Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.

تنبيه: يرجى الاطلاع على ورقة بيانات السلامة (SDS) من جميع المواد الكيميائية المعنية قبل الاستخدام. التجربة فحص المخدرات ينطوي على تجميع ومعالجة المواد النانوية، التي قد يكون لها مخاطر إضافية مقارنة مع نظرائهم الأكبر. يرجى التأكد من أن كل تدابير الرقابة اللازمة لأن تمارس في كافة مراحل التجربة، بما في ذلك استخدام ضوابط هندسية (هود الدخان)، ومعدات الوقاية الشخصية (PPE، على سبيل المثال، والسراويل طول السلامة والأحذية المغلقة اصبع القدم، قفازات مقاومة للمواد الكيميائية، ونظارات السلامة). 1. إعداد الكواشف الكيميائية لفحص المخدرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السلائف ل Au البلاغات التوليف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 30 ملغ من حل الذهب (III) كلوريد (99.99٪ الأساس المعادن النزرة، 30 وزن٪ في مخفف حمض الهيدروكلوريك) في 6.9 مل من الماء عالى النقاء لإعداد 15 ملم من الذهب (III) محلول كلوريد. تحذير: محلول كلوريد الذهب غير قابلة للتآكل ومهيجة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة لتجنب الاتصال المباشر مع العين والجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديssolve 74 ملغ من HSA أو BSA في 1 مل من الماء عالى النقاء لإعداد 74 ملغ / مل من محلول المخزون البروتين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول المخدرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل المبلغ المطلوب من المخدرات، على سبيل المثال، 1.9 ملغ لل(أ) ايبوبروفين، و 2.8 ملغ لل(ب) الوارفارين، 2.3 ملغ لل(ج) الفينيتوين، و 1.5 ملغ لل(د) سلفانيلاميد في 20 ميكرولتر من DMSO لإعداد 450 ملم الحلول الأسهم المخدرات. ملاحظة: يتم تحديد DMSO مثل المذيبات لأن هذه الأدوية الطاردة للماء ولها الفقراء الذوبان في الماء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكواشف الأخرى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 600 ملغ من الكريات هيدروكسيد الصوديوم في 10 مل من الماء عالى النقاء لإعداد 1.5 M من محلول هيدروكسيد الصوديوم. حل 2.4 غرام من اليوريا في 2 مل من الماء عالى النقاء لإعداد 20 M من محلول اليوريا. </li></ol></li></ol> 2. تجميع-قالب البروتين الاتحاد الافريقي البلاغات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HSA قالب-الاتحاد الافريقي البلاغات (HSA-الاتحاد الافريقي البلاغات) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اثنين من قوارير الزجاج، كل منها يحتوي على شريط مغناطيسي الصغير في ذلك، على اثنين من درجة الحرارة منفصلة تحريك مغناطيسي يمكن السيطرة عليهاrers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة حرارة محرك مغناطيسي واحد إلى 60 درجة مئوية، وتسمية قارورة زجاجية على أعلى من ذلك ب &quot;60 درجة مئوية&quot;. في حين يتم الاحتفاظ النمام المغناطيسي الآخرين في درجة حرارة الغرفة (RT) حيث يتم وضع علامة على قارورة زجاجية على أعلى من ذلك بأنها &quot;RT&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من محلول هائل سعيد أنعم، 200 ميكرولتر من الماء عالى النقاء، و 200 ميكرولتر من محلول الذهب (III) كلوريد على كل قارورة مع التحريك المستمر (على النحو 360 دورة في الدقيقة، ما لم ينص على خلاف ذلك) للسماح للتغليف أيونات الاتحاد الافريقي داخل القالب البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق 2 دقيقة، إضافة 20 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم إلى كل قارورة وذلك لتفعيل قدرة الحد من HSA في تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات والبدء في تسجيل وقت رد الفعل ك 0 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل 20 دقيقة، ووضع 50 ميكرولتر من الحلول من كل من العينة إلى لوحة سوداء 384 جيدا وقياس طيف الانبعاث مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية. نموذجي الإعداد المسح: λ السابق = 370 نانومتر، λ م = 410-850 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف محرك مغناطيسي بعد 100 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهدئة قوارير زجاجية تحت الماء الجاري في حوض. الحذر: وقوارير زجاجية ساخنة. ارتداء القفازات المقاومة للحرارة لتجنب حرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم أطياف إصدار ضوئي في كل وقت لكل عينة لاكتساب حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات في ظروف درجات حرارة مختلفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BSA قالب-الاتحاد الافريقي البلاغات (BSA-الاتحاد الافريقي البلاغات) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قارورة زجاجية تحتوي على شريط مغناطيسي الصغير على رأس مغناطيسي. ترك درجة الحرارة درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 200 ميكرولتر من محلول BSA، 200 ميكرولتر من اليوريا، و 200 ميكرولتر من محلول الذهب (III) الكلوريد في قارورة زجاجية مع التحريك المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق 2 دقيقة، إضافة 20 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم لتفعيل قدرة الحد من BSA لتشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات والبدء في تسجيل وقت رد الفعل ك 0 دقيقة. قياس