+WR+from+near+the+right+inverted+terminal+repeat.">Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat.</a> J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).</li><li>Roberts, K. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+morphogenesis+and+dissemination.">Vaccinia virus morphogenesis and dissemination.</a> Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).</li><li>Gammon, D. B., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3+'-to-5+'+Exonuclease+Activity+of+Vaccinia+Virus+DNA+Polymerase+Is+Essential+and+Plays+a+Role+in+Promoting+Virus+Genetic+Recombination.">The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination.</a> J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).</li><li>Yao, X. D., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+DNA+structure+and+homology+length+on+vaccinia+virus+recombination.">Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination.</a> J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).</li><li>Ward, B., Isaacs, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. 16, 205-218 (2004).</li><li>Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Poxvirus+Vectors+Have+Capacity+for+at+Least+25,000.">Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000.</a> Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).</li><li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-etch+EM+reveals+that+the+early+poxvirus+envelope+is+a+single+membrane+bilayer+stabilized+by+a+geodetic+&amp;#34;honeycomb&amp;#34;+surface+coat.">Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic &amp;#34;honeycomb&amp;#34; surface coat.</a> J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).</li><li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+host+cell+entry.">Poxvirus host cell entry.</a> Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).</li><li>Ward, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+characterization+of+the+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+intracellular+mature+virions.">Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions.</a> J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).</li><li>Carter, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+cores+are+transported+on+microtubules.">Vaccinia virus cores are transported on microtubules.</a> J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).</li><li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera.">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).</li><li>Rodriguez, J. F., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+size+phenotype+as+a+selectable+marker+to+generate+vaccinia+virus+recombinants.">Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants.</a> J. Virol. 63, 997-1001 (1989).</li><li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+on+the+basis+of+plaque-formation.">Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation.</a> Gene. 158, 157-162 (1995).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+-+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).</li><li>Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+vectors+utilizing+the+beta-galactosidase+assay+for+rapid+selection+of+recombinant+viruses+and+measurement+of+gene-expression.">Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression.</a> Gene. 47, 193-199 (1986).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia-coli+gpt+gene+provides+dominant+selection+for+vaccinia+virus+open+reading+frame+expression+vectors.">Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors.</a> J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).</li><li>Liu, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+(Tian-Tan+strain)+expressing+hepatitis-B+virus+surface-antigen+by+using+beta-galactosidase+as+a+marker.">Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker.</a> Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).</li><li>Dom&#237;nguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+expressed+by+a+recombinant+vaccinia+virus+permits+early+detection+of+infected+cells+by+flow+cytometry.">Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).</li><li>Cordeiro, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F11-Mediated+Inhibition+of+RhoA+Signalling+Enhances+the+Spread+of+Vaccinia+Virus+In+Vitro+and+In+Vivo+in+an+Intranasal+Mouse+Model+of+Infection.">F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection.</a> Plos One. 4, (2009).</li><li>Jensen, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+major+membrane+and+core+proteins+of+vaccinia+virus+by+two-dimensional+electrophoresis.">Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis.</a> J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).</li><li>Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+Fine-Structure+of+a+Vaccinia+Virus+Gene+Encoding+an+Envelope+Antigen.">Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen.</a> J. Virol. 58, 757-764 (1986).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for.</a> 22, 445-449 (2004).</li><li>Shu, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> Plos Biol. 9, (2011).</li><li>Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+recombinant+poxviruses+using+a+compact+GFP-blasticidin+resistance+fusion+gene+for+selection.">Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection.</a> J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).</li><li>Broder, C. C., Earl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 62, 173-197 (1997).</li><li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vaccinia+virus+formation+and+cell-to-cell+virus+transmission+are+prevented+by+deletion+of+the+gene+encoding+the+37,000-dalton+outer+envelope+protein.">Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein.</a> J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).</li><li>Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J., Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+Navigating+the+subcellular+space:+Lessons+from+vaccinia+virus.">Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus.</a> Viral Transport, Assembly and Egress. , 155-177 (2011).</li><li>Jeshtadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Poxvirus+Intracellular+Mature+Virion+Proteins+with+the+TPR+Domain+of+Kinesin+Light+Chain+in+Live+Infected+Cells+Revealed+by+Two-Photon-Induced+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy.">Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.</a> J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).</li><li>Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+N-WASP+exchange+limits+the+extent+of+ARP2/3-complex-dependent+actin-based+motility.">The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility.</a> Nature. 458, (2009).</li><li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid,+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression.">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).</li><li>D&#233;nes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+oncolytic+Vaccinia+viruses+for+non-invasive+optical+imaging+of+tumors.">Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors.</a> Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+Potentiates+Vaccinia-Induced+Actin+Polymerization+to+Facilitate+Viral+Spread.">Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread.</a> Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).</li><li>Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-viral+imaging+of+vaccinia+virus+using+super-resolution+microscopy.">Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy.</a> J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).</li><li>Horsington, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A36-dependent+Actin+Filament+Nucleation+Promotes+Release+of+Vaccinia+Virus.">A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li></ol>

