ونحن نعترف جولي Heward لمساعدة في إعداد hNSCs، وLavaniya Thanabalasundaram لدعمها التقني مع هيلا زراعة وترنسفكأيشن.

1. HNSC التمايز على ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافة ملاحظة: عزل واستخلاص hNSCs، من الأنسجة وافق الأخلاقية، وصفت في منشور السابق 2. يرجى اتباع المبادئ التوجيهية الأخلاقية والمؤسسية في حين تتبع هذا الإجراء. 1.1) الثقافة 3D عن طريق 12 لوحة جيدا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تقنية العقيم في جميع أنحاء الداخلي. في خزانة السلامة البيولوجية، السقالات إعادة هيدرات بإضافة 2 مل / جيد من 70٪ من الإيثانول أعدت استخدام المياه لأغراض الري (WFIr). تجنب لمس السقالات التي كتبها الاستغناء عن الايثانول 70٪ لأسفل جدار كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية الايثانول 70٪، ويغسل فورا السقالات مع 2 مل / جيد DMEM: F12 لمدة 1 دقيقة. كرر الإجراء الغسيل مرتين. نضح بعناية DMEM: F12 بعد غسل النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السقالات معطف بإضافة 2 مل / جيد من laminin (10 ميكروغرام / مل) في DMEM: F12. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 همهمةحاضنة idified مدة لا تقل عن 2 ساعة. غسل لوحة مع DMEM الدافئ: F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور كل سقالة مع ما يقرب من 500،000 hNSCs في حجم 150 ميكرولتر من RMM + إحصاءات مالية الحكومة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب للسماح للخلايا ليستقر في السقالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3.5 مل من RMM لكل اتخاذ رعاية جيدة وليس لإزاحة الخلايا من السقالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة لمدة 7 أيام؛ استبدال RMM متوسطة (3.5 مل / جيد) بعد 1 يوم (التغذية الأولى) ومرة ​​أخرى بعد 2-3 أيام من تغذية الأولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 7 أيام، وإزالة المتوسطة والخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) للمناعية (ICC) إصلاح أو إضافة 500 ميكرولتر / بئر كاشف تحلل لمجموع استخراج الحمض النووي الريبي (مخزن وحة في ≤ -80 ° C أو المضي إلى إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي) . </li></ol> 1.2) قياس أكسون ثمرة عملية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار 4٪ PFA ثابتة hNSCs متباينة وفقا لبروتوكول المحكمة الجنائية الدولية القياسية 20 باستخدام β3-تويولين (TUBB3) الكشف عن الأجسام المضادة الأولية مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق تألقي. نوى الخلايا مباين مع هويشت (1 ميكرومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور تمثيلية من خلايا β3 تويولين الملون باستخدام المجهر الفلورسنت. حفظ الصور كما شجار أو JPEG. مقياس لعملية محور عصبي ثمرة باستخدام أداة قياس البرمجيات (على سبيل المثال، صورة برو بلس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصورة، والخيار القياسات مختارة في شريط الأدوات، وحدد ميزة التتبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبدء التتبع، تحديد نقطة البدء على ثمرة محور عصبي من خلال النقر على زر الماوس. تتبع على طول من ثمرة محور عصبي. انقر بزر الماوس الأيمن لإنهاء كل أثر. كرر لقياس كل outgrowthswith محور عصبي في مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعبير عن القياسات كما بكسل أو ميكرون (في انتظار معايرة اقامة). قياسات طول التصدير إلى برنامج جدول بيانات للتحليل المقارن والإحصائي عينة. </li></ol> 2. ميرنا التعبير باستخدام الخلايا الجذعية ومسارات التنموية المركزة ميرنا PCR صفيف 2.1) ميرنا الكلي استخراج الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء استخراج ميرنا على السقالات وعينات 2D نمت (متباينة وغير متمايزة، والسيطرة hNSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السقالات ذوبان الجليد، وإدراجها في 12 لوحة جيدا، إذا لزم الأمر. الجمع بين محتويات كاشف تحلل (500 ميكرولتر) من 2 آبار في نفس 1.5 مل إيبندورف أنبوب، الحجم النهائي 1 مل من تحلل كاشف. احرص على ترك السقالة في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمعها سابقا خلية مكعبات 2D نمت العينات الجافة مثل (متباينة الثقافات hNSC 2D والسيطرة غير متمايزة) إضافة 1 مل من تحلل كاشف ونقل المحتويات إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس كل عينة الاختبار باستخدام 1 مل حقنة وقصيرة 20 إلى 25 إبرة قياس. تمرير المحللة من خلال إبرة باستخدام حقنة 1 مل تصل إلى 5 مرات حتى يتم التوصل إلى