ברצוננו להודות למיכאלה Jansen במרכז למדעי בריאות באוניברסיטת טקסס טק, Lubbock, TX ומלאדן Yovchev במרכז רפואי של אוניברסיטת פיטסבורג, פיטסבורג, פנסילבניה לpcDNA נדיבות מתן 3.1 myc-שלו () ופלסמידים המכילים מקדם hEF1α . מחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי מכון יוניס קנדי ​​שרייבר הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם של המכון הלאומי לבריאות במספר הפרסים R01HD037109 (לCCM). תמיכה נוסף הייתה מלורה בוש המכון לבריאות אישה (לCCM ו- PNG). התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

1. סיליקו העיצוב של פלסמיד והדור של Primers החופף הערה: המטרה של צעד זה היא להרכיב רצף נוקליאוטידים מלא של המבנה ועיצוב פריימרים ללשמש כדי ליצור שברים עם חופף קצוות לשיבוט GA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב רצף נוקליאוטידים רציף לייצג פלסמיד הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג או לפרט את פלסמידים בפועל ושברי DNA שישמשו כתבניות בPCR. הערה: שברי DNA שאינם זמינים - כמו שילוב של תגים ויזמים שונים - ניתן להזמין כברים בודדים או מרובים סינטטי פעמיים תקועים DNA (sDNA). שברים אלה הם זמינים באופן מסחרי בעלות נמוכה יחסית ויכולים להיות עד 2 קילו באורך (ראה טבלה של חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את רצף נוקליאוטידים הרציף של המבנה התאסף בשלב 1.1 לרסיסי DNA מתאימים לPCR. Confirמ &#39;שהברים להתאים פלסמידים זמינים ושברי sDNA. הימנע DNA שברים קטן יותר מ -200 NT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גש לכלי דור פריימר (ראה טבלה של ציוד). בחר בתפריט &quot;העדפות הגדר&quot;. בחר הגדרות מתאימות על ידי לחיצה על הכרטיסייה &quot;prefs שנה&quot; בחלון &quot;הגדרות גיבסון עצרת שינוי&quot; המוקפץ. הערה: עיצוב פריימר גם יכול להתבצע ללא שימוש בכלי דור פריימר. עם זאת, השימוש בכלי דור פריימר מפשט את התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל לבנות את המבנה על ידי בחירה בתפריט &quot;בנה Construct&quot;. הכנס את שברי DNA פילוג ברצף פריימר כלי דור מ5 &#39;ל 3&#39; הסוף. הערה: קטע DNA משמש כעמוד שדר פלסמיד ניתן לחלק בנוחות לשני חלקים. במוצר הסופי PCR &#39;סוף הקטע הראשון זה ו3&#39; 5 סוף הקטע האחרון קשורים יחד בDN אחד הרציףבר המייצג את עמוד השדרה הווקטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבק את קטע DNA הראשון מייצג סוף &#39;5 של ה- DNA הווקטור בפורמט FASTA (ייצוג המבוסס על טקסט של רצף נוקליאוטידים) לתוך החלון המוקפץ &quot;Enter וקטור או הכניסו בר&quot;. שם קטע DNA. לבחור את הדרך המתאימה כדי להשיג את קטע DNA, או כPCR, RE Digest או סינתזה. לחץ על הלשונית &quot;ההמשך&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך להוסיף נוקלאוטידים נוספים / אתרי הגבלה בצומת של המבנה הסופי להשתמש ברווחי &quot;spacer Fwd או פריימר Rev&quot; שנקבעו בחלון &quot;הוסף בר להכניס להרכבה&quot;. להוסיף נוקלאוטידים נוספים / אתרי הגבלה רק לאחד ברי DNA ולא לשני הברים. לחץ על לשונית &quot;עשתה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור כל הקטעים עד המבנה הושלם. בחר את התפריט &quot;תצוגת Primers&quot; ולסקור את רצפי פריימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור כל המבנים (וקטור בackbones ומוסיף), או לברי DNA שהם שונים. </li></ol> 2. הגברה של שברי DNA על ידי PCR באמצעות חם התחל הגהה DNA פולימראז (2x מיקס מאסטר) הערה: המטרה לצעד זה היא להשיג DNA מספיק לתגובת ההרכבה באמצעות PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש פריימרים PCR נועדו בשלב הקודם כמוצרי desalted ובקנה המידה הקטנה ביותר האפשרית. לדלל אותם עד 10 מיקרומטר במים או TE (10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.9, 1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש ברי DNA שאינם זמינים שברי sDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את כל שברי DNA, כולל שברי sDNA שישמשו כתבניות לPCRs לng 1 / μl במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את תגובות PCR בטמפרטורת חדר. בקצרה, להשתמש 2.5 μl (10 מיקרומטר מפתרון מניות) של כל צבע יסוד בהתאמה של זוג פריימר, μl 1 (מng 1 / פתרון μl מלאי) של קטע DNA התבנית, 25 μl של פולימראז החם הגהה התחלת DNA (DNA pol; תערובת אמן 2x; ראה טבלה של חומרים) ו -19 מים μl. מערבבים את הצינור על ידי מצליף עדין ולאסוף את טיפות נוזל על ידי צנטריפוגה הקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר בו-זמנית בצינורות נפרדים שברי DNA בגודל דומה על פי ההמלצות לpol DNA. בצע 25 - 28 מחזורי PCR או לקבוע את מספר המחזורים שמייצרים תשואת DNA מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 10% מPCR נפח התגובה (5 μl) על ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose סטנדרטי מוכתמת ethidium ברומיד (0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי). ודא שלהקת DNA בודדת המייצגת את מוצר ה- PCR גלויה. לקבוע את הגודל וכמות היחסית של שברי DNA תוך שימוש בסטנדרטי משקל מולקולרי DNA. אם יש צורך, לחזור על PCR להשיג כמות מספקת של שברי DNA. </li></ol> 3. DpnI עיכול של מוצרי PCR הערה: המטרה של צעד זה היא DIGEDNA פלסמיד st שייר התבנית מPCRs בסעיף 2. DpnI יהיה לעכל את פלסמיד דנ&quot;א רק אם הוא מפוגל, כגון מתרחש לפלסמיד DNA גדל בסכר + זני חיידקים. לכן, לא מתייחס בDpnI אם פלסמיד DNA ישמש כקטע DNA בתגובת GA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של אנזים הגבלת DpnI לμl 45 של מוצרי ה- PCR מיוצרים בסעיף 2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. המשך לסעיף 4 או הקפאה ב -20 ° C עד צורך. </li></ol> 4. טיהור וריכוז של שברי DNA על חרוזים מגנטיים DNA טיהור הערה: המטרה של צעד זה היא לטהר ולרכז את מוצרי ה- PCR שהושגו בסעיפים 2 ו -3 שיטות טיהור PCR אחרות עשויים לשמש גם כן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את חרוזים מגנטיים טיהור DNA לטמפרטורת חדר. מחדש להשעות את החרוזים על ידי vortexing הקצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את PCRs wi מראש מתעכל-DpnI ה לצינורות 1.5 מיליליטר ולהוסיף 81 μl של חרוזים מגנטיים טיהור DNA לצינור אחד. דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינורות על האספן המגנטי למשך כ -2 דקות. מחק את הנוזל השקוף בעזרת פיפטה. לשטוף פעמיים עם 200 μl של 80% אתנול למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את כדורים לייבוש. שמור את המכסה של הצינורות פתוחים, עם הצינורות ממוקמים על האספן המגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את החרוזים המיובשים ב 10 μl של 10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.0. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. ספין בקצרה לאסוף את הנוזל שבתחתית הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הצינורות על האספן המגנטי למשך 2 דקות. הסר 8.5-10 μl של הפתרון ברור ולמקם אותו בצינור שכותרתו מראש חדש. קבע את הריכוז של שברי DNA על ידי ספקטרוסקופיה UV (ראה טבלה של ציוד). </li></ol> תגובת 5. עצרת שיבוט וטרנספורמציה של המוצרים בE. coli &lt;p class =&gt; הערה &quot;jove_content&quot;: המטרה לצעד זה היא לחשב 3: 1 יחס של כנס: וקטור ולבצע את תגובת ההרכבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש של קטע DNA המייצג את עמוד השדרה הווקטור או קטע DNA נושא את הסמן סלקטיבית לפחות 100 ng. לחשב את העודף טוחנת פי 3 לברי DNA שישמשו כמוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת טוחנת-העודף בNG צורך של להכניס כל אחד מסוים. הערה: דרך נוחה לעשות את החישובים היא להשתמש ביישום מבוסס אינטרנט (ראה טבלה של ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב כמויות המחושבות של שברי DNA בצינור PCR, להתאים את עוצמת הקול עד 10 μl. הוסף 10 μl של מיקס מאסטר GA (2x, ראה טבלה של חומרים). דגירה התגובה על 50 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 להרכבה של 4-6 שברים או 15 דקות להרכבה של 2-3 שברים בCycler תרמית PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך עם הפיכתו של מוצר ההרכבה בE. המוסמך coli או להקפיא את המוצרים ב -20מעלות צלזיוס, עד צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הליך ההפיכה המלווה את כימי או תאי אלקטרו מוסמכים. בדרך כלל, להשתמש 2 μl של תגובת ההרכבה לכל תגובת שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השינוי הוא מלא, להפיץ את התאים הפכו על צלחות אגר בתוספת האנטיביוטיקה סלקטיבית המתאימה. </li></ol> 6. בידוד פלסמיד, הגבלת אנזים עיכול ורצף הערה: המטרה של צעד זה היא לבודד DNA פלסמיד מE. coli, אז כדי לאמת את המבנה על ידי עיכול הגבלה וסדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ כמה מושבות אחת לpreps מיני ובידוד פלסמיד. תרבות LB לילה מיליליטר שימוש 2-5 הנוזלית בתוספת האנטיביוטיקה מתאימה. לבודד את פלסמידים המקבילים על ידי ביצוע ההליך המתואר בערכת הכנת מיני המשמשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות וריכוז של פלסמידים שהושג באמצעות spectroפוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע עיכול הגבלה עם endonucleases הגבלה אחד או כמה ל~ 0.5 מיקרוגרם של פלסמידים המטוהרים. השתמש באנזימי הגבלה המספקים דפוס מובהק של מאפיין עיכול לבונת DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר הצלחת שיבוט DNA על ידי רצפי DNA באמצעות פריימרים ספציפיים או סטנדרטיים. לנתח את נתוני רצף לדיוק. </li></ol>