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تصف هذه التقنية بروتوكولا فعالا ووحدات لإنشاء فيروسات مؤتلفة تعبر عن البروتينات الفيروسية الموسومة بالفلورسنت. تضمن الطريقة أن التغيير الوحيد في الجينوم الفيروسي هو إضافة علامة أو علامة ، دون ترك علامات اختيار. طول الذراع القصير المطلوب لإعادة التركيب المتجانسة تمكن من توليفها المباشر ، والقضاء على عدة جولات تستغرق وقتا طويلا من PCR والاستنساخ ، في حين يتم استخدام مضان mCherry واختيار GPT الأيضية لعزل وسيطة إعادة التركيب الفيروسي. يمكن حل هذه الوسيطات، بعد إزالة التحديد، إلى فيروس مع جين الموسومة أو العودة إلى نوع الوالدين. وقد وصفت طريقة مماثلة تنطوي على استخدام كل من الفلورسنت واختيار الأيض سابقا27 على الرغم من أن الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة يستخدم أقصر, توليفها مناطق التماثل, السماح بتحديد الفيروس المؤتلف المطلوب عن طريق تصوير مضان الجين الموسومة من الفائدة. ينطبق هذا الاختيار الثانوي فقط على وضع علامات على الجينات الفيروسية المعبر عنها للغاية والتي تنتج مضانا كافيا في فحص البلاك. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يتصور إدراج كاسيت التعبير الكامل، على سبيل المثال بروتين الفلورسنت تحت مروج الفيروسية قوية. في هذه الحالة فإن الذراعين الأيسر والأييم تحديد نقطة الإدراج بدلا من الجين الفيروسي ليتم وضع علامات عليها.
هناك بعض الخطوات الرئيسية التي أثبتت فائدتها أثناء الإجراء التجريبي. أثبت التراكب السائل في الخطوة 2.3.3 الموصوفة أعلاه أنه حاسم للكشف عن لويحات الفلورسنت الحمراء /الخضراء وعزلها. ونحن نعتقد أن الجمع بين الكواشف اختيار GPT وتراكب agarose ردع نمو الفيروسات المؤتلفة، وبالتالي تحولت إلى تراكب السائل للخطوة الأولى من تضخيم الفيروسات بعد العدوى. من المهم أيضا اختيار لويحات فلورية تظهر مضان لون العلامة المترجمة للتخصيب والتنقية ، حيث قد تؤدي الوسيطات الناتجة عن إعادة دمج الذراع الأيسر إلى تفلور منتشر لوحظ في لويحات إذا كان الذراع الأيسر يحتوي أيضا على تسلسل المروج. يمكن أيضا استبدال جين علامة mCherry في ناقل TDS ب gfp، على سبيل المثال ، للسماح بدمج واختيار mCherry بسهولة كعلامة فلورية.
تختلف بعض التقنيات المذكورة أعلاه قليلا عن الطرق الراسخة لإنشاء فيروس vaccinia المؤتلف. على سبيل المثال، وزارة الداخلية من الفيروسات المستخدمة في إنشاء المؤتلفات عادة أقل من 128،ولكن استخدام أعلى MOIs كان كافيا لإنشاء فيروس vaccinia المؤتلف بهذه الطريقة. استخدام الكواشف اختيار GPT يتطلب عادة التنبيب المسبق للخلايا مع الكواشف الاختيار18، ولكن إضافتها خلال مرحلة الإنقاذ بعد العدوى لا تزال توفر مجموعة كافية من المفاتنين المطلوبين ، لا سيما بسبب وجود علامة اختيار الفلورسنت كذلك.