المحللة متجانسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم لكل أنبوب إيبندورف وسقف آمن. عكس ودوامة الأنابيب لخلط المحتويات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي كل 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي جناسة لمدة 15 دقيقة في ≥12،000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة المائية العليا من كل عينة (تجنب نقل أي البيني، والوردي اللون السائل) إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل الطازجة التي تحتوي على 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج دقيق من قبل انقلاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ما يصل الى 700 ميكرولتر من كل عينة اختبار، بما في ذلك أي راسب، في عمود صغير في أنبوب جمع 2 مل. إغلاق الغطاء والطرد المركزي في ≥8،000 x ج لمدة حوالي 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. تجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة باستخدام ما تبقى من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء هضم الحمض النووي لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 ميكرولتر عازلة RWT إلى العمود مصغرة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في ≥8،000 ز س. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل عمود صغير من خلال إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE والطرد المركزي لمدة حوالي 30 ثانية في ≥8،000 ز س. تجاهل التدفق من خلال. كرر wash.Centrifuge في ≥12،000 x ج لمدة 1 دقيقة حتى يجف الغشاء أبعد من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل الحمض النووي الريبي مجموع في 1.5 مل إيبندورف أنبوب عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه إلى العمود صغير والطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في ≥8،000 ز س. قياس التركيز الكلي RNA مع المعونة من مقياس الطيف الضوئي المناسب. </li></ol> 2.2) ميرنا [كدنا إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج الرئيسي العكسية النسخ. يتطلب كل عينة 4 ميكرولتر من العازلة 5X miScript HiSpec، 2 ميكرولتر من 10X nucleics المزيج، miScript 2 ميكرولتر عكس مزيج الناسخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 8 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في أنبوب PCR، إضافة حجم المطلوب من الحمض النووي الريبي مجموع (250 نانوغرام)، وإضافة الماء الخالي من ريبونوكلياز إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة C.Incubate لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية إلى تعطيل miScript الناسخ العكسي ميكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز لكل رد فعل 20 ميكرولتر عكس النسخ، وتخزينها في -20 ° C، أو المضي في الوقت الحقيقي، منظمة الشفافية الدوليةلي PCR على الفور. </li></ol> 2.3) الخلايا الجذعية والتنموية مسارات تركز ميرنا PCR صفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PCR مكونات المزيج في أنبوب 15 مل بإضافة 1375 ميكرولتر من 2X SYBR مزيج سيد الأخضر، و 100 ميكرولتر إعداد ميرنا كدنا]، 275 ميكرولتر من 10X miScript العالمي التمهيدي، و 1000 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه (إجمالي حجم 2،750 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل PCR مكونات المزيج على خزان تحميل PCR. إزالة بعناية 96-جيدا لوحة PCR مجموعة من حقيبتها مختومة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر مكونات PCR مزيج من كل بئر من صفيف PCR باستخدام pipettor 8 قنوات، أو pipettor 12 قناة باستخدام سوى 8 نصائح. تغيير نصائح الماصة بعد كل خطوة pipetting للتجنب التلوث المتبادل بين الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة مع فيلم لاصقة البصرية، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 1،000 x ج في درجة حرارة الغرفة (15-25 درجة مئوية) لإزالة الفقاعات. تفقد البصر لوحة من تحت لضمان عدم وجود فقاعات موجودة في الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 96 لوحة جيدا PCR مجموعة في cycler على الوقت الحقيقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج في الوقت الحقيقي cycler على وفقا لذلك: 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، و 45 دورات لمدة 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و 1 دقيقة في 60 ° C رقما (جمع البيانات مضان) واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير القيم ط لجميع الآبار إلى جدول بيانات Excel فارغة للاستخدام مع PCR صفيف تحليل البيانات قالب Excel والبرمجيات على شبكة الإنترنت. ملاحظة: البرنامج هو متاح في <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. تحليل الحاسوبية لميرنا الهدف التنبؤ والتحقق من صحة الهدف من mRNAs التي كتبها مراسل البلازميد ترنسفكأيشن وDdual luciferase المراسل الفحص. 