طيف ضوئي من خليط التفاعل ساعة. ملاحظة: يتم قياس الطيف ضوئي من BSA-الاتحاد الافريقي البلاغاتأقل كثيرا لأن معدل تشكيل BSA-الاتحاد الافريقي البلاغات أبطأ من تلك التي HSA-الاتحاد الافريقي في نفس درجة الحرارة بسبب فعاليتها أقل من اليوريا تتكشف البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف محرك مغناطيسي بعد 7 ساعة. رسم أطياف إصدار ضوئي في كل وقت لمعرفة حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات التي كتبها اليوريا تمسخ. </li></ol></li></ol> فحص 3. صغيرة المخدرات الجزيئية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاشة تقارب ملزم النسبي لمختلف الأدوية الجزيئية صغيرة لهائل سعيد أنعم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع خمس قوارير زجاجية، تحتوي كل منها على شريط مغناطيسي في ذلك، على أعلى درجة حرارة يمكن التحكم في عدة نقاط النمام المغناطيسي. تسمية هذه قارورة كما أ، ب، ج، د على التوالي عن كل دواء، وهي ايبوبروفين، الوارفارين، الفينيتوين، وسلفانيلاميد. تسمية واحدة مع HSA النقي عن السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من HSA إلى كل قارورة. إضافة 1 ميكرولتر من محلول الدواء إلى قارورة المقابلة الأربعة. إضافة 1 ميكرولتر من DMSO إلى عنصر التحكم. التبديل على النمام وضبط سرعة الدوران إلى 360دورة في الدقيقة واحتضان لمدة 1 ساعة للسماح للمخدرات ملزمة لهائل سعيد أنعم لإكمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق 1 ساعة، إضافة 200 ميكرولتر من الماء ملي-Q و 200 ميكرولتر من محلول الذهب (III) كلوريد على كل قارورة مع التحريك المستمر. ضبط درجة الحرارة إلى 60 درجة مئوية تحت التحريك المستمر لمدة 10 دقيقة. إضافة 20 ميكرولتر من 1.5 M هيدروكسيد الصوديوم إلى كل قارورة والبدء في تسجيل وقت رد الفعل ك 0 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم بسرعة 50 ميكرولتر من حل من كل قارورة لوحة سوداء 384 جيدا وقياس طيف الانبعاث (النتائج صفت ك 0 دقيقة). تسجيل الأطياف الانبعاثات من كل عينة كل 10 دقيقة. جمع ما لا يقل عن أربعة الأطياف في أربعة زمنية مختلفة، وهذا هو 0، 10، 20، و 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.1.1 - 3.1.4 عدة مرات للحصول على نتائج مع وجود اتجاه ثابت. إيقاف محرك مغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم أطياف ضوئي وقت حل لكل عينة (أ - د، والسيطرة). تحديد كثافة ذروة جميع العينات ومؤامرة ضد الوقت لمقارنة حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات في ديfferent قوالب البروتين محملة بالمخدرات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس ثابت ملزم من دواء معين لهائل سعيد أنعم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.1.1 - 3.1.4. استبدال محلول الدواء مع حلول ايبوبروفين في أربعة تركيزات مختلفة (بما في ذلك عينة التحكم باستخدام HSA فقط بدون تحميل المخدرات). تسمية قارورة زجاجية وفقا لتركيز الدواء تبعا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور 10 دقيقة، يبرد وقوارير زجاجية تحت الماء الجاري في حوض. الحذر: وقوارير زجاجية ساخنة. ارتداء القفازات المقاومة للحرارة لتجنب حرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم 50 ميكرولتر من الحلول المذكورة أعلاه من كل قارورة لوحة سوداء 384 جيدا وقياس طيف الانبعاث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.2.1 - 3.2.3 مرتين أكثر للحصول على آخر مجموعتين من نتائج على تركيزات المخدرات المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف محرك مغناطيسي. رسم أطياف ضوئي وتحليل النتائج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للبيانات الأولية التي تم الحصول عليها في كل دفعة على حدة، رسم أطياف ضوئي كلعينة في برامج مثل برنامج OriginPro ومعرفة كثافة الذروة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ورسم كثافة مضان النسبية [(I 0 - I) / I 0] ضد تركيز الدواء، حيث كنت وI 0 الرجوع إلى كثافة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات التي تشكلت في محملة بالمخدرات هائل سعيد أنعم ونقية هائل سعيد أنعم، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ملزمة ثابت عن طريق تركيب البيانات إلى موقع نموذج واحد ملزم باستخدام المعادلة ميخاليس-مينتن: Y = R ماكس × C / (K D + C)، حيث يشير R كحد أقصى أقصى إشارة ردا على ذلك، C هو تركيز يجند وK D هو ثابت ملزم. تنفيذ هذا البرنامج في مثل OriginPro. حدد تحليل القائمة تركيب اللاخطية المنحنى صالح، ثم حدد وظيفة هيل من النمو / فئة السيني. على إعدادات: الصفحة اختيار وظيفة، انقر فوق يصلح لتظهر نتائج المجهزة. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Solution-Based+Medicinal+Library+Screening+against+Human+Serum+Albumin.">High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin.</a> Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).</li><li>Vuignier, K., Veuthey, J. -. L., Carrupt, P. -. A., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Analytical+Strategy+to+Measure+Drug&#8211;Plasma+Protein+Interactions:+From+High-Throughput+to+In-Depth+Analysis.">Global Analytical Strategy to Measure Drug&#8211;Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis.</a> Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).</li><li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdomain+Ib+Is+The+Third+Major+Drug+Binding+Region+of+Human+Serum+Albumin:+Toward+The+Three-Sites+Model.">Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model.</a> Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).</li><li>Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine-NMR+Experiments+for+High-Throughput+Screening:+Theoretical+Aspects,+Practical+Considerations,+and+Range+of+Applicability.">Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).</li><li>Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).</li><li>Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Design+of+Diflunisal+Analogues+with+Reduced+Affinity+for+Human+Serum+Albumin.">Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin.</a> J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+NMR-Based+Screening+with+Competition+Binding+Experiments.">High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).</li><li>Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correspondence+of+Fatty+Acid+and+Drug+Binding+Sites+on+Human+Serum+Albumin:+A+Two-Dimensional+Nuclear+Magnetic+Resonance+Study.">Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study.</a> Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).</li><li>Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Magnetic+Resonance+of+Hyperpolarized+Fluorine+for+Characterization+of+Protein&#8211;Ligand+Interactions.">Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein&#8211;Ligand Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).</li><li>Salvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boosting+the+Sensitivity+of+Ligand&#8211;Protein+Screening+by+NMR+of+Long-Lived+States.">Boosting the Sensitivity of Ligand&#8211;Protein Screening by NMR of Long-Lived States.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).</li><li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+Dichroism+Spectroscopic+Detection+of+Ligand+Binding+Induced+Subdomain+IB+Specific+Structural+Adjustment+of+Human+Serum+Albumin.">Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).</li><li>Navratilova, I., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragment+Screening+by+Surface+Plasmon+Resonance.">Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance.</a> ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Phase+SPR+Biosensor+for+Efficient+Targeted+Drug+Screening+with+High+Sensitivity+and+Stability.">Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability.</a> Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).</li><li>Lu, Y., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-Nanometre+Sized+Metal+Clusters:+From+Synthetic+Challenges+to+The+Unique+Property+Discoveries.">Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).</li><li>Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+Engineering+and+Controlled+Conversion+for+The+Synthesis+of+Monodisperse+Thiolate-Protected+Metal+Nanoclusters.">Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters.</a> Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).</li><li>Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Sized,+Thiolate-Protected+Gold+Nanoclusters.">Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters.</a> Nanoscal. 2, 343-362 (2010).</li><li>Jiang, D. -. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Expanding+Universe+of+Thiolated+Gold+Nanoclusters+and+Beyond.">The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond.</a> Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).</li><li>Aikens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+Structure+of+Ligand-Passivated+Gold+and+Silver+Nanoclusters.">Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters.</a> J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).</li><li>Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+Activities+of+Subnanometer+Gold+Clusters+(Au16&#8211;Au18,+Au20,+and+Au27&#8211;Au35)+for+CO+Oxidation.+ACS.">Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16&#8211;Au18, Au20, and Au27&#8211;Au35) for CO Oxidation. ACS.</a> ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).</li><li>Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-Protected+Gold+Clusters+Revisited:+Bridging+the+Gap+between+Gold(I)&#8722;Thiolate+Complexes+and+Thiolate-Protected+Gold+Nanocrystals.">Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)&#8722;Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).