وأيد هذا العمل من المنح NIH AI56168، ​​AI71142، AI87541 وAI100631 إلى MDP. ماوريتسيو ديل POETA هو بوروز ويلكوم باحث في مجال الأمراض المعدية.

1. الكولسترول استنفاد الخلايا J774A.1 مع MβCD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 5 J774A.1 الخلايا الشبيهة بلعم لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S). احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام من أحادي الطبقة الخلية وغسل الخلايا مرتين مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تم تصفيتها أو تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من حل MβCD في تركيز (10 ملم أو 30 ملم في PBS) أو برنامج تلفزيوني 1X على النحو المرغوب فيه السيطرة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C مع اهتزاز. إزالة طاف والاحتياطي في RT للتحليل الكمي مع عدة المتاحة تجاريا باتباع الإجراء على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين إلى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X أو المصل DMEM مجانا وتواصل مع العدوى أو ليز الخلايا عن طريق pipettiنانوغرام مرتين إلى ثلاث مرات مع H 2 O منزوع الأيونات لتحليل مع طبقة رقيقة اللوني أو مع عدة. ملاحظة: بعد نضوب الكولسترول والمتاحة تجاريا عدة الكولسترول الكمي يمكن استخدامها. انظر القسم المواد للحصول على التفاصيل. اتبع تعليمات الشركة الصانعة كما هو مكتوب. </li></ol> 2. مراقبة من الكولسترول المحتوى من قبل اللوني طبقة رقيقة (TLC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خزان TLC مرتين مع الأسيتون ومرة ​​واحدة مع محلول الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم). تشبع الخزان مع الأثير البترول: ايثر: حمض الخليك (65: 30: 1 من حيث الحجم) حل وترك O / N. ملاحظة: يجب دائما العضوية المذيبات أن تستخدم تحت غطاء الدخان لمنع استنشاق بخار. يجب ارتداء القفازات ومعطف المختبر في جميع الأوقات. حمض الخليك هو حمض قوي وينبغي أن تستخدم بحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 6 J774A.1 مثل بلعم الخلايا لكل بئر على م 6-جيدالوحة الثقافة ليرة لبنانية في حجم 5 مل من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4، استبدال 1 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من التربسين-EDTA إلى كل بئر، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية، وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب microfuge وإضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ج وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر إضافية من DMEM الدافئة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S إلى الخلية بيليه و resuspend بعناية من قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا والعد الخلايا على عدادة الكريات. تطبيع تركيزات خلية من كل عينة وإضافة عدد متساو من الخلايا لأنابيب زجاجية. ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن للمرءاختيار الجمع بين الخلايا من مجموعات العلاج نفسه للحصول على أكثر تركيزا النهائي استخراج الدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT وإزالة وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل من الميثانول ودوامة. ثم، إضافة 1 مل من الكلوروفورم ودوامة. التحقق من حالة المرحلة للتأكد من الحل في الطور. ملاحظة: أنابيب يمكن تخزينها في 4 درجات CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة في RT ونقل طاف لأنبوب جديد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل إضافية من كلوروفورم تليها 1 مل من درهم 2 O. دوامة مرتين لمدة 30 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن أنبوب زجاجي على ميزان حساس واستخدام ماصة باستير الزجاج لنقل المرحلة الدنيا في أنبوب زجاجي من الوزن المعروفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف أسفل الدهون في المبخر الطرد المركزي حتى تجف (حوالي 2 ساعة). تزن أنبوب مع الدهون المجففة وحساب الوزن الدهون الجاف. ملاحظة: الدهون الجافة يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لأداء TLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الدهون المجففة في الكلوروفورم يكفي لتطبيع تركيز الدهون (عادة 20-50 ميكرولتر) وتحميل 20 ميكرولتر من الدهون المخففة على TLC لوحة السيليكا. تحميل 20 ميكروغرام من الكولسترول مخففة في 20 ميكرولتر من كلوروفورم كمعيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المجففة لوحة TLC إلى خزان TLC المشبعة والسماح مذيب للهجرة يصل إلى 1 سم قبل وحة الحافة. إزالة TLC لوحة من دبابات واتركه حتى يجف حوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور الدهون عن طريق وضع في خزان بخار اليود للتحقق الهجرة. إزالة البقع والسماح لتتلاشى لحوالي 10 - 15 دقيقة تحت غطاء محرك السيارة. ملاحظة: اليود هو خطر استنشاق. استخدام دائما تحت غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل لتلطيخ محايد الدهون عن طريق الجمع بين 60 مل من الميثانول مع 60 مل من H 2 O منزوع الأيونات، 4 مل من حمض الكبريتيك، و 630 ملغ من كلوريد المنغنيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية وببطء تراجع لوحة TLC في حل الدهون تلطيخ محايد في علبة وازالة دون النزع قبالة السيليكا لآير. ملاحظة: الحل الدهون تلطيخ محايد يمكن إعادة استخدامها عدة مرات وبحيث يمكن استرجاعها من علبة وضعها مرة أخرى في زجاجة لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح لوحة لتجف تحت غطاء محرك السيارة في RT حتى اختفت جميع فقاعات. تسخين لوحة TLC على مجموعة كتلة الحرارة إلى 160 درجة مئوية، وشار إلى اللون المطلوب. ملاحظة: برنامج قياس كثافة مثل LS الرؤية الأشغال يمكن استخدامها لقياس العصابات المتفحمة لمقارنة عينات الدهون. </li></ol> 3. إصابة الضامة مع C. الأدعومية (H99) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية العقيمة، والبذور 10 خلايا تشبه البلاعم 5 لكل بئر على 96-جيدا لوحة زراعة الخلايا في 200 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 5٪ CO 2 O / N. ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم العدوى في الزجاج القاع أطباق مبائر لتسهيل التصوير. لا تزال جميع المبالغ نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة C. الأدعومية (H99)، فحقن 10 مل من YNB مع مستعمرة واحدة تم الحصول عليها من لوحة ضرب واحتضان أنه O / N عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل والاعتماد C. الأدعومية (H99) الخلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي C. الأدعومية O / N الثقافة في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام وتجاهل. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني ويغسل مع 5 مل من تصفيتها برنامج تلفزيوني 1X. الطرد المركزي في 1،700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة 2 مرات أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS و resuspend في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل التخفيف المتسلسل في برنامج تلفزيوني للحصول على 1: 500 التخفيف من ثقافة غسلها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العينة الأصلية إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول 1:10 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر 1:10 عينة المخفف إلى 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 100 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 1: عينة المخفف 100 إلى 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X للحصول على 1: 500 dilutiفي </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 10 ميكرولتر من 1: 500 التخفيف والاعتماد على عدادة الكريات لحساب عدد من الخلايا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل يعملون لتفعيل الضامة وopsonizing C. الأدعومية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع LPS وIFNγ 100X من الحلول الأسهم من خلال إضافة 10 ميكرولتر إلى 990 ميكرولتر. وتستخدم LPS وIFNγ لتعزيز امتصاص أكلة ولكن ليست مطلوبة لالبلعمة: ملاحظة. إذا كان هناك مصلحة في النشاط فطريات الضامة، نفذ تفعيل O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قبل الإصابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في عينة الجمع بين 7.5 ميكرولتر من LPS المخفف، 1.25 ميكرولتر من المخفف IFNγ، 1.25 ميكرولتر من GXM الأجسام المضادة وحجم C. ثقافة الأدعومية الذي يعطي 1.25 × 10 5 الخلايا. جعل حجم ما يصل الى 250 ميكرولتر مضروبا عدد العينات مع DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة واحتضان الحل لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز. ملاحظة:نضوب الكولسترول (الخطوات 1،2-1،4) يمكن أن يتم بالتزامن مع خطوة طهاية. تأكد لعلاج الضامة قبل الجمع بين حل العاملة، حيث أن خلايا opsonized يجب أن تستخدم على النحو الأمثل لم يعد من 20 دقيقة بعد الحضانة خطوة 3.4.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصابة الضامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضامة غسل مرتين مع المصل DMEM الحرة وإضافة 200 ميكرولتر من opsonized C. حل الأدعومية العمل على كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإصلاح وصمة عار الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام وغسل الخلايا 2 مرات مع DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف أحادي الطبقة خلية لمدة 10 دقيقة وإضافة 200 ميكرولتر من الميثانول الجليد الباردة لإصلاح الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة في RT وإزالة أي الميثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 10X بالغيمزا واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 2-3 مرات مع الماء منزوع الأيونات وO جاف / N مع غطاء قبالة. ملاحظة: التصوير يمكن القيام به في اليوم التالي أو ما يصل إلى followi الأسبوعنانوغرام تلطيخ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور وعدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر، عد 300 خلية لكل نقطة بيانات (إذا كان هناك 2 من نفس المعاملة العد 150 لكل بئر) ولاحظ عدد من الضامة المصابة وعدد الخلايا المستخفية اجتاحت. ملاحظة: لضمان حتى أخذ العينات في استخدام نقطة بيانات لوحات 2 في حالة، واختيار 3 مناطق غير متداخلة في لوحة وتعول 50 خلية في المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب مؤشر أكلة بضرب النسبة المئوية للالضامة المصابة حسب متوسط ​​عدد C. الأدعومية في البلاعم. تطبيع مؤشر أكلة بالإعراب عن القيم كنسبة مئوية من برنامج تلفزيوني 1X تعامل السيطرة. بعد عدة محاكمات حساب القيمة المتوسطة والانحراف المعياري للمتوسط ​​لتحديد الاتجاهات في مؤشر البلعمة. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الميكروسكوب من الخلايا في 1،000X أو 400X التكبير. </li></ol></li></ol> 4. التريبان الأزرق الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة معقمة للسلامة الأحيائية، والبذور 10 6 خلايا تشبه البلاعم لكل بئر على 6 جيدا لوحة الثقافة خلية في حجم 5 مل من Dulbecco والحد الأدنى من المتوسط ​​ضروري (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين . احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستنفدة الضامة الكولسترول باتباع الخطوات 1،2-1،4 استبدال 2 مل لمدة 200 ميكرولتر عند الاقتضاء لحساب حجم جيدا أكبر. ملاحظة: تأكد من تضمين عنصر تحكم تعامل مع برنامج تلفزيوني 1X فضلا عن التحكم التي يتم كشط قبل أي علاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من 1X PBS إلى كل بئر وكشط بلطف الخلايا مع مكشطة الخلية. نقل إلى أنبوب microfuge وتعليق الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 ميكرولتر من الخلايا وصمة عار مع 1 ميكرولتر من 4٪ التريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا على عدادة الكريات وحساب الجدوى باستخدام المعادلة التالية:٪ الجدوى = [1 - (خلايا الأزرق / مجموع الخلايا)]س 100. القيم تطبيع إلى عنصر التحكم الذي كان دون علاج. بعد عدة محاكمات حساب قيمة المتوسط ​​والانحراف المعياري لتحديد الاتجاهات في قدرتها على البقاء. استخدام الطالب اختبار t لتحديد أهمية. </li></ol>