كما ذكر سابقا، واحدة من القيود المفروضة على هذه التقنية هو أن خطوة اختيار مضان الثانوية يعتمد على البروتين الموسومة من الفائدة التي أعرب عنها للغاية، على المستوى الذي يمكن الكشف عنها عن طريق العين في فحص البلاك. وبدون ذلك، سيكون من الممكن تنقية الفيروسات التي أظهرت فقط مشرى مضان، منها ما لا يقل عن 50٪ تحتوي على الفيروسات المؤتلفة المطلوبة، والتي يمكن تحديدها من خلال الاستراتيجيات الجزيئية مثل PCR الموصوفة في الخطوة 2.12 أعلاه. وثمة قيد آخر يمكن أن يكون تعطيل بعض البروتينات نتيجة لوضع علامات عليها. قد تخضع علامة الفلورسنت لطفرات أو يتم استئصالها من قبل الفيروس المؤتلف مع التمرير بمرور الوقت. ولذلك، يوصى بأخذ عينات منتظمة من مخزونات الفيروسات المؤتلفة عن طريق المجهر وال PCR. وأخيرا، قد يكون هناك حد لعدد البروتينات الموسومة بالفلورسنت التي يمكن دمجها في فيروس واحد. أحد جوانب هذا هو القدرة على تصور كل منهم في وقت واحد; ونظرا للطبيعة المتداخلة لأطياف الانبعاثات من العلامات الفلورية المتاحة، من المهم اختيارها بعناية لضمان الحد الأدنى من النزيف الطيفي من خلال. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام علامات وثيقة الصلة مثل GFP و Cerulean يفتح إمكانية إعادة التركيب بين الاثنين ، اعتمادا على مواقعهما في الجينوم المؤتلف.
الطبيعة المعيارية لهذه التقنية تمكن من استبدال بسيط من العلامات الفلورية على أساس التوافق مع غيرها من تلطيخ و / أو علامات الخيارات. عن طريق استئصال علامات قابلة للاختيار، وطريقة TDS يسمح لإضافة المسلسل من البروتينات الفلورية المختلفة أو مزيج من العلامات القائمة على TDS مع حذف الجينات المستندة إلى TDS للتحليلات phenotypic29. وكمثال على فائدة هذا النهج، تم توليد فيروس فلوري مزدوج الموسومة التي تسمي نواة الفيروس وغشاء WV. ويمكن استخدام دراسات التصوير مع هذا الفيروس لدراسة الحركة، مورفوجينيسيس والتفاف الفيروس أثناء تكرار الفيروس. حتى الآن غير المكترة vaccinia البروتينات الفيروسية قد تكون أيضا الموسومة ودرس من قبل هذه التقنية.
وقد استخدم فيروس Vaccinia على نطاق واسع في دراسات التصوير بسبب العديد من خصائص الفيروس التي هي مواتية للفحص المجهري للخلايا الحية. يتم التعبير عن العلامات الفلورية من الجينوم الفيروسي ، مما يلغي الحاجة إلى العدوى ، مما يتيح تحليل الخلايا الأولية المشتقة من الحيوانات المصابة أو الخلايا غير القابلة للإصابة بسهولة. في البداية، استخدمت VACVs الفلورسنت لتتبع دون الخلوية بسيطة من حركة الفيروس30،ولكن النهج الأكثر حداثة وسعت فائدتها لتشمل دراسات FRET31،FRAP في جزيئات فيروس واحد32،المروجين المراسلين33،داخل الجسم التصوير34،والدراسات الهيكلية35-37. كل هذه التقنيات يمكن أن تكون في متناول اليد أسهل وأقرب إلى جانب هذه الطريقة لخلق الفيروسات الفلورية المؤتلفة.