</li><li>Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+the+Crystal+Structure+of+A+Thiol-Protected+Au25+Cluster+and+Optical+Properties.">Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Highly+Luminescent+Au22(SG)18+Nanocluster.">Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster.</a> J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+at+the+Core&#8211;Ligand+Interface+of+Au+Lipoic+Acid+Nanoclusters+That+Enhances+the+Near-IR+Luminescence.">Oxidation at the Core&#8211;Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence.</a> J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).</li><li>Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Atomic-Level+Strategy+for+Unraveling+Gold+Nanocatalysis+from+the+Perspective+of+Aun(SR)m+Nanoclusters.">An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters.</a> Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).</li><li>Niesen, B., Rand, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+Film+Metal+Nanocluster+Light-Emitting+Devices.">Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices.</a> Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).</li><li>Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-Small+Fluorescent+Metal+Nanoclusters:+Synthesis+and+Biological+Applications.">Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications.</a> Nano Toda. 6, 401-418 (2011).</li><li>Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasmall+Near-Infrared+Gold+Nanoclusters+for+Tumor+Fluorescence+Imaging+in+Vivo.">Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo.</a> Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).</li><li>Archana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-Receptor-Specific,+Non-Toxic,+Near-Infrared-Emitting+Au+Cluster-Protein+Nanoconjugates+for+Targeted+Cancer+Imaging.">Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging.</a> Nanotechnolog. 21, 055103 (2010).</li><li>Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-Assisted+Synthesis+of+BSA-Protected+Small+Gold+Nanoclusters+and+Their+Fluorescence-Enhanced+Sensing+of+Silver(I)+Ions.">Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions.</a> Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).</li><li>Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+Nanocluster+Based+Fluorescent+Sensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Cyanide+in+Water.">Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water.</a> 20, 951-1907 (2010).</li><li>Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+Tumor+Targeting+of+Renal-Clearable+Luminescent+Gold+Nanoparticles:+Long+Tumor+Retention+and+Fast+Normal+Tissue+Clearance.">Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).</li><li>Negishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Loading+of+Small+Aun+Clusters+(n+=+10&#8211;39)+onto+BaLa4Ti4O15+Photocatalysts:+Toward+an+Understanding+of+Size+Effect+of+Co-Catalyst+on+Water+Splitting+Photocatalytic+Activity.">Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10&#8211;39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity.</a> J. Phys. Chem. C. , (2015).</li><li>Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Directed+Synthesis+of+Highly+Fluorescent+Gold+Nanoclusters.">Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).</li><li>Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Stability+Induced+by+Ligand+Binding+Correlates+with+Changes+in+Protein+Flexibility.">Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility.</a> Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).</li><li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+Analysis+of+Ligand-Induced+Changes+in+Protein+Thermal+Unfolding+Applied+to+High-Throughput+Determination+of+Ligand+Affinities+with+Extrinsic+Fluorescent+Dyes.">Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes.</a> Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).</li><li>Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Based+Fluorescent+Metal+Nanoclusters+for+Small+Molecular+Drug+Screening.">Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening.</a> Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).</li><li>Shortridge, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover. , (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هناك العديد من الخطوات الهامة التي تحتاج إلى تسليط الضوء عليها في هذا الأسلوب. في بروتوكول فحص تقارب ملزم النسبي لمختلف الأدوية الجزيئية الصغيرة، خطوات 3.1.2، 3.1.3، 3.1.4 وحاسمة للحصول على نتائج جيدة تظهر اتجاه ثابت لقوة ملزمة النسبية. في هذه الخطوات، يجب أن تصرفات إضافة م...