<ol>
	<li>Sarantis, H., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+phagocytosis+for+pathogen+survival.">Subversion of phagocytosis for pathogen survival.</a> Cell Host &amp; Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).</li><li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+Of+Membrane+Structures+During+Phagocytosis+And+Chemotaxis+Of+Macrophages:+Role+And+Regulation+Of+The+Actin+Cytoskeleton.">Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton.</a> Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).</li><li>Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanisms+Of+Cryptococcal+Meningitis.">Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis.</a> Virulence. 3, 173 (2012).</li><li>Abadi, J., Pirofski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Antibodies+Reactive+With+The+Cryptococcal+Capsular+Polysaccharide+Glucuronoxylomannan+Are+Present+In+Sera+From+Children+With+And+Without+Human+Immunodeficiency+Virus+Infection.">A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).</li><li>Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+Of+Alveolar+Macrophages+Decreases+The+Dissemination+Of+A+Glucosylceramide-Deficient+Mutant+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Immunodeficient+Mice.">Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice.</a> Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococci+At+The+Brain+Gate:+Break+And+Enter+Or+Use+A+Trojan+Horse.">Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).</li><li>Chr&#233;tien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+Of+Cerebral+Cryptococcus+Neoformans+Infection+After+Fungemia.">Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia.</a> The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).</li><li>Luberto, C., Martinez-Mari&#241;o, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+Of+App1+As+A+Regulator+Of+Phagocytosis+And+Virulence+Of+Cryptococcus+Neoformans.">Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans.</a> The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).</li><li>Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+Roles+Of+Alveolar+Macrophages+In+The+Host+Response+To+Cryptococcus+Neoformans.">Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans.</a> Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rodas, R., Zaragoza, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+Me+If+You+Can:+Phagocytosis+And+Killing+Avoidance+By+Cryptococcus+Neoformans.">Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans.</a> FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).</li><li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intracellular+Life+Of+Cryptococcus+Neoformans.">The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans.</a> Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).</li><li>Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+Of+Cellular+Cholesterol+Interferes+With+Intracellular+Trafficking+Of+Liposome-Encapsulated+Ovalbumin.">Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin.</a> Immunology And Cell Biology. 81, 415-423 (2003).</li><li>Sein, K. K., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Prime+Role+Of+Plasma+Membrane+Cholesterol.">The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol.</a> In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).</li><li>Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+Is+Required+For+Leishmania+Donovani+Infection:+Implications+In+Leishmaniasis.">Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis.</a> Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).</li><li>Tagliari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Microdomain+Components+Of+Histoplasma+Capsulatum+Yeast+Forms,+And+Their+Role+In.">Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In.</a> Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).</li><li>Crane, J. M., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+Of+Cholesterol+In+The+Formation+And+Nature+Of+Lipid+Rafts+In+Planar+And+Spherical+Model+Membranes.">Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes.</a> Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).</li><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+Of+Lipid+Rafts+In+Biological+Membranes.">Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes.</a> Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).</li><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Rafts+And+Signal+Transduction+Nature+Reviews.">Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews.</a> Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).</li><li>Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+Of+Cholesterol+Depletion+By+Cyclodextrin+On+The+Sphingolipid+Microdomains+Of+The+Plasma+Membrane.">Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane.</a> The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+Method+Of+Total+Lipid+Extraction+And+Purification).">A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification).</a> Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li><li>Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+To+Cryptococcus+Neoformans+Glucuronoxylomannan+Enhance+Antifungal+Activity+Of+Murine+Macrophages.">Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages.</a> Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).</li><li>Deshaw, M., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+To+The+Cryptococcus+Neoformans+Capsular+Glucuronoxylomannan+Are+Ubiquitous.">Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous.</a> In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).</li><li>Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea+Treatment+Inhibits+Proliferation+Of+Cryptococcus+Neoformans+In+Mice.">Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice.</a> Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).</li><li>Chaka, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+Of+Phagocytosis+And+Killing+Of+Cryptococcus+Neoformans+By+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+By+Flow+Cytometry.">Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في العمل مع هذا البروتوكول من المهم الحصول على عدد خلايا دقيقة عندما تصفيح خلايا الثدييات وopsonizing C. خلايا الأدعومية. هذا يقلل من التباين بين التجارب ويضمن ودقيقة 1: 1 هدف إلى نسبة المستجيب طوال فترة الدراسة. فمن الأهمية بمكان لتنسيق توقيت استنزاف الكولسترول و...