Vaccinia virus (VACV) هو فيروس الجدري الأولي ويرتبط ارتباطا وثيقا بفيروس فاريولا ، العامل المسبب للجدري. كل من هذه الفيروسات هي أعضاء في جنس جدري العظام التي تشمل مسببات الأمراض البارزة الأخرى مثل جدري القردة وفيروس ectromelia (جدري الماء)1. فيروسات العظام لديها جينوم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل كبيرة (180-220 kb) التي ترميز ما يزيد على 200 إطارات القراءة المفتوحةالمتوقعة 2،3. تكرار هذه الفيروسات ينطوي على تشكيل مصنع فيروسات ما حول النووية، حيث يتم إجراء الفيروسات الناضجة (MV)، وشبكة عبر غولجي حيث مجموعة فرعية من MV الحصول على اثنين من الأغشية الإضافية لتوليد الفيروسات ملفوفة (WV) (استعرضت من قبل روبرتس وسميث4). الجينوم جدري العظام قابلة للغاية للتلاعب الجيني بسبب درجة عالية من إعادة التركيب الجيني الذي هو سمة من سمات تكرار الجينوم VACV ويتم بوساطة بوليمرات الحمض النووي الفيروسي5. توليد الفيروسات المؤتلفة يعتمد على إعادة التركيب متجانسة وجزيئات الحمض النووي الخطي مع التجانس صغيرة مثل 12 نقطة أساس كافية للتوسط في إعادة التركيب في الخلايا المصابة بفيروس vaccinia6. يمكن وضع العلامات الفلورية من فيروس vaccinia تسفر عن جزيئات الفيروس مشرق للغاية بسبب الحجم الكبير من جزيئات جدري العظام، والذي يسمح لدمج العديد من البروتينات الفلورية لكل virion7. Vaccinia لديه القدرة على حمل شظايا كبيرة من الحمض النووي الأجنبي8 وعلاوة على ذلك، فإن عدم وجود التماثل capsid جامدة قد تسمح بدرجة من المرونة عند التعبير عن الانصهار الجيني البروتين الفيروسي من lociالذاتية 9. وقد ثبت وضع علامات الفلورسنت من البروتينات VACV لا تقدر بثمن لدراسة التفاعلات المضيفة الممرضة على المستوى دون الخلوي، لا سيما في مجال دخول الفيروس10،ونقل11-13،و morphogenesis، لا سيما من virionsملفوفة 7.
يمكن اختيار الفيروسات المؤتلفة عن طريق إنقاذ النمط الظاهري للنمو الموهن14،15، اختيار الأيض16-18، أو عن طريق التعبير عن جين علامة(على سبيل المثال X-gal19 أو البروتين الفلوري13،20). هنا نحن نصف اختيار الفيروسات الفلورية باستخدام مزيج قوي من الفلورسنت واختيار الأيض. العابرة المهيمنة اختيار (TDS) ناقلات, التي وضعتها فوكنر وموس (1990)21, تسمح علامات أن تكون متكاملة جنبا إلى جنب مع الجين الموسومة الفلورسنت المطلوب من الفائدة. عند إزالة الاختيار الأيضي ، يمكن أن يحدث حدث إعادة دمج ثانوي يقوم باختزال جينات الاختيار ، ولكنه يترك بروتين الفيروس الموسوم بالفلورسنت سليما. ويقدم الشكل 2 أدناه لمحة عامة عن الإجراء التجريبي. جينات الاختيار المستخدمة في هذه الدراسة هي mCherry وEscherichia coli guanine الفوسفوريسيل ترانسفيراز(gpt)الجين، وكلاهما أعرب من الاصطناعية في وقت مبكر / في وقت متأخر المروج الفيروسية وتستخدم سابقا من قبل كورديرو وآخرون. 22 بالإضافة إلى ذلك ، هناك مضان من بروتين الانصهار الموسومة ذات الاهتمام. عند إزالة الاختيار الأيضي ، يتم استئصال العلامات القابلة للاختيار(mCherry و gpt)، مما يترك فقط مضان الجين الموسوم ، مما يسمح بتحديد الفيروسات المؤتلفة الصحيحة. يوفر استئصال علامات الاختيار إمكانية الجمع بين علامات الفلورسنت المتعددة ، مما يمكننا من إنشاء فيروسات مع القدرة على تسمية العديد من البروتينات الفيروسية في وقت واحد. وقد حددت الدراسات السابقة الحد الأدنى من متطلبات التشوه ل vaccinia إعادة دمج جزيئات الحمض النووي الخطية والتعميمية التي تم تحويلها إلى خلايا مصابة بفيروس vaccinia6. أردنا تحديد كفاءة إعادة التركيب من أطوال التشوم متفاوتة من الأسلحة المحيطة في ناقلات TDS gpt-mCherry من خلال دمجها في الجينوم الفيروسي vaccinia. وتقرر أن المناطق المتجانسة من 100 نقطة أساس في ناقلات TDS كافية لاستهداف والتوسط في إدراج الحمض النووي المؤتلف في جينوم VACV عن طريق إعادة التركيب المتجانس(الشكل 4). في حين أن أطوال التماثل الأصغر ستمكن أيضا من إعادة التركيب ، فإن أطوال 100 bp homology قدمت ما يكفي من الفيروسات المؤتلفة التي يمكن التعرف عليها بسهولة مع اختيار الأيض والفلورسنت. ويمكن توليف أجزاء الحمض النووي من هذا الحجم تجاريا بتكلفة منخفضة نسبيا ويسهل إلى حد كبير إنتاج ناقلات متعددة لإنشاء الفيروسات المؤتلفة. اخترنا زيادة طول التماثل إلى 150 نقطة أساس لتوفير تردد أكبر لإعادة التركيب مع الحفاظ على انخفاض تكاليف تركيب تسلسل أوليغونوكليوتيد من المناطق المحيطة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mycophenolic acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3536-50MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 0.1N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xanthine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X0626-5G</td>
			<td>Dissolve in 0.1N NaoH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE HD transfection reagent</td>
			<td style="width:95px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td>
			<td style="width:95px;">Olympus, Chroma</td>
			<td style="width:119px;">BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