<ol>
	<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature methods. 7, 901-903 (2010).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+genes+transferred+to+haemopoietic+stem+cells+by+recombinant+retroviruses.">Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses.</a> Molecular biology &amp; medicine. 4, 229-250 (1987).</li><li>Challita, P. M., Kohn, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+from+a+retroviral+vector+after+transduction+of+murine+hematopoietic+stem+cells+is+associated+with+methylation+in+vivo.">Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).</li><li>Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+incorporating+the+immunoglobulin+heavy+chain+enhancer+and+matrix+attachment+regions+provide+position-independent+expression+in+B+lymphocytes.">Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes.</a> Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).</li><li>Meilinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Np95+interacts+with+de+novo+DNA+methyltransferases,+Dnmt3a+and+Dnmt3b,+and+mediates+epigenetic+silencing+of+the+viral+CMV+promoter+in+embryonic+stem+cells.">Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells.</a> EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).</li><li>Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+high-level+stable+transgene+expressing+human+embryonic+stem+cell+lines+using+Chinese+hamster+elongation+factor-1+alpha+promoter+system.">Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system.</a> Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).</li><li>Chung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+different+promoter+systems+for+efficient+transgene+expression+in+mouse+embryonic+stem+cell+lines.">Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines.</a> Stem cells. 20, 139-145 (2002).</li><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+constitutive+promoters+and+the+doxycycline-inducible+promoter.">Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter.</a> PloS one. 5, e10611 (2010).</li><li>Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignment+of+human+elongation+factor+1alpha+genes:+EEF1A+maps+to+chromosome+6q14+and+EEF1A2+to+20q13.3.">Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3.</a> Genomics. 36, 359-361 (1996).</li><li>Wallace, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+forms+of+the+64,000+Mr+protein+of+the+cleavage+stimulation+factor+are+expressed+in+mouse+male+germ+cells.">Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).</li><li>MacDonald, C. C., McMahon, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+mechanisms+of+alternative+polyadenylation:+testis,+brain,+and+beyond.+Wiley+interdisciplinary+reviews.">Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews.</a> RNA. 1, 494-501 (2010).</li><li>Sabath, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-End+processing+of+histone+pre-mRNAs+in+Drosophila:+U7+snRNP+is+associated+with+FLASH+and+polyadenylation+factors.">3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors.</a> Rna. 19, 1726-1744 (2013).</li><li>Yang, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+containing+the+CPSF73+endonuclease+and+other+polyadenylation+factors+associates+with+U7+snRNP+and+is+recruited+to+histone+pre-mRNA+for+3'-end+processing.">A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing.</a> Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).</li><li>Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Sequencing+of+RNA+Isolated+by+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+(HITS-CLIP)+to+Determine+Sites+of+Binding+of+CstF-64+on+Nascent+RNAs.">High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs.</a> Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).</li><li>Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CstF-64+supports+pluripotency+and+regulates+cell+cycle+progression+in+embryonic+stem+cells+through+histone+3'+end+processing.">CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing.</a> Nucleic acids research. , (2014).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS one. 3, e3647 (2008).</li><li>Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-fusion(R)+cloning+with+vaccinia+virus+DNA+polymerase.">In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase.</a> Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).</li><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome.">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344, 55-58 (2014).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+bacterial+cell+controlled+by+a+chemically+synthesized+genome.">Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome.</a> Science. 329, 52-56 (2010).</li></ol>

Open Access publication and production fees were supplied by New England BioLabs Inc.