البلعمة هي العملية التي يتم المنضوية كيانات خارج الخلية من قبل الخلايا المضيفة. بل هو سلاح أساسي في ترسانة النظام المناعي للدفاع ضد مسببات الأمراض، ولكن قد تكون في كثير من الأحيان تخريب العملية التي مسببات الأمراض للسماح لاستيعاب ونشر في جميع أنحاء الجسم 1. وبوساطة البلعمة من قبل العديد من الأحداث يشير إلى أن يؤدي إلى التعلق والغمر عن طريق إعادة ترتيب الهيكل الخلوي الخلية المضيفة. البالعات &quot;الفنية&quot; قادرة على إدراك وربط opsonins على سطح الممرض الغازية للإشارة لمرفق وتشكيل أقدام صفاحية التي تبتلع الممرض وتشكيل يبلوع 2. ومن بين ما يسمى البالعات &#39;المهنية&#39; هم الضامة. الضامة هي خلايا متخصصة للغاية التي تنفذ مهام الحماية التي تشمل السعي إلى القضاء على المرض والعوامل المسببة، وإصلاح الأنسجة التالفة، والتوسط من الالتهاب، ومعظمهذه من خلال عملية البلعمة 1،2. المستخفية المورمة هي الأنواع من الخميرة الممرضة التي تسبب مرض خطير يعرف باسم المستخفيات. يتم استنشاق الجراثيم المستخفية من قبل المضيف ويؤدي الى عدوى رئوية التي عادة ما تكون أعراض. ويعتقد أن التعرض منتشر للغاية. وقد أظهرت عينة من 61 طفلا من الأمراض المعدية للأطفال عيادة في مركز مستشفى برونكس لبنان وجدت أن كل الذين شملهم الاستطلاع كان الأجسام المضادة للglucuronoxylomannan السكاريد بالمستخفيات وغيرها من الدراسات انتشار في كل من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) غير مصاب والبالغين المصابين 3، 4. الضامة السنخية هي الخط الأول للاستجابة للعدوى رئوية واضح في معظم الحالات بنجاح الممرض. ومع ذلك، في الأفراد المناعة (المرضى على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية والإيدز) الخميرة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الضامة. في هذهالحالات، يمكن للالضامة بمثابة محراب للتكرار من مسببات المرض ويمكن أن تسهل نشرها على الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث يصبح المرض قاتلا 5-8. ويعتقد أن الضامة حتى يمكن تقديم الخميرة مباشرة في السحايا، مما يساعد الخميرة لعبور حاجز الدم في الدماغ عن طريق &quot;حصان طروادة&quot; نموذج 3،9 - 11. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم عملية البلعمة والعوامل التي تؤثر عليه، وخاصة في الالتهابات بالمستخفيات. العمل السابق في أنظمة الممرض أخرى تشير إلى الكولسترول والدهون الطوافات التي شكلتها الكولسترول وجود دور هام في البلعمة 12-15. الكولسترول هو النوع الأكثر وفرة الدهون في خلايا الثدييات، وتضم 25 - 50٪ من غشاء الخلية الثدييات 16. وقد وجد أن تلعب دورا في تحوير BIOPخصائص hysical الأغشية عن طريق تغيير صلابة من 17. الكولسترول والإسفنجية تشكل معا microdomains الدهون داخل غشاء المعروفة باسم الطوافات الدهنية. تم العثور على الطوافات الدهنية أن تشارك في تشكيل caveolae، فضلا عن توفير مجال معزولة لأنواع معينة من إشارات 16-18. نظرا لصغر حجمها، فمن الصعب لدراسة الطوافات الدهنية في الجسم الحي. طريقة واحدة مفيدة لدراسة دور الطوافات الدهنية هو تغيير ناخبيهم. الميثيل-β-سيكلودكسترين (MβCD) هو مركب التي تم العثور عليها في استنزاف الكولسترول من الأغشية الثدييات ويستخدم عادة لدراسة دور الطوافات الدهنية 18. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة لاستنزاف الكولسترول من أغشية الخلية المضيفة وقياس تأثير استنزاف على قدرة الخلايا المضيفة في phagocytose C. الأدعومية في المختبر. هذا الإجراء يجعل من استخدام زراعة الخلايا TECHNIQUES على البلاعم خلد مثل خط الخلية (J774A.1) كنموذج للعدوى. تم انجازه استنزاف الكولسترول عن التعرض لMβCD، والذي له نواة مسعور محدد لحجم الجامدة وغير قادرة على بمثابة بالوعة للالكولسترول لاستدراجه للخروج من غشاء 19. وقد تم قياس نضوب الكولسترول كميا باستخدام عدة المتاحة تجاريا ونوعيا باستخدام بلي-داير استخراج الدهن تعديل تليها طبقة رقيقة اللوني (TLC) 20. . تم قياس البلعمة عن طريق إصابة خط الخلية مع ثقافة الخميرة opsonized مختلطة مع كوكتيل من انترفيرون γ وlipopolysaccharide في تفعيل الضامة وopsonized المستخفية باستخدام glucuronoxylomannan (GXM) الأجسام المضادة 21-23. تلطيخ والتجارب المجهري سمحت لرؤية الخلايا وحساب مؤشر أكلة لتقييم درجة البلعمة. أخذت معا، وهذا البروتوكول دescribes طريقة الأساسي الذي يدمج تغيير تركيبة الدهون مع عملية الفسيولوجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="622">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Class II type A2 Biosafety Cabinet</td>
			<td style="width:120px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">3460009</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">J774A.1 cell line</td>
			<td style="width:120px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:167px;">Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11995-065</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4 &#176;C and warm to 37 &#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10082-147</td>
			<td style="width:167px;">Keep frozen at -20 &#176;C and thaw before adding to DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:167px;">Used to suplement DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isotemp Cell culture incubator</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # 3530</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well culture dish</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3595</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">10x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific BioReagents</td>