وقد ثبت وضع علامات على البروتينات الفيروسية مع البروتينات الفلورية نهجا لا غنى عنه لتعزيز فهمنا للتفاعلات بين الفيروس والمضيف. فيروس Vaccinia (VACV) ، وهو اللقاح الحي المستخدم في القضاء على الجدري ، قابل بشكل خاص للفحص المجهري للخلايا الحية الفلورية بسبب حجمه الكبير Virion وسهولة هندسته على مستوى الجينوم. نحن هنا تقرير بروتوكول الأمثل لتوليد الفيروسات المؤتلفة. تم تحديد الحد الأدنى من متطلبات إعادة التركيب المتجانس المستهدف أثناء تكرار ال vaccinia ، مما يسمح بتبسيط توليد البناء. وقد مكن ذلك تحالف الاختيار المهيمن العابر (TDS) مع مراسل فلوري واختيار التمثيل الغذائي لتوفير نهج سريع ونمطي لتسمية البروتينات الفيروسية الفلورية. من خلال تبسيط جيل من الفيروسات المؤتلفة الفلورية، ونحن قادرون على تسهيل التطبيقات المصب مثل تحليل التصوير المتقدمة من جوانب كثيرة من التفاعل الفيروس المضيف الذي يحدث أثناء تكرار الفيروس.