3.1) تحليل الحاسوبية للتنبؤات ميرنا الهدف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفح PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21، خوارزمية المتاحة على الانترنت لتحديد ميرNA استهداف من mRNAs التنبؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;انقر هنا للتنبؤ PicTar على الفقاريات&quot;. سيتم فتح صفحة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صفحة جديدة، PicTar اجهة ويب، واختيار الأنواع في القائمة المنسدلة وإدراج ميرنا من الفائدة في مربع ميرنا ID. انقر فوق البحث عن أهداف ميرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نلاحظ قائمة من mRNAs الهدف عن طريق aPicTar درجة في المرتبة. ملاحظة: PicTar يحسب على درجة مما يعكس احتمال أن UTR نظرا سيتم مستهدفة من قبل ميرنا محددة، وعلى أساس التكامل البذور، والديناميكا الحرارية والتنبؤ اندماجي للأهداف المشتركة في مجموعات من-أعرب المشارك miRNAs 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبالمثل استرداد قائمة من mRNAs الهدف باستخدام DIANA-LAB ( <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23، وTargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24، بديل على الانترنت متاح الخوارزميات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الجدول المقارن للمiRNAs على أساس الترتيب الحصول عليها باستخدام أدوات برمجية مختلفة. PicTar تحتل المرتبة قبل النتيجة، DianaLab التي كتبها الدقة (بناء على إشارة إلى نسبة الضوضاء وعلى درجة من الدقة لتقييم أهمية النتائج المتوقع)، وTargetScan من قبل معاهدة التعاون بشأن البراءات الكلي (على أساس التكامل البذور، الطاقة الحرة الحرارية ملزمة، والحفاظ على أنواع مختلفة)، انظر الجدول 1. </li></ol> 3.2) التحقق من صحة الهدف من mRNAs التي كتبها مراسل البلازميد ترنسفكأيشن والفحص المزدوج luciferase المراسل. ملاحظة: 3 &#39;UTR للصحفيين luciferase المراسل للتحقق من صحة الهدف كان مرنا وصفها سابقا 25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور خلايا هيلا في مناطق ذات كثافة من 10 5 خلية / جيدا في لوحة 24-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، وشارك في بالنقل خلايا هيلا مع 1.5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن وإما 100 نانوغرام من NR4A3 3 &quot;UTRor SOX5 3 &#39;UTR البلازميد، فضلا عن 20 نانومتر يحاكي ميرنا (هائل سعيد أنعم-مير 96-5p لSOX5 3217؛ UTR، وهائل سعيد أنعم-مير 7-5p، وهائل سعيد أنعم-مير 17-5p لNR4A3 3 &#39;UTR على التوالي) لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آبار المراقبة المشارك بالنقل مع NR4A3 3 &quot;UTRor SOX5 3&quot; UTRplasmid وتألقي المسمى الرناوات siRNAs السيطرة السلبية. ترنسفكأيشن من آبار المراقبة مع تألقي المسمى الرناوات siRNAs السيطرة السلبية يسمح تقييم كفاءة ترنسفكأيشن وحسابات لتقليد ميرنا 3&#39;UTR ربط خصوصية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس المزدوج luciferase المراسل الأنشطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس اليراع وRenilla الأنشطة luciferase المراسل 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. إزالة نمو الخلايا المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل العاملة I بإضافة 50 ميكرولتر من الركيزة I إلى 10 مل من الحل الأول؛ تخلط جيدا. إضافة 300 ميكرولتر من محلول العامل الأول في كل 24 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل محتويات كل 24 بشكل جيد في 3 آبار من 96 لوحة بيضاء، و 100 ميكرولتر لكل منهما. انتظر 10 دقيقة وقياس اليراع luciferase المراسل في مجموعة luminometer لاقتناء التلألؤ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد solut العملأيون II بإضافة 50 ميكرولتر من الركيزة II إلى 10 مل من محلول الثاني؛ تخلط جيدا. إضافة 100 ميكرولتر من محلول العامل الأول في كل 96 جيدا تحتوي بالفعل 100 ميكرولتر من محلول العامل الأول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 10 دقيقة وقياس Renilla luciferase المراسل في مجموعة luminometer لاقتناء التلألؤ. حساب نسبة من التألق من يراعة luciferase إلى luciferase المراسل Renilla. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration.">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li><li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke.">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li><li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation.">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li><li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke.">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li><li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion.">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li><li>Kalladka, D., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+repair:+cell+therapy+in+stroke.">Brain repair: cell therapy in stroke.</a> Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency.">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity.">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).</li><li>Buxboim, A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+feel+the+difference.">Stem cells feel the difference.</a> Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).</li><li>Li, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+nanofibrous+scaffold+for+cartilage+tissue+engineering+using+human+mesenchymal+stem+cells.">A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Ortinau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).</li><li>Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+synthetic+materials+to+control+stem+cell+phenotype.">Designing synthetic materials to control stem cell phenotype.</a> Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).</li><li>Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alvetex(R):+polystyrene+scaffold+technology+for+routine+three+dimensional+cell+culture.">Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsion-+templated+porous+polymers+as+scaffolds+for+three+dimensional+cell+culture:+effect+of+synthesis+parameters+on+scaffold+formation+and+homogenity.">Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity.</a> J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function.">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li><li>Stevanato, L., Sinden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+microRNAs+on+human+neural+stem+cell+differentiation+in+two-+and+three-dimensional+cultures.">The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li><li>Chen, K., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+selection+on+human+microRNA+binding+sites+inferred+from+SNP+data.">Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data.</a> Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).</li><li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microRNA+target+predictions.">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li><li>Maragkakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+microRNA+target+prediction+correlates+with+protein+repression+levels.">Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels.</a> BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).</li><li>Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+seed+pairing,+often+flanked+by+adenosines,+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets.">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li><li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3'UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells.">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance,+pyramidal+cell+survival,+and+seizure+susceptibility.">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li><li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway.">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+postmitotically+regulates+migration,+postmigratory+differentiation,+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons.">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li><li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes.">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li></ol>