			<td style="width:119px;">BP3994</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Methyl-&#946;-Cyclodextrin</td>
			<td style="width:120px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:119px;">C4555-10G</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:120px;">Labline</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A12216</td>
			<td style="width:167px;">All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Black Assay plate</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FilterMax microplate reader</td>
			<td style="width:120px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model F5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TLC Chamber</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z126195-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">650498-4L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34860-2L-R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TLC Paper</td>
			<td style="width:120px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">3030917</td>
			<td style="width:167px;">Cut down to size needed for TLC tank</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fume Hood</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6-Well Plate</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3506</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:120px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:120px;">Corning Inc. Costar</td>
			<td style="width:119px;">3010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer&#160;</td>
			<td style="width:120px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1490</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:120px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model Alegra x-30R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Votex Mixer</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-812</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balance</td>
			<td style="width:120px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # MS104S Meaures down to .1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:120px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:120px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">700000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpeedVac Concentrator</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model # SPD2010&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petroleum Ether</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E139-1&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Diethyl Ether</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">309966&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td>
			<td style="width:120px;">Analytical Chromatograhy Millipore</td>
			<td style="width:119px;">1.11845.0001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodine Chips</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">376558-50G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sulfuric Acid</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320501&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Manganese Chloride</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">244589</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">UVP EC3 Imaging System</td>
			<td style="width:120px;">Ultra-Violet Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Bottom Confocal Dish</td>
			<td style="width:120px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.5-10C</td>
			<td>www.glassbottomdishes.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cryptococcus neoformans (H99)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Obtained from Duke University Medical Center</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">YNB</td>
			<td style="width:120px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">239210</td>
			<td style="width:167px;">See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Lipopolysaccharide</td>
			<td style="width:120px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4391-1MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Interferon gamma</td>
			<td style="width:120px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I4777</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Gift from Arturo Casadevall&#39;s Lab concentration is 1.98 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Giemsa</td>
			<td style="width:120px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">194591</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 &#176;C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:120px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

