وأيد هذا البحث في جزء من المعاهد الوطنية للصحة الجوائز 5T32AI07506، 5R01AI033774، 5R37AI033142، 5R01AI052733.

وقد تم عمل جميع الحيوانات وفقا للوائح ومبادئ توجيهية لمعهد الدراسات الحيوانية في كلية ألبرت اينشتاين للطب. 1. شروط النمو من C. الأدعومية H99 (المصلي A) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النمو الفردي C. الأدعومية (CN) المستعمرات على لوحات أجار سابورو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم واحد قبل التجربة، حدد مستعمرة واحدة وتطعيم 10 مل من مرق سابورو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح ثقافة أن تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تهتز بسرعة 250 دورة في الدقيقة. </li></ol> 2. عزل وإعداد الابتدائية الضامة العظام من C57 / BL6 الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران عن طريق وضع الحيوان في غرفة CO 2 حتى لم يعد التنفس. كإجراء الثاني، خلخل cervically الرقبة قبل البدء في تشريح. تعقيم كامل الجسم، مع 70٪ الكحول الإيثيلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كل عظام الفخذ والساق وعظام في مكان معقم DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنسجة الزائدة والعضلات باستخدام ديlicate تمسح حتى عظام نظيفة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عظام سليمة فقط في طبق بتري تحتوي على 70٪ الكحول الإيثيلي واحتضان لمدة 3 دقائق لقتل الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بها. إزالة العظام وضعها في طبق بتري مع DMEM معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع نهايات العظام بعناية. عقد العظام على مدى فارغة 50 مل أنبوب مخروطي يوضع على الجليد وبعناية دافق 10 مل من DMEM الباردة باستخدام إبرة 25 G من خلال كل العظام. ملاحظة: كل الماوس تسفر 4 عظام (2 عظام الفخذ، tibias 2). ولذلك ينبغي الماوس واحد تسفر حوالي 40 مل من التعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق خلية الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة في 650 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذا الطرد المركزي، وإعداد وفلتر تعقيم العظام نخاع بلعم تغذية وسائل الاعلام التي تتألف من DMEM تستكمل مع 20٪ L929، و 10٪ مصل العجل الجنين، و 10٪ NCTC-109، 1٪ القلم بكتيريا، 1٪ HEPES، 1٪ L-الجلوتامين ، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، 0.1٪ 2 المركابتويثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مما أدى في resuspend بيليه مع 10 مل من تغذية وسائل الاعلام. تمرير suspens خليةايون من خلال مصفاة ميكرون 70 خلية لتعطيل كتل الخلايا وإزالة الأنقاض واسع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 1 مل من تعليق خلية في 10 مل من تغذية وسائل الإعلام في أطباق بتري المحددة للاستخدام زراعة الأنسجة (أي ما مجموعه 10 لوحات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا الالتزام عند 37 درجة مئوية مع 10٪ CO 2. إضافة 5 مل من وسائل الاعلام التغذية الطازجة في اليوم 3. في يوم 7، تحل تماما محل وسائل الاعلام التغذية والضامة جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل التجربة، فصل الضامة من لوحة عن طريق إزالة وسائل الاعلام تغذية وإضافة 5ml من خلية لطيف تجريد كاشف لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وإزالة الضامة مع pipetting لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 650 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه resuspend في 1 مل من تغذية وسائل الاعلام. باستخدام 01:20 التخفيف، وحساب تركيز الضامة قبل pipetting 10 ميكرولتر من تعليق خلية في الصعود إلى haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 14 مم الزجاج الى أدنى مستوى أطباق بتري، لوحة لتركيز 1 × 10 5 الضامة مباشرة على البئر الداخلي الذي يحمل بحد أقصى 200 ميكرولتر، حتى تأخذ الحذر لعدم تجاوز هذا الحجم كما هو مبين في الشكل 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للخلايا التمسك الزجاج طبق بتري عن طريق وضع الأطباق في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-2 مل من تغذية وسائل الإعلام تستكمل مع LPS في 1 ملغ / مل وIFNg في 500 U / مل وتسمح للخلايا لاحتضان بين عشية وضحاها. </li></ol> 3. المشارك حضانة الابتدائية الفئران الضامة وC. الأدعومية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من التجربة، وإزالة 1 مل من خلايا الخميرة الثقافة وبيليه تلقيح بين عشية وضحاها بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 420 ز س </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة وسائل الإعلام والمنتجات بالمستخفيات خارج الخلية مثل glucuronoxylomannan السكاريد (GXM) في السرعة والوقت المذكورة أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلية resuspend في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وجعل التخفيف 1: 100. ماصة 10 ميكرولتر من رانه التخفيف الصعود إلى haemocytometer والعد الخلايا. إضافة خلايا الخميرة في وزارة الداخلية من 1: 5. على سبيل المثال، إذا كان هناك 1 × 10 5 الضامة / جيد، وجعل تعليق خلية من 5 × 10 6 / مل من اةي وإضافة 100 ميكرولتر من هذا الحل لمبلغ إجمالي قدره 5 × 10 5 سي إن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم محسوب من تعليق خلية بالمستخفيات إلى 1 مل من تغذية وسائل الاعلام مع الأجسام المضادة ماب 18B7 عند تركيز 10 ميكروغرام / مل. احتضان تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تغذية وسائل الاعلام من الزجاج قاع طبق بتري وغسل 1X مع PBS العقيمة. إضافة 100 ميكرولتر من opsonized اةي مباشرة أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للخلايا لاحتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 10٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد المشاركة في الحضانة، والتحقق من أن المجهر الضامة قد استوعبت سي إن. أن ينظر المنضوية، يجب أن ينظر بوضوح خلايا بالمستخفيات داخل حدود البلاعم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X طبق بتري مع برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة أي وجميع extracellulaسي إن ص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-2 مل من تغذية وسائل الاعلام دون إضافة ماب 18B7، ووضع المجهر. </li></ol> الإيماس 4. تصور غير التحللي في الوقت الحقيقي الاستفادة الرقمية الخفيفة المجهر ملاحظة: لتنفيذ هذه التجارب، المجهر الذي يأتي مع غرفة احتضان المرفقة التي تشمل CO 2 التسليم ومطلوب وحدة التدفئة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التجربة، قبل تدفئة الغرفة احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل إلى 37 درجة مئوية. تأكد من أن وحدة CO 2 يقرأ 5٪ في بداية التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القاع مكان الزجاج طبق بيتري على منصة المجهر، مع تغطية غطاء CO 2، وإغلاق جميع الأبواب لضمان عدم هروب الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 10X مع المجهر في مرحلة النقيض من ذلك، التركيز على مجال واضح للالضامة المصابة. بناء على التجربة، تحديد الهدف المستخدمة من قبل عدد الضامة تحتاج إلى دراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد برنامج المجهر لتاكه صورة كل 4 دقائق لفترة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، فإن التجربة قد وصلت الانتهاء وسيكون قد تم جمع ما مجموعه 361 الصور. تصدير هذه الصور كما .jpegs في ضغط 5٪. باستخدام صورة J البرمجيات، وعرض الصور على أنها كومة البصرية في 5 إطارات في الثانية. إذا كان الفيلم يحتاج إلى أن ينظر للنشر أو عرض تقديمي، حفظه إما لافي وسائل التحقق أو ملف اعتمادا على الشكل الذي يعمل بشكل أفضل للمشاهد. </li></ol>