جميع الكتاب والعاملين، والأوراق المالية و / أو حاملي الأسهم في الخيار ReNeuron المحدودة أو الشركة الأم. وأيد هذه الدراسة من قبل ReNeuron (RENE.L).

وقد قدمت تطوير جديد في فحوصات المختبر لتقييم وتحسين تمايز الخلايا الجذعية دائما تحديا للتحقيق في وظائف وقدراتها العلاجية. على المدى الطويل ومرفق مستقر للhNSCs، اللازمة لتطوير 3D قوية التمايز في المختبر فحص، وقد وجهت عن طريق اختبار عدة ركائز 3D مع خصائص مختلفة من حيث المواد والهياكل. كجزء من تطوير فحص نحن أيضا تقييم الأمثل تركيز البذر الخلية وتحديد متطلبات السقالات أن laminin المغلفة. على الرغم من أن لدينا hNSCs يمكن التفريق بشكل عفوي على 4 OHT أظهرت وإزالة عامل النمو، وتنفيذ نظام الثقافة 3D تحسن كبير في القدرة على التمايز التي تقاس محور عصبي عملية ثمرة بالمقارنة مع 2D متباينة hNSCs القياسية. للتحقيق في تأثير اح 3D يسببهاntiation على hNSC ميرنا التعبير كنا مجموعة PCR. مقارنة مع رقاقة ميكروأري معيار PCR مجموعة تقدم مزايا الكمي المباشر والتحقق من ميرنا من الفائدة. على الرغم من أن مجموعة PCR محدودة في المدى من إجمالي عدد ميرنا لكل صفيف، على سبيل المثال هنا في أقل من 96، فإنه يمكن أن تكون مصممة خصيصا لتشمل miRNAs من الفائدة، في حالتنا ذكرت سابقا في تطوير الخلايا الجذعية. وعرضت لمحة التعبير عن المسار تركز miRNAs في 3D و 2D hNSCs متباينة مقارنة مع hNSCs غير متمايزة. تم تحديد أهمها تنظيم أسفل miRNAs وتحليلها لتقييم من mRNAs الهدف المفترضة مع القصد من تحديد وظائفها والتفسير البيولوجي باستخدام خوارزميات المتاحة على الانترنت (معمل DIANA، PicTar، وTargetScans). وهناك واحد ميرنا يمكن التعرف على مئات الأهداف، ولهذا السبب نحن التحقق من صحة التفاعلات ميرنا مع 3 &#39;UTR mRNAsthat قد يكون المرشحين المناسبين فيتنظيم xonal. NR4A3، هدفا للهائل سعيد أنعم-مير-7، ومير 17 عائلة، وهو عضو من المستقبلات النووية الأسرة NR4A التي، اعتمادا على مستوى التعبير، وتشارك في التمايز، والبقاء على قيد الحياة، موت الخلايا المبرمج وتنظيم محور عصبي الحصين توجيه 26. وبالمثل SOX5، هدفا لهائل سعيد أنعم-مير-96، ويقال للسيطرة على تقدم دورة الخلية في الأسلاف العصبية 27 طول محور عصبي 28، والهجرة، والتمايز ما بعد الهجرة، والتوقعات من الخلايا العصبية (29). وقد تم تحديد كل من SOX5 وNR4A3 باعتباره مرنا هدفا مباشرا للهائل سعيد أنعم-مير-96، وهائل سعيد أنعم-مير 7 و 17 على التوالي من قبل المزدوجة المقايسات مراسل luciferase المراسل. luciferase المراسل المزدوج (اليراع وRenilla) يعتمد على اثنين من الجينات مراسل مختلفة في نفس بلازميد ويوفر نظام محسن السماح تطبيع للآثار الناجمة عن ترنسفكأيشن دون المستوى الأمثل والآثار السامة للخلايا مقارنة مع نظام بلازميد luciferase المراسل واحد. كجزء من التنمية فحص لدينا نحن أيضا لدينا الأمثل conditi ترنسفكأيشنإضافات من أجل الحصول على كفاءة عالية. وprotocolsdescribed هنا يمكن استغلالها لزيادة تحسين وتميز في المختبر hNSC التمايز التي قد beimplemented بروتوكولات intransplantation للدراسات ما قبل السريرية والتطبيقات السريرية في المستقبل.