שימוש מוצלח של שיבוט GA יש קדמו תמיד על ידי עיצוב מדוקדק של המבנה השלם (איור 2 ואיור 3). בדיקה קפדנית של רצפי פריימר שתוכננו על ידי כלי דור פריימר גם מומלצת מאוד. צבעי יסוד לGA ייתכן שנוצרו ללא שימוש בכלי דור פריימר. עם זאת, שימוש בכלי הוא מאוד ממליץ, כי זה מפשט את התהליך. בדרך כלל, פריימר לשיבוט GA חייב להיות שני רצפים שונים מבחינה תפקודית. הרצף הראשון הוא שבר-ספציפי DNA, ומאפשר ההגברה של הבר באמצעות PCR. הרצף השני חופף עם שבר הסמוך, אשר הכרחי להרכבת GA. רצף ה- DNA-בר-ספציפי אופייני יהיה 18-22 NT באורך. רצפי DNA ספציפיים-הבר משמשים כדי להגביר את אותו DNA חייבים להיות טמפרטורות התכה דומות ותוכן GC. רצף חופף צריך להיות לפחות 15NT באורך עם טמפרטורת התכה של לפחות 48 מעלות צלזיוס. ההרכבה של יותר מ -4 ברי DNA תחייב את הרצף החופף להיות לפחות 20 NT. חפיפה ארוכה יותר תאפשר סגוליות מוגברת של חישול וכתוצאה מכך שברי DNA שנאספו יותר כראוי. מומלץ להימנע מרצפים המוטים בGC או AT התוכן בפיתוח רצפים חופפים, כי רצפים מוטים עלולים לפגוע בהרכבת DNA נכונה. כמו כן, אנו ממליצים להשתמש כביקורת שלילית, שלא צריך לייצר כל מושבות חיידקים עמידות לתרופות, רק קטע DNA המתאים לשדרת הווקטור בתגובת GA. לחלופין, אחד מברי DNA המרכיבים את &quot;מוסיף&quot; יכול להיות מושמט מתגובת GA, שאמורה גם לגרום ללא מושבות חיידקים עמידות לתרופות. הסיבה לא מושבות תגדל יהיה חוסר קצוות חופפים של שברי DNA הסמוכים, שתהפוך את ההרכבה של complפלסמיד ete. בפרוטוקול מתואר, חופף רצפים של 25 NT כדי ליצור קבוצות פריימר שמשו, בגלל מספר שברי DNA משמש (איור 3). ההמלצה של אתר כלי דור פריימר (ראה טבלה של ציוד) היא להשתמש בלפחות 20 רצפים NT חופפים להרכיב 4-6 שברי DNA. בנוסף, יותר חופף רצף יבטיח את השלמה התקינה של גדילי דנ&quot;א (ראה איור 1) להגדיל את מספר המוצרים שנאספו בצורה מדויקת. נכון לעכשיו, כמה מערכות לשיבוט חלק זמינות. עם זאת, חלק מהמערכות אלה עדיין משתמש באנזימי הגבלה (כלומר, שער זהב שיבוט 18). אחרים משתמשים תערובות קניינית של אנזימים המבוססים על DNA פולימרז וירוס vaccinia וחלבון DNA המחייב יחיד גדיל מאותו המקור הביולוגי 19. שני המערכות מוגבלות בהשוואה לGA ידי השוראורך ter של חופף רצפים. משום רצפים חופפים קצרים יותר עשויים שלא לספק ספציפי מספיק לצעד חישול של שברי DNA סמוכים, טיוח ההרכבה התקינה של יותר מ 23 שברי DNA בעייתיים. חסרונות אלה אינם קיימים במערכת GA. גודלו של שברי DNA להיות מוגברים צריך להיות גם נחשב, כדי שלא יעלו על גודל amplifiable מהימן על ידי PCR (כלומר, KBP פחות מ 8 באורך). אפילו עם השיפורים בתפקוד של polymerases DNA ב -10 השנים האחרונות, שברי DNA גדולים יהיו מוגברים עם פחות יעילות ודיוק. במידת הצורך, יכולים להיות שהושגו שברי DNA גדולים יותר ממקורות אחרים אלטרנטיבה לPCR, למשל, על ידי בידוד פלסמיד ועיכול DNA המתאים עם אנזימי הגבלה. באופן ספציפי, לפרוטוקול המתואר בכתב היד הנוכחי, רציונלים להשתמש PCR היה מבוסס שלנו בגודל של שברי DNA הזמינים, שהיה כל פחות מ5 KBP. אם יש יותר ממוצר אחד PCR זוהה על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose, טיהור ג&#39;ל של גודל שבר הרצוי מומלצת שימוש בכל טכניקות ביולוגיה מולקולרית הזמינות או ערכות מתאימות. בפרוטוקול הנוכחי משמש DNA פולימרז thermostable (ראה טבלה של חומרים). עם זאת כל DNA פולימרז מתן איכות גבוהה ותשואה יהיה מתאים לשימוש עם פרוטוקול זה. אם polymerases DNA באיכות גבוהה שונה ממתואר בפרוטוקול זמין, השתמש בתנאים מוגדרים כמתואר בספרי ההדרכה המתאימה. בפרוטוקול הנוכחי, E. כימי מוסמך תאי coli משמשים שמסופקים עם ערכת GA. E. לחלופין, כימי או אלקטרו מוסמך ניתן להשתמש בזני coli כגון DH5α או DH10B. ההרכבה שיבוט תערובת אמן 2x היא קלה לשימוש עם ידיים על השקעה מינימאליות של זמן. עם זאת, נדרש pipetting מדויק בגלל הנפחים הקטנים needed להיות מעורב יחד. טכניקת ביולוגיה מולקולרית טובה צריכה להיות למימוש בכל העת, כמו גם. שיבוט GA מציע אפשרויות בלתי מוגבלות לבנייה של שברי DNA, פלסמידים ווקטורים, שהם יותר מ -3 kbp בגודל. בנוסף יש לו השפעה רחבה יותר בתחום של ביולוגיה סינתטית, משום שהיא מאפשרת סינתזה והרכבה של, למשל, הגנום כולו חיידקים (mycoides Mycoplasma) או שמרי כרומוזום (Saccharomyces cerevisiae) 20,21. הטכניקה גם לגבי שיבוט קונבנציונלי צריך ליצור מבנים חלקות. לסיכום, שיבוט GA מציע אלטרנטיבה מהירה, אמינה וגמישה לתהליך שכפול DNA הקונבנציונלי.