<ol>
	<li>Voelz, K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+Interactions+With+the+Host+Immune+System.">Cryptococcal Interactions With the Host Immune System.</a> Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+interactions+with+macrophages:+evasion+and+manipulation+of+the+phagosome+by+a+fungal+pathogen.">Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen.</a> Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sabiiti, W., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infection+by+the+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans.">Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.</a> Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).</li><li>Bliska, J. B., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathogenic+bacteria+and+fungi+&#8212;+a+case+of+convergent+evolution.">Intracellular pathogenic bacteria and fungi &#8212; a case of convergent evolution.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+and+massive+vacuole+formation+after+Cryptococcus+neoformans+infection+of+murine+macrophages.">Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages.</a> BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell-to-cell+spread+of+a+pathogenic+yeast.">Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast.</a> BMC immunology. 8, 15 (2007).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcus+neoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans+escapes+macrophages+by+a+phagosome+emptying+mechanism+that+is+inhibited+by+Arp2/3+complex-mediated+actin+polymerisation.">The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation.</a> PLoS pathogens. 6 (8), (2010).</li><li>Carnell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+driven+by+WASH+causes+V-ATPase+retrieval+and+vesicle+neutralization+before+exocytosis.">Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis.</a> The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).</li><li>Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+regulates+the+outcome+of+intracellular+macrophage+parasitism+by+Cryptococcus+neoformans.">Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans.</a> Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).</li><li>Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لدينا مصالح مالية منافسة أو نزاعات أخرى من الفائدة.