الالبيومينات المصل مثل الألبومين البشري المصل (هائل سعيد أنعم) وألبومين المصل البقري (BSA) هي البروتين الأكثر وفرة في البلازما وتلعب دورا حيويا في الحفاظ على الضغط الاسموزي للمقصورة الدم. يتم التعرف أيضا على أنها البروتينات الحاملة لجزيئات صغيرة من انخفاض للذوبان في الماء، مثل المنشطات، والأحماض الدهنية، هرمونات الغدة الدرقية، ومجموعة متنوعة واسعة من المخدرات. خاصية الربط (على سبيل المثال، مواقع ملزمة، تقارب أو قوة ملزمة) من هذه الجزيئات إلى المصل الالبيومينات يشكل موضوعا هاما في الدوائية. وقد وضعت 1-4 عدة طرق تحليلية لدراسة خصائص ملزم من الأدوية المختلفة لالمصل الالبيومينات، مثل البلورات بالأشعة السينية، 5،6 الرنين النووي المغناطيسي (NMR)، 11/07 ومأكل سطح الرنين (SPR)، 12،13 الخ ومع ذلك، يتم تقييد هذه الطرق إما عن طريق عملية تحليل شاقة وتستغرق وقتا طويلا (على سبيل المثال، ونمو الكريستال واحد لcrystallo الأشعة السينيةدراسة الرسوم البيانية)، شرط معدات متخصصة ومكلفة (SPR)، أو في حاجة إلى وضع العلامات نظير تكلفة (NMR) للكشف. ولذلك فمن المستحسن للغاية لتطوير طرق بديلة للشركات الصغيرة الجزيئي فحص المخدرات بطريقة سريعة ومباشرة إلى الأمام، وفعالة من حيث التكلفة. nanoclusters الذهب (الاتحاد الافريقي البلاغات) هي نوع خاص من المواد متناهية الصغر، والتي تحتوي على عدة عشرات من ذرات المعدن مع أحجام أصغر من 2 نانومتر. 14-17 وقد اجتذبت اهتمامات بحثية واسعة نظرا لبنيتها الإلكترونية المنفصلة والتي تعتمد على الحجم، 18، 19 وما شابه الجزيئية الجواذب والانبعاثات. 20-23 هذه الخصائص مواد فريدة من نوعها، ولا سيما مضان قوية، وقد وجدت تطبيقات متنوعة مثل الاستشعار عن بعد والتصوير في النظم البيولوجية. 24-32 الصغر الفلورسنت الاتحاد الافريقي البلاغات يمكن توليفها باستخدام بروتينات وظيفية، مثل الالبيومينات مصل، كقالب 33 في توليف البروتين قالب نموذجي ل<html> الاتحاد الافريقي البلاغات، يتم تغليف كمية معينة من الأملاح الاتحاد الافريقي لأول مرة داخل البروتين وخفضت في وقت لاحق من البروتين نفسه. ويعزى القدرة الحد من البروتين لالتأسيسية الوظيفية بقايا الأحماض الأمينية (على سبيل المثال، التيروزين) التي يمكن تفعيلها عن طريق زيادة درجة الحموضة القلوية حل ل. تتكشف من بنية البروتين يعتبر خطوة حاسمة لتشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. هذا هو لأنه في البروتين تكشفت، يمكن أن يتعرض المزيد من المجموعات الوظيفية الحد إلى أملاح الاتحاد الافريقي مغلفة. البروتين تتكشف يمكن أن يتحقق عن طريق المعالجة الحرارية أو التعرض للعوامل تغيير طبيعة. مقدمة من الأدوية الجزيئية الصغيرة يمكن أن تؤثر أيضا على العملية الجارية، أي تعديل درجة الحرارة تمسخ المنتصف والمحتوى الحراري تتكشف. 34،35 تأثير كل هذه العوامل بدورها يمكن أن تنعكس من خلال حركية تشكيل الفلورسنت الاتحاد الافريقي البلاغات والتي تتجلى في كثافة مضان الناتجة الاتحاد الافريقي البلاغات 36 e_content &quot;&gt; هذا الفيديو يوضح طريقة فحص المخدرات عن طريق تجميع الاتحاد الافريقي البلاغات في البروتينات الزلال محملة بالمخدرات في درجة حرارة أعلى (60 ° C) أو في وجود وكلاء تغيير طبيعة (على سبيل المثال، اليوريا). كثافة مضان من الناتج الاتحاد الافريقي البلاغات هي قراءات إشارة أولا، تم تجميعها الاتحاد الافريقي البلاغات في HSA وBSA قوالب العلاج في 60 ° C أو في وجود اليوريا لاظهار كيف البروتين تتكشف (الناجمة عن المعالجة الحرارية أو denaturants) يؤثر على حركية تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. ثانيا، وقد تم تجميع الاتحاد الافريقي البلاغات في قوالب البروتين مسبقة مع الأدوية المختلفة، ودراسة تأثير تحميل المخدرات على كثافة مضان النسبية الناتجة الاتحاد الافريقي البلاغات، والتي توفر مقياس لقوة ملزمة النسبية. وأخيرا، تم تعديل بروتوكول الفحص الاتحاد الافريقي NC-عقار لل القياس الكمي للبروتين المخدرات ثابت ملزم (K D) من خلال تغيير محتوى المخدرات مسبقة في البروتين من تركيز ثابت.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gold (III) chloride solution, 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484385</td>
			<td>Corrosive, irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum albumin, 96%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin, 96%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibuprofen, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4883&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warfarin, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenytoin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulphanilamide, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>RT5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL air displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL air displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL air displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5000 mL Eppendorf tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Eppendorf tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL Eppendorf tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vial with screw cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mL glass vial with screw cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and quantitative fluorimetric method for protein-targeting small molecule drug screening