المستخفيات هو عدوى تهدد الحياة التي تسببها الفطريات المسببة للأمراض من جنس المستخفية. تحدث العدوى عند استنشاق جراثيم، والتي هي قادرة على تكرار في الرئة العميقة. البلعمة من المستخفية بواسطة الضامة هي واحدة من الطرق أن هذا المرض هو قادرة على الانتشار في النظام العصبي المركزي لتسبب التهاب السحايا والدماغ القاتل. لذلك، ودراسة العلاقة بين المستخفية والضامة مهمة لفهم تطور العدوى. تصف هذه الدراسة بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة البلاعم العدوى التي كتبها C. الأدعومية في المختبر. باستخدام هذا البروتوكول، ودرس دور الجامدة المضيف على التفاعلات المضيف الممرض. استخدمت سيكلودكسترين (MCD) في استنزاف الكولسترول من الفئران شبكية ساركوما مثل بلعم خط الخلية J774A.1 - تركيزات مختلفة من الميثيل. وأكد استنزاف الكولسترول وكميا باستخدام كل من المتوفره تجاريامواقع الحكومة الإلكترونية عدة الكولسترول الكمي وطبقة رقيقة اللوني. تم تنشيط خلايا الكوليسترول المنضب باستخدام Lipopolysacharide (LPS) والانترفيرون غاما (IFNγ) وإصابة مع opsonized الأجسام المضادة المستخفية المورمة البرية من نوع الخلايا H99 في نسبة المستجيب إلى الهدف 1: 1. تم رصد الخلايا المصابة بعد 2 ساعة من الحضانة مع C. تم حساب الأدعومية ومؤشر على البلعمة. أدى استنزاف الكولسترول في انخفاض كبير في مؤشر البلعمة. البروتوكولات قدمت وتقدم طريقة مريحة لمحاكاة بدء عملية العدوى في بيئة المختبر ودراسة دور تكوين الدهون المضيف على العدوى.