يسرد الشكل 1 البنى المختلفة المطلوبة لهذا الإجراء، والتي يتم تصنيعها إما(الشكلان 1ب و1c)أو التي تم إنشاؤها بواسطة خطوات الاستنساخ(الشكل 1D). ويقدم الشكل 2 مخططا للإجراء التجريبي مع صور لوحة فلورية تمثيلية ل VACV المؤتلف A3-GFP المصور لكل خطوة من خطوات عملية الاختيار. في الشكل 3, فيروسات vaccinia المؤتلفة التعبير عن البروتينات الموسومة علامات الفلورسنت التي تستهدف البروتينات الهيكلية الفيروسية A3 و F13, التي هي جزء من جوهر الفيروس الداخلي23 والمغلف الخارجي24, على التوالي, وتظهر. يتم تصوير ملاحظات لويحات الفيروسية والخلايا المصابة لكل من الفيروسات المؤتلفة التي تم إنشاؤها. تم اختبار كفاءة إعادة التركيب المتجانسة للناقلات مع جينوم VACV ، الذي يحتوي على مناطق منخفضة يصل إلى 70 نقطة أساس من الأوهام إليها ، ويتم تصوير النتائج في الشكل 4. كان النجاح النسبي لتحديد لويحات الفيروسية المصنوعة من إعادة التركيب مع ناقلات تحتوي على 100 bp homology هو المنطق وراء اختيار توليف 150 bp طول الذراعين الأيسر والأيمن من الأوهام إلى الجين المستهدف.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 ناقل إعادة التركيب التحديد المهيمن العابر (TDS). (أ) TDS المتجه مع علامات اختيار gpt و mCherry. (ب)تم تصميم الذراعين الأيسر والأيمن من homology مع مواقع تقييد محددة في ما بين ويحيط بأذرع التماثل. وكانت مواقع التقييد بين الذراعين الأيسر والأيماني المستخدمة في هذه الطريقة هي NotI و BamHI ، كما يستخدم موقع NotI كرابط بين الجين وعلامة الفلورسنت. (ج) علامات الفلورسنت المتوافقة مع هذه الطريقة محاطة بمواقع تقييد مناظرة. بعض العلامات المستخدمة هي GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) ، RFP (بروتين الفلورسنت الأحمر) ، Cerulean (تحسن على ECFP ، بروتين فلوري سماوي ، من خلال تكوين25موجه من الموقع) وميني سوغ ، وهو بروتين فلوري تم تصميمه من GFP مما يخلق منتجا قابلا للحل من قبل EM على الإضاءة26. (د)خطوات الاستنساخ التي ينطوي عليها توليد ناقل إعادة تركيب TDS النهائي. أول من تم تصنيعه oligonucleotide التي تحتوي على الذراعين الجناحين الأيسر والأيمان هو استنساخ الأولى في ناقلات TDS. وهذا يوفر ناقل إعادة التركيب الذي يمكن نقل أي علامة من الاختيار داخل وخارج عن طريق الاستنساخ في مواقع تقييد أدرجت بين الذراعين الأيسر والأيمين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم مخطط تفصيلي للإجراء التجريبي لإنشاء فيروس vaccinia المؤتلف. يتم تصوير الأحداث التي تحدث على المستويين الوراثي والخلوي ، جنبا إلى جنب مع صور لوحة تمثيلية تحدد الخطوات التالية لإنشاء فيروس vaccinia الفلوري المسمى A3-GFP. (أ)يتم تحويل الخلايا المصابة بفيروس vaccinia مع ناقلات إعادة التركيب TDS. (ب)في هذا الشكل، يتم تصوير فقط نتيجة إعادة التركيب الأيسر ويستخدم المثال GFP كعلامة الفلورسنت المفضلة. ومن شأن إعادة التركيب باليد اليمنى أن تؤدي إلى دمج البلازميد TDS بأكمله في الجينوم بطريقة مماثلة، باستثناء أن العلامة ستدمج في الجين المستهدف بأكمله في الخطوة المتوسطة، أي الخطوة جيم. يتم إجراء فحص البلاك على أحادي الطبقة الخلية مع مزيج إعادة التركيب ويخضع لاختيار GPT. (ج)يتم اختيار وتضخيم لويحات تعرض كل من الفلورسينس الأحمر والأخضر ، المقابلة لتعبير mCherry و GFP على التوالي. بمجرد إزالة الاختيار ، سيكون هناك فقدان الفلورسينس الأحمر المقابل لفقدان جينات gpt و mCherry (D) ويتم اختيار اللوحات التي تعرض الفلورسينس الأخضر حصريا وتضخيمها(E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن النتائج التمثيلية لنظام إعادة دمج TDS. صور تصور لويحات كاملة من VACV المؤتلفة تصيب الخلايا بعد 48 ساعة(أ، ج، ه؛ شريط مقياس 100 ميكرومتر) ، مصحوبة بصورة لخلية واحدة مصابة بالفيروس المؤتلف المقابل بعد 8 ساعات(ب، د، و؛ شريط مقياس 10 ميكرومتر). تم اختيار الجينات المقابلة للبروتينات المترجمة virion لتصور جزيئات الفيروس. A3 هو البروتين الأساسية للvirion vaccinia (أ، ب) و F13 (ج، د) هو بروتين مغلف الفيروسية. يظهر أيضا فيروس مزدوج الموسومة مع كل من fluorescently المسمى A3 و F13 (ه، و) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال التحليل الكمي لكفاءة إعادة التركيب بين ناقلات المؤتلف والجينوم VACV. أصيبت الطبقات الأحادية BS-C-1 ب VACV وجرى إصابة 1 ساعة بعد العدوى بثلاث ناقلات إعادة دمج تحتوي على مناطق من الأوهام إما 500 نقطة أساس أو 100 نقطة أساس أو 70 bp إلى جينوم VACV. كما احتوى كل متجه على كاسيت TDS الذي يتألف من جينات اختيار gpt و mCherry. تم استرداد الخلايا 24 ساعة بعد العدوى وlysed للافراج عن الفيروسات المؤتلفة التي تشكلت. تم إجراء فحوصات البلاك على lysates الخلية مع وسائل الإعلام اختيار GPT ولوحات تظهر مشيري مضان تم عدها كمتلفات ناجحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم خريطة لمتجه GPT-mCherry TDS الذي يعرض موقع الاستنساخ المتعدد. وقد وصف المتجه سابقا22 وتم إنشاء خريطة متجه بمساعدة خريطة EZ Plasmid v1.9 من مجموعة مختبر تشانغ (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض صورة أكبر</a>.