נהלי שיבוט DNA קונבנציונליים להסתמך על השימוש באנזימי הגבלה לדבוק האנזים DNA ו- DNA להצטרף לברי DNA ביחד. דור של בונה ביטוי מותאמת אישית המכילה קטעי דנ&quot;א שונים הוא הליך רציף הכולל מחשוף של DNA עם אחד ו / או endonucleases הגבלה מרובה וההכנסה הבאה של קטעי DNA באמצעות קשירה. החסרון העיקרי של שיטה זו הוא שאנזימי הגבלה מתאימים לאחד מברי DNA עלולים להיות קשים לזהות (כלומר, ייתכן שיש כמה אתרי מחשוף) טיוח שיבוט DNA מוצלח של החלבון באורך המלא של עניין בלתי אפשרי. לכן, דור ביטוי מותאם אישית בונה תחת הרגולציה תעתיק של יזמי סוג ספציפי תא יעיל עם חלבון-תגים מותאמים אישית דורש תכנון זהיר מאוד. כמו כן, טכניקת זמן וגוזל עבודה. לאחרונה, כמה דיווחים תיארו מתודולוגיות להרכיב multipשברי DNA הסינתטי שונים le ברצף מתמשך באותו הזמן בשתי תגובות אחת או שתיים צעד ללא השימוש באנזימי ההגבלה 1-3. התגובה חד-השיבוט (לא כולל את כל שלבי ההכנה), תלויה בשימוש בתערובת של exonuclease DNA, DNA פולימראז, האנזים DNA 2,3 והקצוות החופפים של שברי DNA (איור 1). מאחר ואין שימוש באנזימי הגבלה, שברי DNA בכל גודל ובהרכב רצף (לא כולל רצפים חוזרים מאוד) ניתן התמזגו יחד במבנה חלק. לאחרונה, ערכה מסחרית (הרכבה גיבסון; GA) לתגובות שיבוט צעד אחד הפכה זמינה. ערכה זו מאפשרת הרכבה מהירה ויעילה עלות של כל קטעי DNA בוקטור יחיד עם מקדמים מותאמים אישית ותגי חלבון. וקטורי ביטוי פלסמיד הזמינים באופן נרחב בשימוש כדי לבטא חלבונים אקסוגניים בדגמי תרבית תאי יונקים הם לעתים קרובות תחת reg תעתיקulation של ציטומגלווירוס הנגיפי (CMV) או וירוס 40 יזמים קופיים (SV40). יזמים נגיפיים אלה מספקים ביטוי חולף חזק של החלבונים אקסוגניים ברוב דגמי תרבית תאי יונקים מבוססים. עם זאת, דור של שורות תאי יציבות להביע חלבונים אקסוגניים הוא לעתים קרובות לא מוצלח בגלל השתקת תעתיק של CMV או מקדמי SV40 במהלך 4,5 תהליך ההקמה. בנוסף, יזמי SV40 וCMV נגיפי לא מספיק לקדם את הביטוי של חלבונים אקסוגניים בתאים מהשושלת הלימפה או תאי גזע עובריים 6,7. הפתרון למגבלה המובנית של יזמים נגיפיים הוא להשתמש יזמים מכוננים חזקים שאינם נגיפיים 8-10. אמרגן אחד מאופיין היטב חזק מכונן שאינו נגיפי ממקור האנושי הוא אמרגן 1α גורם התארכות (hEF1α) (hEF1α מעורב בקטליזה של עמותת GTP-התלוי של aminoacyl-tRNA לריבוזומים 11). עם זאת,וקטורי ביטוי המכילים את אמרגן hEF1α אינם כזמינים לציבור רחב ככל הנגיפי-אמרגן המכיל פלסמידים, במיוחד אלה המכילים גם 3 × FLAG בסוף מסוף אמינו של החלבון של עניין. חלבון 64,000 MW גורם גירוי מחשוף (CstF-64) מעורב בעיבוד סוף &#39;3 ​​של רוב mRNAs 12,13, כולל mRNAs היסטון שכפול תלוי 14,15. CstF-64 באו לידי ביטוי בכל הרקמות סומטיות 12. מוטיב הכרת RNA נקשר לרצפי RNA GU העשירים בתמלילים המתהווה במורד הזרם של אתר המחשוף וpolyadenylation 16. זה מחייב של CstF-64 להרנ&quot;א הראשוני מקדם מחשוף endonucleolytic יעיל לתמליל המתהווה. כאן, פרוטוקול מתואר המשתמש בהגברת PCR של שברי DNA, ערכת גיבסון שיבוט הרכבה (הכוללת תאי חיידקים כימיים מוסמכים) כדי לייצר וקטורי מנהג מ &#39;מתויג 3xFLAGouse CstF-64 או CstF-64 מוטציה לסוף מסוף אמינם תחת הביטוי של אמרגן hEF1α 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="553">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:196px;">Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA)</td>
			<td style="width:71px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">DNA purification magnetic beads</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Plasmid Isolation Mini Kit</td>
			<td style="width:71px;">Omega Bio-Tek Inc</td>
			<td style="width:119px;">D6942-01</td>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E5510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0494S</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">DpnI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NheI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NotI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">HindIII</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>NanoDrop device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">EditSeq</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">SeqBuilder</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Word</td>
			<td style="width:71px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of&#160; Microsoft Office</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBuilder</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>primer generation tool: http://nebuilder.neb.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBioCalculator</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of plasmid vectors expressing flag-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1&#945; promoter using gibson assembly