أبحاث الخلايا الجذعية يلعب دورا مركزيا في الطب التجديدي، الذي يمتد أيضا تخصصات هندسة الأنسجة، بيولوجيا الخلايا في النمو، والعلاجات الخلوية، والعلاج الجيني، والمواد الحيوية (السقالات والمصفوفات). والخلايا الجذعية هي مهمة في كل من هيئة إصلاح الأنسجة للتنمية المشتركة. فهم كيفية عمل الخلايا الجذعية هي محوريا لتطوير العلاج بالخلايا الجذعية الجديدة القائمة 1. CTX0E03 هو نسيلي، الخلايا الجذعية العصبية البشرية خلد مشروط (hNSC) خط 2 معزولة عن الأشهر الثلاثة الأولى القشرة الجنين الإنسان. وقد حددت CTX0E03 خصائص الجودة التي لا غنى عنها للأعمال المصرفية خلية السريري تحت الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) 3. يمكن HNSCs التفريق بصورة عفوية إلى الخلايا العصبية، الدبقية، و oligodendrocytes ولقد ثبت لتحسين العجز العصبية عند زرعها في نموذج القوارض من البؤري نقص التروية 2،4،5. وCTX0E03 hNSCs حاليا في التجارب السريرية للسكتة الدماغية disabilإيتي (NCT01151124 6 و NCT02117635، Clinicaltrials.gov). MiRNAs لديها متوسط ​​22 النيوكليوتيدات في الطول وثبت الجزيئات التنظيمية 7، فإنها لا ترميز البروتينات، وإنما ربط 3 المنطقة غير مترجمة الأولى (3&#39;UTR) من من mRNAs، وتنظيم استقرارها وترجمتها إلى بروتينات. وتفيد التقارير MiRNAs للمشاركة في تنظيم عدد من العمليات الخلوية، بما في ذلك تطوير وانتشار الأسلحة، والتمايز 8. قد تورطت عدة miRNAs في تنظيم مصير ومواصفات من الخلايا الجذعية العصبية 9. في اثنين من الأبعاد (2D) بيئة ثقافة القياسية لم يتم تطابق تعقيد البيئة في الجسم الحي، وبالتالي تحريض وتنظيم hNSC التمايز ليس الأمثل. في الجسم الحي، وتحاط الخلايا من الأبعاد (3D) المكروية ثلاثة ألحان الآخر الخلايا ويغاندس خارج الخلية، بما في ذلك العديدأنواع الكولاجين، laminin، والبروتينات المصفوفة الأخرى (المصفوفة خارج الخلية، ECM). وأفادت دراسات سابقة أن تضاريس المعماري من المواد محاكاة موبينيل والنفوذ الهندسة خلية النمط الظاهري ومصير 10-15. يتوفر عدد من السقالات 3D المتاحة تجاريا. كنا سقالة البوليسترين المسامية العالية هندسيا مع بنية محددة جيدا وموحدة في غشاء سميك 200 ميكرون والتي توفر مساحة 3D في الخلايا التي يمكن أن تغزو وتفرق 16-18. وتستخدم هذه الوثيقة 2D و 3D المقايسات التمايز لتقييم axonprocess ثمرة. وعلاوة على ذلك، نحن تصف طريقة لمحة عن التعبير ميرنا من خط الصف hNSC السريري لمواصلة التحقيق آثار ميرنا على التمييز بينه و. وتستند هذه الأساليب في هنا يتضح على تلك المذكورة أصلا في 19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) قادرة على تجديد الذات والتمايز في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes تحت microenvironments محلية محددة. هنا، نقدم مجموعة من الأساليب المستخدمة لثلاثي الأبعاد (3D) التمايز وتحليل ميرنا من الخلايا الجذعية العصبية البشرية (hNSC) خط نسيلي، حاليا في التجارب السريرية للسكتة الدماغية العجز (NCT01151124 وNCT02117635، Clinicaltrials.gov). وقد استمدت HNSCs من وافق الأشهر الثلاثة الأولى القشرة الجنين الإنسان الأخلاقية وخلد مشروط باستخدام التكامل فيروسات من نسخة واحدة من ج-mycER TAM بناء. نحن تصف كيفية قياس عملية محور عصبي ثمرة hNSCs متباينة على السقالات 3D وكيفية قياس التغيرات المرتبطة بها في التعبير ميرنا باستخدام PCR مجموعة. وعلاوة على ذلك نحن مثالا التحليل الحسابي بهدف اختيار ميرنا الأهداف المفترضة. وقد تم تحديد SOX5 وNR4A3 كهدف المفترضة ميرنا مناسبة المحدد بشكل كبير أسفل تنظيمmiRNAs التطوير في hNSC متباينة. تم إجراء ميرنا التحقق من صحة الهدف على SOX5 وNR4A3 3&#39;UTRs التي كتبها المزدوج ترنسفكأيشن مراسل البلازميد والمزدوجة luciferase المراسل الفحص.