Watch this Scientific Journal Video about Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins at JoVE.com

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

ويرد هنا وصف بروتوكول سريع ووحدات لتوليد فيروسات vaccinia المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الموسومة الفلورية في وقت واحد باستخدام طريقة الاختيار المهيمن العابر.

منهجية لتوليد كفاءة من البروتينات فيروس Vaccinia الموسومة الفلورية

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Views.  University of Sydney. ويرد هنا وصف بروتوكول سريع ووحدات لتوليد فيروسات vaccinia المؤتلفة التي تعبر عن البروتينات الموسومة الفلورية في وقت واحد باستخدام طريقة الاختيار المهيمن العابر.

Video: Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

فحوص للكشف عن العوامل رني المضيفة المعنية في الوقس عدوى فيروس باستخدام ذبابة الفاكهة خلايا

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

الاصبع العصا منهجية أخذ عينات من الدم لتحديد بممارسة المستحثة الأبوطوزيس اللمفاويات

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

وظيفية فحص الدم لقياس الجامعة صلاحية مايكوباكتيريا ، وذلك باستخدام الجينات المرتبطة دلاليا مراسل بي سي جي إم أو السل (BCG لوكس / M. التربيوم لوكس)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

التعبير عن المؤتلف وظيفية راصة دموية والبروتينات النورامينيداز من الفيروسات الأنفلونزا H7N9 رواية باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

اللقاحية مراسل الفيروسات لقياس وظيفة الفيروسية في جميع مراحل التعبير الجيني

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...