تحليل التدفق الخلوي لمعلمات الميتوكوندريا المتعددة في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالإنسان ومشتقاتها العصبية والدبقية

يوفر بروتوكولنا للعالم أداة قوية للزواج من معلمات دقيقة متعددة على مستوى خلية واحدة من IPS البشري ومشتقاته العصبية والواضحة. تسمح هذه البروتوكولات بمرح معلمات الميتوكوندريا ، سواء على المستوى الكلي أو المستوى المحدد لكل حجم ميتوكوندريا ، باستخدام قياس التدفق الخلوي. يمكن تطبيق هذه التقنية على عدة أنواع من الخلايا بما في ذلك تلك الناتجة عن الأمراض العصبية التنكسية الأخرى.

لذلك ، يمكن أن يساعد في توفير نظرة ثاقبة على الآليات الكامنة وراء هذه الأنواع من الأمراض وأيضا يحتمل أن يساعد في الفحص العلاجي. للبدء ، قم بزرع الخلايا بشكل منفصل في أربعة آبار في صفيحة من ستة آبار واحتضن الخلايا حتى يتم تحقيق التقاء بنسبة 50 إلى 60٪. في نهاية فترة الاستزراع ، قم بإعداد خمسة حلول تلطيخ فردية تحتوي على مجموعات مختلفة من وسط الثقافة ، FCCP ، TMRE ، MTG ، و MITO جورب الانتشار.

أضفها إلى الآبار المعنية، واحتضن الخلايا كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك ، استنشق الوسط من جميع الآبار واغسله باستخدام PBS. لانفصال الخلايا ، احتضن الخلايا بملليلتر واحد من كاشف تفكك الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

تحييد كاشف تفكك الخلية مع ملليلتر واحد من DMEM ، مع استكمال 10 ٪ FBS. ثم جمع محتوى البئر في أنبوب وقائع 15 ملليلتر. قم بتكوير الخلايا عن طريق التركيز وغسل حبيبات الخلية باستخدام PBS مرة أو مرتين.

استنشق كل السوبرناتانت ، تاركا ما يقرب من 100 ميكرولتر في الأنبوب. أعد تعليق كريات الخلايا في 300 ميكرولتر من PBS. بعد نقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر ، احتفظ بالأنبوب في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

قم بتحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي باستخدام إعدادات مرشح تمرير النطاق الموضحة في مخطوطة النص. افصل ما يقرب من 1 مليون خلية باستخدام كاشف تفكك الخلايا وقم بتكسير الخلايا كما هو موضح سابقا. قم بتحييد تعليق الخلية باستخدام DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS وجمع التعليق في أنبوب 15 ملليلتر.

إصلاح الخلايا مع ملليلتر واحد من 1.6 ٪ paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تخلل الخلايا مع ملليلتر واحد من الثلج البارد 90٪ الميثانول عند ناقص 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بحظر العينات في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت المانع ، واغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام PBS ، كما هو موضح.

للكشف عن مجمعات الميتوكوندريا المختلفة والوحدات الفرعية ، احتضن الخلايا لمدة 30 دقيقة مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة الموضحة في مخطوطة النص. بعد غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، احتضن الخلايا بجسم مضاد ثانوي لمدة 30 دقيقة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا و PBS وأعد تعليقها كما هو موضح.

انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر ، محفوظ في الظلام على الجليد. بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا الموجودة على مقياس التدفق الخلوي واكتشاف الإشارات وتصفية واحدة باستخدام مرشح تمرير النطاق 5 30/30. لكل مجموعة فرعية من الخلايا ، حدد مخططا بيانيا وقم بتحليل متوسط كثافة التألق أو MFI لقنوات التصفية المختلفة.

احسب مستويات TMRE ، والقيم المحددة للوحدة الفرعية المعقدة MMP ROS و TFAM ، كما هو موضح في مخطوطة النص. تم استخدام قياس التدفق الخلوي والخلايا الحية للتحقيق في حجم الميتوكوندريا MMP ومستويات ROS. في الخلايا العصبية POLG DA ، لوحظ انخفاض MMP محدد و ROS محدد أعلى ، في حين لم تحدث تغييرات في حجم الميتوكوندريا ، وإجمالي MMP و ROS.

انخفضت الخلايا النجمية POLG MMP ، ولكن لم يحدث أي تغيير في حجم الميتوكوندريا و ROS. تم استخدام قياس التدفق الخلوي والخلايا الثابتة للتحقيق في مستوى الوحدة الفرعية المعقدة MRC و TFAM. أظهرت الخلايا العصبية DA زيادة معقدة واحدة و TFAM مقابل السيطرة ، ولكن لا يوجد تغيير في المستوى الثاني المعقد.

أظهرت الخلايا النجمية POLG انخفاضا في مجمع واحد أربعة و TFAM محددة. نظرا لأن كثافة الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على MMP والعلاقة بين MTG و MMP الفلورية ، فهذا خاص بالخلية. من المرجح أن يتطلب تكييف هذا البروتوكول مع أنواع الخلايا الأخرى التحسين بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء ASIS القائم على المجهر ، على سبيل المثال ، المجهر البؤري ، مما يوفر تفاصيل إضافية عن هياكل الميتوكوندريا.

لذلك ، في حين أن هذه الاستراتيجية تكتشف خلل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية DA والخلايا النجمية من مرض الميتوكوندريا المعروف ، يمكن أيضا تطبيق هذه التقنيات لاستكشاف وظيفة الميتوكوندريا في أي نوع من الخلايا والأمراض.