في الشكل رقم 1 هو تصور التحقيق النوعي والكمي لhNSC التمايز على السقالات 3D مقارنة مع الثقافات سطح مسطح التقليدية (2D) وexpressedas محور عصبي القياسات العملية ثمرة. في الشكل 2 هو representedthe سير العمل والنتائج لتقدير ميرنا باستخدام الخلايا الجذعية ومسارات تنموية تركز ميرنا PCR مجموعة للتحقيق في التعبير التفاضلية من miRNAs في 2D و 3D hNSCs متباينة مقارنة مع السيطرة غير متمايزة. وقد تم تحديد التالية ميرنا تحليل مقارن بين hNSCs المتباينة وغير متمايزة، والتحليل الحسابي للتنبؤ الهدف، SOX5 وNR4A3 (NOR1) كما من mRNAs الهدف المفترضة. لدراسة التفاعل المباشر بين miRNAs والموقع المفترض بهم على 3&#39;UTR مرنا استخدمنا 2 متوفر تجاريا البلازميدات تحتوي إما SOX5 أو تسلسل NR4A3 3&#39;UTR إدراج المصب من يراعة luciferase مراسل الجينات، وهو<html> الثانية تحتوي في نفس بلازميد renilla luciferase المراسل الجيني للتطبيع. يتم تقديم نتائج ممثلة من 3 &#39;UTR luciferase النشاط أسفل تنظيم في الشكل (3). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> الشكل 1: تمايز hNSCs على السقالات 3D، وقياس ثمرة عملية محور عصبي وفاق (A) وبعد تلطيخ ICC القياسي لβ3 تويولين (الخضراء) ونوى counterstained مع هويشت (الأزرق) microphotographs تمثيلي تم الحصول عليها وكان قياس العمليات محور عصبي يقوم بمساعدة برمجيات تحليل الصور. (ب) رسم تخطيطي الإبلاغ عن قياس عملية محور عصبي ثمرة أجريت في 2D و 3D hNSCs متباينة ل1 (1W) أو 3 أسابيع (3W).كوم / الملفات / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> تم استخراج سير العمل التخطيطي التنميط ميرنا في hNSCs متباينة مجموع RNA، بما في ذلك miRNAs، إما من hNSCs متباينة على السقالات 3D والثقافات 2D القياسية، أو السيطرة غير متمايزة: الرقم 2. وكان 250 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الرجعية كتب مع طريقة تسهل تحويل الانتقائي للmiRNAs ناضجة في [كدنا مناسبة لميرنا الكمي مع تمايز الخلايا البشرية والتنمية miScript ميرنا PCR مجموعة. تم استخدام متوسط-جغرافية للSNORD61، SNORD68، SNORD72، SNORD95، SNORD96A، وRNU6-2 لتحليل البيانات استنادا إلى طريقة 2 -ΔΔct. وقد تم تحديد تغييرات كبيرة كما +/- 1.5 طيها والتنظيم وصولا الى ستاحد كبير tistically. وقد تم تحليل البيانات باستخدام البرمجيات على شبكة الإنترنت متاحة في نتائج يتم التعبير باعتبارها clustergram. تعديل من الشكل (3) (19). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> الشكل 3: التحقق من صحة الهدف ميرنا وتوقع مرنا باستخدام مزدوج luciferase المراسل تقرير الفحص. (A) رسم تخطيطي ممثل المزدوج luciferase المراسل البلازميد مراسل استخدامها كأداة للتحقق من صحة تسلسل 3&#39;UTR كهدف مباشر لميرنا. (ب) صورة مجهرية الممثل تظهر كفاءة ترنسفكأيشن. (C) &#160; الإشارات، يعبر عنها luciferase النشاط النسبي، من الإنسان 3 &amp; #وقد طرقت صحفيين UTR ofSOX5 وNR4A3 الجينات بشكل كبير بانخفاض في وجود هائل سعيد أنعم-مير-96، وهائل سعيد أنعم-مير 7 و 17 يحاكي ميرنا على التوالي؛ 39. تعديل من الشكل 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> ميرنا </td><td> الجين المستهدف </td><td> المواقع المستهدفة / الجينات وجدت </td><td> دقة </td><td> أحرز هدفا </td><td> إجمالي P CT </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;td&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير 302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير 182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير-20A </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><stronز&gt; هائل سعيد أنعم-مير 20B </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير-20A </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير 20B </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> هائل سعيد أنعم-مير-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> الجدول 1: قائمة ميرنا من mRNAs التنبؤ الهدف. الجدول تمثيلي من miRNAs، تستهدف جينات التنبؤية، وتحليل الخوارزميات (التنبؤأيون / درجة / مجموع المباراتين المقدمة باستخدام مختبر ديانا، PicTar، وTargetScan على التوالي). تعديل من الجدول 3 19.

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes at JoVE.com

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.8K Views.  ReNeuron. With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Video: Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

زراعة متعددة القدرات البشرية والعصبية الخلايا الجذعية في نظام زراعة الخلايا المغلقة للبحوث الأساسية وقبل السريرية

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

تحليل الناجم عن حمض الريتينويك العصبية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الهيئات مضغي اثنين وثلاثة الأبعاد

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

العدوى بفيروس زكى من الخلايا الجذعية العصبية في مخ الجنين البشري مثقف لتحليل إيمونوسيتوتشيميكال

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

التقديم ثلاثي الأبعاد وتحليل إيمونولابيليد، أوضح البشري شبكات الأوعية الدموية فيلوس المشيمية

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

الثقافات أورجانوتيبيك ثلاثي الأبعاد للأجهزة الحسية السمعية والدهليزيه

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...