Name: protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. اقحي تطور الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المواد النباتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة Medicago truncatula النوع البري Jemalong أو إسوي القريب لها، وإعادة التركيب الوراثي للغاية generable Jemalong 2HA 13 (المعروف باسم 2HA) في البيوت الزجاجية مع الضوئية 14 ساعة و 23 ° C / 19 ° C درجة الحرارة اليوم / ليلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيرس سطح غلاف البذرة (مع وجود 23 G إبرة) قبل بذر البذور بحيث يتم السماح للمياه لدخول البذور ونقع في الماء طوال الليل. إضافة كمية كافية من الماء لتغطية كامل البذور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زرع بذور 3 في كل 15 سم وعاء القطر (ما مجموعه 10 قدور) في خليط بوتينغ (الخشنة الرمل، البيرلايت، جوز الهند الجفت (1: 1: 1)، بالإضافة إلى 5 غرام من Osmocote قياسي بالضبط: بطيئة الافراج الأسمدة) ونقل إلى البيوت الزجاجية. الإبقاء على أصح الشتلات بعد الإنبات حتى لا يكون هناك 1 مصنع في وعاء وتحيط بها تعريشة لمصنع ينبع في الصعود. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حاضن الحصاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع القرون من ثنوع ILD Jemalong أو 2HA للحصول على مراحل الجنين في وقت مبكر المناسبة كما وصفت لأول مرة 9. ملاحظة: يتم عرض المراحل جراب مختلفة في الشكل 1 وتظهر مراحل الجنين المقابلة في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق المراحل جراب مختلفة عند الحصاد باستخدام معايير حسب الجدول 1. قياس الوقت المنقضي من مرحلة 6 للمساعدة في مراحل منفصلة 6 و 7 (الجدول 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح البويضات من القرون والتحقق من مرحلة الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل البويضات من القرون باستخدام ملقط غرامة حدها أو مجهر تشريح ستيريو وملقط حسب الضرورة. إذا لزم الأمر في مرحلة الجنين يمكن التحقق بسرعة باستخدام مركب المجهر القياسي (الشكل 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعد المعدلة حل هوير التي تحتوي على 7.5 غرام الصمغ العربي، و 100 غرام الكلورال هيدرات، 5 مل الجلسرين، 60 مل منزوع الأيونات الماء المقطر. حل عن طريق التحريك لمدة 3-5 ساعة أو طوال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمزيد من صقلد المجهر مسح البويضات تشريح في حل 15،16 تعديل هوير و. اختيار بعناية حتى البويضات سليمة والمكان في حجم صغير من حل هوير و(ما يكفي لتغطية بويضة) في درجة حرارة الغرفة حتى واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض العينات مع تدخل الفرق النقيض (DIC) البصريات. التقاط الصور يؤته على كاميرا رقمية 9 (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البويضات الأكثر موحدة من المنطقة الوسطى من جراب وتتراكم العدد المطلوب. يتم عرض مثال في الشكل 3A. جمع البويضات على الجليد وتخزينها في درجة الحرارة المطلوبة (الأحماض -80 درجة مئوية لمدة النووية) لمزيد من التحليل. ملاحظة: لمزيد من التفاصيل على تحليل المقاطع النسيجية، انتقال المجهر الإلكتروني، والتهجين في الموقع يرجى الاطلاع على الأوراق 8،9. </li></ol></li></ol> 2. الجسدية تطور الجنين في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام M. truncatula الصنف رقبعة قادرة على تشكيل بسهولة الأجنة في الثقافة. لهذا البروتوكول لإإكسبلنتس ورقة استخدام النباتات 2HA 13،17 تكون 2-4 أشهر من العمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ منشورات من أحدث ورقة ثلاثية الأوراق تقريبا توسعت بشكل كامل من جذع التطويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على أوراق ثلاثية الأوراق على رطبة ورقة المناشف في وعاء الثقافة لتجنب الجفاف. ملاحظة: مرة واحدة ويتم حصاد الأوراق ثلاثية الأوراق التي يحتاجونها لاستخدامها بأقل قدر من التأخير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مستنبت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام P4 10: المتوسط ​​5 في أجار (0.8٪ ث:: V) 4: 1 في 9 سم أطباق بتري. ملاحظة: P4 10: 4: 5: 1 المتوسطة يتكون من المتوسط ​​P4 القاعدية 18 بالإضافة إلى 10 ميكرومتر حمض 1-naphthaleneacetic (NAA)، 4 ميكرومتر 6-benzylaminopurine (BAP)، 1 ميكرومتر حمض التسقيط (ABA) و 5 ميكرومتر الجبرليك حمض (GA). استخدام