ونحن لشرح طريقة فحص المخدرات جديد لتحديد تقارب ملزمة للجزيئات الدواء الصغيرة لبروتين الهدف من خلال تشكيل nanoclusters الفلورسنت الذهب (الاتحاد الافريقي البلاغات) في البروتين محملة بالمخدرات، استنادا إلى إشارة التفاضلية مضان المنبعثة من الاتحاد الافريقي البلاغات. ويتم اختيار الألبومين بروتينات مثل الألبومين البشري المصل (هائل سعيد أنعم) وألبومين المصل البقري (BSA)، والبروتينات نموذج. يتم اختبار أربعة أدوية الجزيئية الصغيرة (على سبيل المثال، ايبوبروفين، الوارفارين، الفينيتوين، وسلفانيلاميد) من الانتماءات الملزمة مختلفة لالبروتينات الزلال. وقد وجد أن معدل تشكيل الفلورسنت البلاغات الاتحاد الافريقي داخل بروتين الألبومين المخدرات تحميلها في ظل ظروف تغيير طبيعة (أي 60 درجة مئوية أو في وجود اليوريا) أبطأ من تلك التي تشكلت في البروتين البكر (بدون أدوية). وعلاوة على ذلك، تم العثور على كثافة الفلورسنت من البلاغات كما شكلت لتكون مرتبطة عكسيا مع الانتماءات الملزمة لهذه الأدوية إلى البروتينات الزلال. خصوصا،وارتفاع تقارب البروتين المخدرات ملزمة، وأبطأ معدل تكوين الاتحاد الافريقي البلاغات، وبالتالي لوحظ كثافة مضان أقل من الناتج الاتحاد الافريقي البلاغات. ولشدة مضان من الاتحاد الافريقي البلاغات الناتجة يوفر قدرا بسيطا من قوة ملزمة النسبية للمخدرات مختلفة اختبارها. هذا الأسلوب هو أيضا قابلة للتمديد لقياس ثابت معين من البروتين المخدرات ملزم (K D) ببساطة عن طريق تنويع المحتوى المخدرات مسبقة في البروتين في تركيز البروتين ثابت. تطابق نتائج قياس بشكل جيد مع القيم التي تم الحصول عليها باستخدام هيبة ولكن أكثر تعقيدا وسائل أخرى.