ההרכבה גיבסון שיבוט (GA) מציעה אלטרנטיבה מהירה, אמינה, וגמישה לשיטות שיבוט DNA קונבנציונליות. אנחנו השתמשנו GA ליצור פלסמידים מותאמים אישית לביטוי של גנים אקסוגניים בתאי גזע העובריים של עכבר (mESCs). ביטוי של גנים אקסוגניים תחת שליטתו של SV40 או מקדמי ציטומגלווירוס אדם פוחת במהירות לאחר transfection לmESCs. תרופה לביטוי מצומצם זה היא להשתמש במקדם אלפא התארכות גורם האנושי-1 (hEF1α) לנהוג ביטוי גנים. וקטורי פלסמיד המכילים hEF1α אינם כזמינים לציבור רחב ככל SV40- או פלסמידים המכיל CMV, במיוחד אלה 3xFLAG-תגי N-terminal גם מכילים. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה מהירה ליצירת פלסמידים להביע CstF-64 וCstF-64 מוטציה FLAG מתויג תחת הרגולציה דרכי ההבעה של אמרגן hEF1α. GA משתמש בתערובת של exonuclease DNA, DNA פולימראז ואנזים DNA לעשות שיבוט של חופף קצוות של שברי DNA אפשריים.בהתבסס על DNAs התבנית היה לנו זמין, עיצבנו מבנינו שהתאספו לתוך רצף אחד. העיצוב שלנו השתמש בארבעה שברי DNA: עמוד השדרה 3.1 וקטור pcDNA, חלק אמרגן hEF1α 1, חלק hEF1α אמרגן 2 (שהכיל 3xFLAG תג נרכש כקטע DNA סינטטי פעמיים תקועים), וגם מוטציה CstF-64 CstF-64 או ספציפית. הרצפים של קטעים אלה הועלו לכלי דור פריימר לתכנן פריימרים PCR מתאימים ליצירת שברי DNA. לאחר PCR, שברי DNA היו מעורבים עם הווקטור המכיל את הסמן סלקטיבית ותגובת שיבוט GA הורכב. פלסמידים ממושבות חיידקים הפכו בודדות היו מבודדים. מסך פתיחה של פלסמידים נעשה על ידי עיכול הגבלה, ואחריו רצף. לסיכום, GA אפשר לנו ליצור פלסמידים מותאמים אישית עבור ביטוי גנים ב 5 ימים, כוללים לבנות מסכים ואימות.