GA + ABA يسرع تشكيل الجنين ويسبب زيادات حقيقية في الجنين الرقم 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل المتوسطة القاعدية P4 في 1 L؛ تتكون من أملاح الكبرى (جعل calciuم بشكل منفصل)، وأملاح بسيطة والفيتامينات (الجدول 3)، والحديد بالكلاب (الماكياج بشكل منفصل)، casamino الأحماض (الكازين حلامة)، 30 غرام السكروز، 8 غ أجار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول تخزين المخزون من أملاح الكبرى والكالسيوم والأحماض casamino والأملاح والفيتامينات طفيفة في -20 درجة مئوية في قسامات مناسبة. تخزين الحديد بالكلاب في 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الحديد بالكلاب (200X) عن طريق إذابة 7.44 غرام من نا 2 EDTA • 2H 2 O في حوالي 900 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات مع التحريك، ثم جعل الحل ل98-99 ° C مع إضافة 1.853 غرام من FeSO 4 • 7H 2 O. أخيرا جعل ما يصل الى 1 L عندما تذوب المكونات. متجر في العنبر زجاجات في 4 درجات مئوية الملونة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل بصل متوسطة P4 مع حلول الأوراق المالية كما في الجدول رقم (4). والهرمونات في المتوسط ​​هي 10 ميكرومتر NAA، 4 ميكرومتر BAP، 1 ميكرومتر ABA، 5 ميكرومتر GA (انظر الجدول 4 ومواد محددة الجدول). إضافة NAAوBAP قبل التعقيم وإضافة ABA وGA بعد التعقيم والتبريد إلى حوالي 55 درجة مئوية، وذلك باستخدام التعقيم مرشح مع مرشح 0.22 ميكرون تعلق على حقنة. مزيج جيد من قبل يحوم طيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط وسائل الإعلام لدرجة الحموضة 5.8 مع 1 M KOH قبل التعقيم. الأوتوكلاف على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التعقيم إضافة عامل تصفية تعقيمها ABA وGA، وتصب حوالي 25 مل من وسائل الاعلام الى معقمة 9 سم أطباق بتري في غطاء تدفق الصفحي أو مجلس الوزراء واقية. بارد، والسماح للأجار مع مجموعة الغطاء. ثم وضعت على غطاء والتأكد من عدم وجود المكثفات على الغطاء. التسمية كما هو مطلوب وتخزينها في 4 ° C (في صندوق من الورق المقوى لمنع غطاء المكثفات). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم ورقة الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل في غطاء تدفق الصفحي تعقيم الأشعة فوق البنفسجية أو مجلس الوزراء واقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان يترك في الكرة شبكة من الشاي المساعد على التحلل الربيع تعقيمها قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج المساعد على التحلل الشاي تحتوي على أوراق في 70٪ (ت: ت) الايثانول في طريق مسدودوعاء البنية لمدة 30 ثانية. ملاحظة: للاستخدام في جميع الخطوات في هذا الإجراء 250 مل المسمار غطاء الأواني الثقافة البولي التي يتم تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف ومن ثم نقل وتزج الأنسجة ورقة في 1: 8 (ت: ت) التبييض المخفف (0.5٪ الكلور) لمدة 10 دقيقة. دوامة بلطف من وقت لآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف التبييض ونقل المساعد على التحلل الشاي في وعاء الثقافة التي تحتوي على الماء المقطر منزوع الأيونات معقمة. دوامة بلطف واستنزاف المياه الزائدة. كرر واحدة لمزيد من الوقت مع وعاء ثقافة جديدة من الماء المقطر منزوع الأيونات معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأوراق من الشاي المساعد على التحلل مع ملقط معقم لوعاء ثقافة جديدة من الماء المقطر منزوع الأيونات معقمة. المسمار على الغطاء العقيمة وشطف التي كتبها قلب ويحوم. ترك الأوراق تطفو على الماء المعقم حتى على استعداد لإعداد إإكسبلنتس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وتصفيح إإكسبلنتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تقنيات معقمة، وتقليم منشورات تعقيم الفردية من الحافة مع مشرط، وقطع مستطيل المتبقية إلى اثنين أو عبتيه ه إإكسبلنتس مستطيلة الشكل (10/8 س 3-5 ملم) مع منتصف الوريد في وسط كل يزدرع (الشكل 5A). ملاحظة: حجم يزدرع مهم جدا في بدء callusing الأول. تنفيذ قطع على الجفن المعقمة من حاويات المواد الغذائية لاتولى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 6 إإكسبلنتس على توطد أجار مستنبت في 9 سم القطر أطباق بتري (الشكل 5B). لوحة لل explants الجانب مجافي المحور وصولا الى الحفاظ على التوجه أوراق المعتاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم أطباق بتري مع parafilm (الشكل 5C) امتدت