الكولسترول استنفاد تحليل طاف محفوظة في الخطوة 1.3 من البروتوكول باتباع إرشادات الشركة المصنعة في Amplex الأحمر الكولسترول الفحص عدة غلة تركيز مرتفع من الكولسترول في عينة MβCD تعامل على أنها مقارنة بالكنترول برنامج تلفزيوني 1X. اعتمادا ?...

Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K Views.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

Video: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

نضوب بالسكان خلية معينة من قبل استنفاد تكملة

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

نضوب وإعادة إعماره الضامة في الفئران

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recently there were several publications on the bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of the spectrum (400 nm-500 nm) is responsible for killing various pathogens1-5. The phototoxic effect of blue light was suggested to be a result of light-induced reactive oxygen species (ROS) formation by endogenous bacterial photosensitizers which mostly absorb light in the blue region4,6,7. There are also reports of biocidal effect of red and near infra red8 as well as green light9.
In the present study, we developed a method that allowed us to characterize the effect of high power green (wavelength of 532 nm) continuous (CW) and pulsed Q-switched (Q-S) light on Pseudomonas aeruginosa. Using this method we also studied the effect of green light combined with antibiotic treatment (gentamycin) on the bacteria viability. P. aeruginosa is a common noscomial opportunistic pathogen causing various diseases. The strain is fairly resistant to various antibiotics and contains many predicted AcrB/Mex-type RND multidrug efflux systems10.
The method utilized free-living stationary phase Gram-negative bacteria (P. aeruginosa strain PAO1), grown in Luria Broth (LB) medium exposed to Q-switched and/or CW lasers with and without the addition of the antibiotic gentamycin. Cell viability was determined at different time points. The obtained results showed that laser treatment alone did not reduce cell viability compared to untreated control and that gentamycin treatment alone only resulted in a 0.5 log reduction in the viable count for P. aeruginosa. The combined laser and gentamycin treatment, however, resulted in a synergistic effect and the viability of P. aeruginosa was reduced by 8 log's.
The proposed method can further be implemented via the development of catheter like device capable of injecting an antibiotic solution into the infected organ while simultaneously illuminating the area with light.

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

We show that a developed biomedical device involving continuous or pulsed visible laser based treatment that is combined with antibiotic treatment (gentamycin), results in a statistically significant synergistic effect leading to a reduction in the viability of P. aeruginosa PAO1, by 8 log's compared to antibiotic treatment alone.

وتأثير متناغم من الضوء المرئي والجنتاميسين على<em&gt; Pseudomona الزنجارية</em&gt; الكائنات الدقيقة

Recently there were several publications on the  bactericidal effect of visible light, most of them claiming that blue part of  the spectrum (400 nm-500 ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

باستخدام الكيمياء فوق لقياس تأثير عدوى فيروسية في خلية المضيف RNA التجميعي

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

تصور الإيماس غير التحللي من<em&gt; الأدعومية المستخفية</em&gt; من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

التحول Biolistic من نيون معلم جين إلى القناص الفطرية مسببات الأمراض<em&gt; المستخفية المورمة</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA تنقية من داخل الخلية المزروعة<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em&gt; في خلايا البلاعم

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

تقييم آثار المخدرات على أساس الأجسام المضادة على موريني نخاع العظام وتنشيط بلعم البريتوني

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

المسائل الحجم: قياس "القطر كبسولة" في المرسلة بين

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...