זרימת עבודה של הפרוטוקול שאחרי מוצגת באיור 2 א. רצינו לשכפל CstF-64 וCstF-64 חלבוני מוטציה התמזגו 3xFLAG תג תחת הרגולציה דרכי ההבעה של אמרגן hEF1α (איור 2 ואיור 3). HEF1α פלסמיד המכיל ואחריו 3xFLAG-תג לא היה זמין לנו. עם זאת, פלסמידים הבאים היו זמינים: 3.1 pcDNA myc-שלו (; מתנה נדיבה ממיכאלה Jansen), פלסמיד המכיל hEF1α (מתנה נדיבה ממלאדן Yovchev) והעכבר CstF-64 פלסמידים 12 (איור 3). הרצף כולו למבנה (ים) הורכב באמצעות יישומי עריכת נוקלאוטיד וטקסט (איור 3; ראה טבלה של ציוד). בהמשך לכך, הרצף (ים) פוצל בארבע חתיכות נוחים (איור 2, בלוקים אדומים ואיור 3) המתאימות לDNAs פלסמיד הזמינים. p הגברהrimers נועדו שימוש בכלי פריימר דור (ראה טבלה של ציוד) עם אילוצים של 4-6 ברים עם חפיפה מינימאלית של 25 NT, שהוקם בחלון &quot;הגדרות גיבסון עצרת שינוי&quot; המוקפץ. אתרי הגבלת NheI וNotI נכללו בעיצוב פריימר לצורך זיהוי פלסמידים התאספו כראוי. אתר NheI ממוקם ברצף פריימר בין pcDNA 3.1 ו -5 הסוף &#39;של אמרגן hEF1α. אתר NotI נמצא אחרי קודון העצירה (UGA) של CstF-64 וpcDNA 3.1 עמוד השדרה וקטור. על העיכול בו-זמנית עם שני אנזימי קטע DNA המורכב של אמרגן hEF1α, 3xFLAG וCstF-64 או המוטציה CstF-64 ישוחררו (ראה להלן ואיור 2). Primers נצטוו בקנה המידה הקטנה ביותר האפשרית וdesalted. בחלקו השני של אמרגן hEF1α מכיל קטע DNA 3xFLAG תג (490 נ&quot;ב, איור 2, איור 3) נרכש כבר sDNA בודד (יםEE טבלה של חומרים). שברי DNA משמשים בתגובת ההרכבה היו מוגברים באמצעות pol DNA (ראה טבלה של חומרים). שברי DNA של חלק אמרגן hEF1α 1, חלק hEF1α אמרגן 2, באורך מלא וCstF-64 המוטציה היו מוגברים במקביל בצינורות נפרדים במשך 28 מחזורים (איור 4 א), בעקבות ההמלצות של הספק של pol DNA (ראה טבלה של חומרים , עבור כל denaturation מחזור היו 7 שניות על 98 מעלות צלזיוס, חישול 45 שניות על 55 מעלות צלזיוס, התארכות 90 שניות על 72 מעלות צלזיוס). בתחילה, את עמוד השדרה pcDNA 3.1 היה מוגבר במשך 22 מחזורים (באמצעות אותם תנאים כאמור לעיל, למעט זמן התארכות, שהוקם עד 3 דקות ב 72 מעלות צלזיוס). עם זאת, תשואת DNA וכתוצאה מכך לא הייתה די כדי לשמש בתגובת הרכבה (איור 4 א). לכן, הגברה נוספת מבוצעת כדי להשיג DNA מספיק. מוצרי PCR להשיגed מתבנית פלסמיד יש מתעכל עם אנזים הגבלת DpnI כדי להסיר את ה- DNA פלסמיד, שאחרת היה לזהם את תוצרי תגובת הרכבה וכתוצאה מכך ויהיה לייצר מושבות חיידקים עמידות לתרופות חיוביות שגויות. לכן, מוצרי ה- PCR היו מתעכלים עם אנזים הגבלת DpnI, שדבק פלסמיד דנ&quot;א-מפוגל חמי מפוגל ומבודד מסכר + E. זני coli. מוצרי ה- PCR שהושגו באמצעות שברי DNA סינטטיים, כתבניות לא צריכה להיות מעוכלות עם DpnI מאז DNA מסונתז כימי אינו מכילות בסיסים מפוגלים או-מפוגל חמי. שברי DNA היו מטוהרים ומרוכזים על חרוזים מגנטיים טיהור DNA (ראה טבלה של חומרים) כפי שמתוארים בשלב הפרוטוקול 4. PCRs לשדרת 3.1 וקטור pcDNA שולב יחד והסכום של חרוזים מגנטיים טיהור DNA משמש הותאם בהתאם. תשואת DNA נקבעהבאמצעות ספקטרופוטומטר (טבלה 1 וטבלה של ציוד). תגובות עצרת לCstF-64 וCstF-64 מבני מוטציה נאספו על קרח (טבלה 1). עודף טוחנת של פי 3 של קטעי DNA נחשבים &quot;מוסיף&quot; היה בשימוש (טבלה 1, איור 3). הנפח הסופי של שברי DNA המעורבים הותאם עד 10 μl עם מים ו -10 μl של תערובת אמן הרכבה (2x) נוספה. התגובות היו מעורבות וטופחו על 50 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. תגובת ביקורת חיובית גם התאסף על פי המלצת המדריך לערכת GA וטופחו בו-זמנית עם CstF-64 ומוטצית CstF-64 תגובות. כפי שהומלץ בפרוטוקול, 2 μl של כל אחד מתגובות ההרכבה הפכו בE. כימי המוסמך coli מצורף לערכת שיבוט הרכבה (ראה טבלה של חומרים). השינוי בוצע כמתואר בערכהמדריך ל. שיבוטים חיוביים נבחרו על צלחות / LB אגר אמפיצילין. 