هنا وصفناها الطريقة التي التفاعلات الفطرية البلاعم يمكن تسجيلها وتحليلها في الوقت الحقيقي على مدى فترة 24 ساعة. لدينا مختبر استخدمت هذا البروتوكول لدراسة العديد من الجوانب الزمنية للإيماس غير التحللي وستستمر في استخدام الوقت الحقيقي المجهر للتأكد من المكونات الشكل...

مراحل العدوى الفطرية بين الخلايا الضامة بالمستخفيات وموثقة جيدا 1-3. بعد أن يتم تناولها من قبل خلايا الخميرة الضامة، قد تحدث مجموعة متنوعة من التفاعلات: لبلعم قد ليز الإفراج عن حمولتها الفطرية في الفضاء خارج الخلية، أو أنها يمكن السيطرة على العدوى عن طريق الحفاظ على خلايا الخميرة في كنف الغشاء الخلوي لها 4. ومع ذلك، منذ عدة سنوات وقد وصفت نتائج جديدة بشكل مستقل من قبل مجموعتين: إيماس غير التحللي، وهي العملية التي والبلاعم شطب بعض أو كافة الخلايا بالمستخفيات في البيئة المحيطة أو خلية المجاورة وكلا المضيف والممرض تبقى قابلة للحياة 5 -8. وقد حاول العديد من الدراسات لفهم الآليات الجزيئية وراء هذا التفاعل ولكن ما زلنا لم يكن لديك فهم كامل حول ما يدفع هذه الظاهرة. القدرة على التقاط الصور في الوقت الحقيقي ومن ثم تحليلها لاحقا تصيب متعددةإد الضامة يسمح احد للإجابة على العديد من الأسئلة حول الخصائص الفيزيائية المحيطة إيماس غير التحللي في ما يخص التوقيت، والقدرة المكانية، وتغير في التشكل وحتى إجهاد الضامة خلال العدوى الفطرية. عن طريق السماح للخلايا أن يضم في بيئة غير قابلة للمقارنة إلى أن من حاضنة، يمكننا أن نلمح طبيعة الديناميكية لل-بلعم الفطرية التفاعلات الخلية. وقد استخدم الباحثون هذه التقنية لدراسة مختلف مكونات هذه العملية. وجاء دور يبلوع في هذه العملية واضحة باستخدام تلطيخ الفلورسنت والأكتين منع وكلاء 9، في حين أن مجموعة أخرى تستخدم هذه الطريقة لإظهار أن إيماس غير التحللي تم حظره في الخلايا والتي كان لها المياه والصرف الصحي nucleating المجالات البروتين حذف 10. كما تم التأكد من تأثير خلوى يشير في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر 11. ولا تقتصر هذه العملية على C. كما لوحظ الأدعومية كما مع المبيضات البيض، anotheص الممرض الفطرية التي لديها القدرة على إصابة 12 الضامة. هذه النتائج هي أمثلة على كيف أن هذا الأسلوب يمكن أن توفر ثروة من المعلومات لمنطقة نحن لا نعرف سوى القليل عنه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sabouraud Dextrose Agar</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:227px;">DF0109-17-1</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sabouraud Dextrose Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0382-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dubelcco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum ( FCS)&#160;</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCTC 109</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21340-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3003 Tissue Culture Petri Dishes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellStripper</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IFN-g</td>
			<td>Roche</td>
			<td>NC 9222016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mAb 18B7</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Non-commerical antibody produced in our lab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy

العديد من إصابة الضامة بواسطة الأدعومية المستخفية جوانب تم دراستها على نطاق واسع واضحة المعالم. ومع ذلك، واحدة تفاعل معين ليست مفهومة بشكل واضح هو إيماس غير التحللي. في هذه العملية، يتم الإفراج خلايا الخميرة في الفضاء خارج الخلية من خلال آلية غير مفهومة أن يترك كل من البلاعم و CN قابلة للحياة. هنا، نحن تصف كيفية متابعة عدد كبير من الضامة المصابة بشكل فردي لفترة العدوى 24 ساعة بواسطة المجهر-ساقطا الوقت. ويعيش الضامة المصابة في غرفة التدفئة مع جو CO 2 تعلق على المجهر التي توفر نفس الشروط حاضنة خلية ثقافة. يمكن المجهر الرقمي الحي تقديم معلومات عن التفاعلات الدينامية بين المضيف والممرض الذي لا يتوفر من الصور الثابتة. القدرة على تصور كل خلية مصابة يمكن أن توفر أدلة حول كيفية التعامل مع الضامة الالتهابات الفطرية، والعكس بالعكس. هذا ط تقنيةسا أداة قوية في دراسة القوى المحركة التي تقف وراء ظاهرة معقدة.

الصور التي تنتج هذه التقنية يمكن تحليلها في مجموعة متنوعة من الطرق لجمع معلومات عما يحدث المحيطة بعد أن هضم خلايا C. الأدعومية. كما رأينا في الشكل رقم 1، هناك ما يقرب من 100 الضامة التي إما أن تكون أو غير مصاب بالعدوى. كل واحدة من هذه الضامة يعطي المشاهد فرص?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy at JoVE.com

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

نحن تصف كيفية تصور macrophage- C. الأدعومية (CN) التفاعل في الوقت الحقيقي، مع التركيز بوجه خاص على عملية إيماس غير التحللي باستخدام المجهر الضوئي الرقمي. باستخدام هذه التقنية بشكل فردي الضامة المصابة يمكن دراستها للتأكد مختلف جوانب هذه الظاهرة.

تصور الإيماس غير التحللي من<em&gt; الأدعومية المستخفية</em&gt; من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

visualizing-non-lytic-exocytosis-cryptococcus-neoformans-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

11.7K Views.  Albert Einstein College of Medicine.  نحن تصف كيفية تصور macrophage- C. الأدعومية (CN) التفاعل في الوقت الحقيقي، مع التركيز بوجه خاص على عملية إيماس غير التحللي باستخدام المجهر الضوئي الرقمي. باستخدام هذه التقنية بشكل فردي الضامة المصابة يمكن دراستها للتأكد مختلف جوانب هذه الظاه...

Video: Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

تقييم نشاط مضاد للفطريات المعزولة من السنخية الضامة التي كتبها متحد البؤر المجهري

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

التحول Biolistic من نيون معلم جين إلى القناص الفطرية مسببات الأمراض<em&gt; المستخفية المورمة</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

عزل وتوصيف وتنقية الضامة من الأنسجة المتضررة من التهاب المتصلة بالسمنة

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

تصور داخل الخلايا المطوقة الاتجار بواسطة عمر Fluorescence التصوير المجهري

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...