البروتين تتكشف هو إجراء مهم لتشكيل-قالب بروتين الاتحاد الافريقي البلاغات لمجموعات وظيفية أكثر تفاعلا (على سبيل المثال، وبقايا التيروزين) من البروتين يمكن أن يتعرض للحد من أيونات الاتحاد الافريقي مغلفة وبالتالي تسريع وتيرة تشكيل الاتحاد الافريقي البلاغات. الت?...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening at JoVE.com

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

A السريع والكمية Fluorimetric طريقة لاستهداف البروتين جزيء صغير فحص المخدرات

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

a-rapid-quantitative-fluorimetric-method-for-protein-targeting-small

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Views.  Agency for Science, Technology and Research (A*STAR). A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Video: A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

تحسن التصور والتحليل الكمي لتأثيرات الدواء باستخدام خلايا Micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

المبيضات البيض بيوفيلم رقاقة (كاليفورنيا BChip) لالفرز الفائق الإنتاجية مضاد للمخدرات

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

المخدرات التي يسببها-توعية انزيمات محلقة: تبسيط الفحص والتصغير لجزيء صغير وسيرنا تطبيقات الفحص

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Rapid Mix Preparation of Bioinspired Nanoscale Hydroxyapatite for Biomedical Applications

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest regarding the use of bioinspired nanoscale hydroxyapatite (nHA). However, biological apatite is known to be calcium-deficient and carbonate-substituted with a nanoscale platelet-like morphology. Bioinspired nHA has the potential to stimulate optimal bone tissue regeneration due to its similarity to bone and tooth enamel mineral. Many of the methods currently used to fabricate nHA both in the laboratory and commercially, involve lengthy processes and complex equipment. Therefore, the aim of this study was to develop a rapid and reliable method to prepare high quality bioinspired nHA. The rapid mixing method developed was based upon an acid-base reaction involving calcium hydroxide and phosphoric acid. Briefly, a phosphoric acid solution was poured into a calcium hydroxide solution followed by stirring, washing and drying stages. Part of the batch was sintered at 1,000 &#176;C for 2 h in order to investigate the products&#39; high temperature stability. X-ray diffraction analysis showed the successful formation of HA, which showed thermal decomposition to &#946;-tricalcium phosphate after high temperature processing, which is typical for calcium-deficient HA. Fourier transform infrared spectroscopy showed the presence of carbonate groups in the precipitated product. The nHA particles had a low aspect ratio with approximate dimensions of 50 x 30 nm, close to the dimensions of biological apatite. The material was also calcium deficient with a Ca:P molar ratio of 1.63, which like biological apatite is lower than the stoichiometric HA ratio of 1.67. This new method is therefore a reliable and far more convenient process for the manufacture of bioinspired nHA, overcoming the need for lengthy titrations and complex equipment. The resulting bioinspired HA product is suitable for use in a wide variety of medical and consumer health applications.

This paper describes a novel method for the rapid manufacture of high quality bioinspired nanoscale hydroxyapatite. This biomaterial is of great significance in the manufacture of a wide range of innovative medical devices for clinical applications in orthopedics, craniofacial surgery and dentistry.

تحضير مزيج سريع من Bioinspired النانو هيدروكسيباتيت للتطبيقات الطبية الحيوية

Hydroxyapatite (HA) has been widely used as a medical ceramic due to its good biocompatibility and osteoconductivity. Recently there has been interest ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

تحليل الآلي تقلص الإنسان المهندسة القلب الأنسجة للفحص القلب سلامة الأدوية

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

ميكروتيسويس 3D للعلاج عن طريق الحقن بالتجدد وفحص المخدرات الفائق

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

تنقية وتحليل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من خلايا المبيض الهامستر الصينية باستخدام نظام مفاعل ميكروبيوم الآلي

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

تطبيقات للواح الاضاءه المتوافقة مع اللوحة المفتوحة المصدر

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...