6 מושבות לכל תגובת הרכבה באופן אקראי נבחרו להיות מופצת. פלסמיד DNAs היה מבודד באמצעות ערכת מיני בידוד פלסמיד (ראה טבלה של חומרים). בעיכול סיליקון ושל המבנים עם הגבלת אנזימי NheI וNotI הביאו שני שברים בגדלים של 4590 נ&quot;ב, 3,032 נ&quot;ב לנ&quot;ב CstF-64 ו4590, 2,711 נ&quot;ב לCstF-64 מוטציה (איור 2 ואיור 4). עיכול עם הגבלת אנזימי HindIII וNotI הביאו שלושה שברים בגדלים הבאים: 5872 נ&quot;ב, 1005 נ&quot;ב, ונ&quot;ב 745 (CstF-64) ונ&quot;ב 5872, 1005 נ&quot;ב, ונ&quot;ב 424 (CstF-64 המוטציה, איור 2 ו 4C איור). ואכן, עיכול של פלסמידים המבודדים מוצג דפוסים האופייניים הצפויים (איור 4, C). שימו לב שבר DNA 424 נ&quot;ב המיוצר על ידי מערכת עיכול עם HindIII וNotI של המוטציה CstF-64פלסמידים באיור 4C מוכתמים בחולשה בשל גודלו הקטן. 2 מתוך 6 פלסמידים מבודדים נשלחו על רצף. אנו רצף אמרגן hEF1α, וCstF-64 או מוטציה CstF-64 חלקים של המבנים כדי לוודא שאין מחיקות, הוספות או החלפות. אנו ממליצים בחום רצף של מבני DNA וכתוצאה מכך או כל פרוטוקול המבוסס על PCR. הרצף הראה כי אחד מכל פלסמיד רצף הכיל את הרצף הצפוי באזור של hEF1α, 3xFLAG-תג וCstF-64 או CstF-64 המוטציה. כל אחד מפלסמידים האחרים הייתה מוטציה נקודה הציגה במהלך ההגברה של קטע DNA המקביל. ביטוי של פלסמיד המכיל CstF-64 בתאי גזע העובריים של עכבר, המיוצר על כמות שפע של חלבון אקסוגני דומה לביטוי מהסוג בר 17. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" width="450" /> איור 1. ייצוג סכמטי של מנגנון גיבסון העצרת. שברי DNA עם חפיפת הקצוות נאספו isothermally ברצף מתמשך אחד. החפיפה מסתיימת ראשון לעסה בחזרה על ידי 5 exonuclease &#39;, אשר הוא לחמם בהדרגה מומת. כתוצאה מכך, שברי DNA שונים עם קצוות חופפים יהיו לחשל isothermally. DNA פולימרז יהיה למלא את הפערים ואנזים DNA thermostable ligates ניקס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" width="650" /> איור 2. (א) תרשים זרימה של הפרוטוקול מתואר לשיבוט הרכבה. ייצוג (B) של פלסמיד, PGA-CstF-64 שנוצר באמצעות ערכת GA אדום - שברי DNA משמשים בתגובת ההרכבה:. PcDNA3.1; חלק אמרגן hEF1α 1 (hEF1a - 1); חלק hEF1α אמרגן 2 (hEF1a - 2) הורה כDNA סינטטי; עכבר CstF-64 (mCstF-64). כחול - מסגרות קריאה פתוחות. ויולט - יזמים נגיפיים ולא-נגיפיים. ירוקים -. אזורי מחשוף וpolyadenylation <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" width="650" /> תיבות איור 3. עיצוב של פלסמיד CstF-64 ההרכבה גיבסון. שחור מייצגות את שברי DNA שהיו זמינים לעצב הרכבה גיבסון יחידה CstF-64 ברצף סיליקון. בהמשך לכך, הרצף היה מחולק בארבעה חלקי DNA, שהיו מוגברים על ידי PCR. שים לב כי בשל גודלו הקטן של 3xFLAG תג הרצף תוכנן כsDNA יחד עם יחסי ציבור hEF1α<html> omoter חלק 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig4highres.jpg" width="650" /> נציג (B): איור 4. PCR של שברי DNA המשמשים בתגובות השיבוט ועיכול אנזים הגבלת נציג של פלסמידים שהושגו () PCRs נציג באמצעות חם להתחיל תערובת אמן 2x באיכות גבוהה עבור קטעי DNA המשמשים בתגובות הרכבה. פלסמידים של hEF1α, CstF-64, pcDNA 3.1 מבנה (PGA-CstF-64) באורך מלא וhEF1α, מוטציה CstF-64, pcDNA 3.1 מבנה (PGA-mutCstF-64) מתעכל עם NheI וNotI. (ג) באותו פלסמידים כמו בB מתעכלים עם אנזימי HindIII וNotI.&quot;_blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם של שברי DNA </td><td> גודל צפוי (נ&quot;ב) </td><td> Concn. (Ng / μl) </td><td> מדולל ל( ng / μl) </td><td> μl משמש בGA CstF-64 ממדולל </td><td> μl משמש בGA mutCstF-64, ממדולל </td><td> יחס (תוספות: vec) טוחנות </td></tr><tr><td> pcDNA 3.1 (וקטור) </td><td> 4618 </td><td> 158 </td><td> חַי </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> hEF1_ חלק אמרגן 1 </td><td> 825 </td><td> 213 </td><td> 75 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> אמרגן hEF1_ חלק 2 לCstF-64 </td><td> 516 </td><td> 229 </td><td> 50 </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> Cstf-64 </td><td> 1,796 </td><td> 161 </td><td> חַי </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> חלק אמרגן hEF1_ 2 לCstF-64 מוטציה </td><td> 516 </td><td> 199 </td><td> 50 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> CstF-64 מוטציה </td><td> 1,448 </td><td> 201 </td><td> 171 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. תשואה של שברי DNA לאחר ריכוז בחרוזים מגנטיים, דילול והקים מתגובות ההרכבה.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1Î± Promoter Using Gibson Assembly at JoVE.com

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

generation-plasmid-vectors-expressing-flag-tagged-proteins-under

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

36.7K Views.  Texas Tech University Health Sciences Center. Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning. 

Video: Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

שיטות לגלות אלטרנטיבי שימוש יזם ותקנת תעתיק של Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed specifically for this protocol and allows for the quantification of terminator efficiency. As a proof of concept, six terminators were bioinformatically identified in the mycobacteriophage Bernal13. Once identified, terminators were then made as oligonucleotides with the appropriate sticky ends and annealed together. Using Golden Gate Assembly (GGA), terminators were then cloned into pGR-Blue. Under visible light, false positive colonies appear blue and positively transformed colonies are white/yellow. After induction of an arabinose inducible promoter (pBad) with arabinose, colony strength can be determined by measuring the ratio of green fluorescent protein (GFP) produced to red fluorescent protein (RFP) produced. With pGR-Blue, the protocol can be completed in as little as three days and is ideal in an educational setting. Additionally, results show that this protocol is useful as a means for understanding in silico predictions of terminator efficiency related to the regulation of transcription.

This protocol utilizes Golden Gate Assembly and the plasmid pGR-blue to rapidly quantify the strength of terminators found in silico.

אימות של Terminators ראפיד שימוש פלסמיד PGR-כחול גולדן גייט האסיפה

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the original plasmid recovery method and introduces restriction enzyme digestion to ease DNA ligation reactions (required for chimera assembly). For this protocol, users clone wildtype genes into the same plasmid (pUC18 or pUC19). After the in silico selection of amino acid sequence regions where chimeras should be assembled, users obtain all the synonym DNA sequences that encode them. Ad hoc Perl scripts enable users to determine all synonym DNA sequences. After this step, another Perl script searches for restriction enzyme sites on all synonym DNA sequences. This in silico analysis is also performed using the ampicillin resistance gene (ampR) found on pUC18/19 plasmids. Users design oligonucleotides inside synonym regions to disrupt wildtype and ampR genes by PCR. After obtaining and purifying complementary DNA fragments, restriction enzyme digestion is accomplished. Chimera assembly is achieved by ligating appropriate complementary DNA fragments. pUC18/19 vectors are selected for CAPRRESI because they offer technical advantages, such as small size (2,686 base pairs), high copy number, advantageous sequencing reaction features, and commercial availability. The usage of restriction enzymes for chimera assembly eliminates the need for DNA polymerases yielding blunt-ended products. CAPRRESI is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI), a protocol based on the insertion of restriction enzyme sites into synonym DNA sequences and functional plasmid recovery. This protocol is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

מי קולחין יזם: זיהוי ואפיון של השורש גולה יזם ספציפי בתוך השעועית נפוצות

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

Co-immunoprecipitation Assay באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני מתאי תרבותי בתנאים ובשפתיים

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...