حول الطبق. النسيج هي الآن جاهزة للحضانة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة الحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في الظلام عند 28 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة التي تسيطر عليها الحكومة أو النمو طوال الفترة الثقافة. ملاحظة: سيتم إإكسبلنتس بدء فقد التمايز، الخضوع لانقسام الخلايا وانتشارها (تكوين الكالس) ومرحلة التطور الجنيني (التمايز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية في expla التفريقاليلة بعد 3 أسابيع إلى متوسطة جديدة. في هذه ثقافة فرعية نقل يزدرع كله باستخدام معقم غير القابل للصدأ ملعقة الصلب وملقط، في غطاء تدفق الصفحي أو مجلس الوزراء واقية. كما يحدث callusing والكالس يتجاوز حجم أكبر واحد في الشكل 5C، ونقل 50٪ من الكالس الفردية عندما subculturing إلى متوسطة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الأجنة الأولى في حوالي 4 أسابيع. في حين أن هناك درجة من التزامن، وجمع مراحل الجنين المختلفة على مدى فترة حضانة 4-8 أسبوع (الشكل 6A، B). جمع تحت المجهر تشريح وعملية وفقا لأهداف تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية كل 3 أسابيع وإزالة الأجنة بشكل دوري بحيث إإكسبلنتس سوف تستمر في إنتاج الأجنة لمدة 3 أشهر. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference.">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li><li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legumes:+importance+and+constraints+to+greater+use.">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li><li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes.">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li><li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses.">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li><li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation.">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li><li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling.">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li><li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo.">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li><li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs.">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li><li>Birnbaum, K. D., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slicing+across+kingdoms:+regeneration+in+plants+and+animals.">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li><li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis.">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li><li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues.">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li><li>Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+seeds+and+embryos+of+Medicago+truncatula+cultured+in+vitro.">Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro.</a> Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).</li><li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

والبروتوكولات المذكورة هي نسبيا على التوالي إلى الأمام وتسمح بالتحقيق في مرحلة التطور الجنيني البقول مع كل خلية المعاصرة والتقنيات الجزيئية. نحن ندرك أن هناك مزايا وعيوب كل من المجراة في النهج المختبر. كلا السماح للمزيد من التركيز على مرحلة التطور الجنيني...

البقول هي ثالث أكبر عائلة من النباتات العليا مع ما يقرب من 20000 الأنواع والفيصلة القرنية (أو الفصيلة البقولية) الأسرة هي الثانية للحبوب في المساحة المحصودة والإنتاج الإجمالي 1. فول الصويا هو ثالث أكبر المحاصيل المزروعة. توفر البقوليات حوالي ثلث البروتين وثلث من الزيت النباتي للاستهلاك البشري 2. البقوليات مع قدرتها تحديد N 2 تسهم أيضا في النظم الزراعية المستدامة. Medicago truncatula، مثل فول الصويا، ومخازن البروتين والزيت في النبتات من البذور والبقوليات هو نموذج الوراثي والجيني مع الموارد الوراثية والجينوم كبيرة 3،4. في حين M. وقد مكن truncatula التقدم في فهم-البقوليات البكتريا العصوية تكافل 4 فقد استخدمت على نحو متزايد لدراسة البيولوجيا بذور البقول 5-7 والتخلق 8،9. تم نبات الأرابيدوبسيس مرحلة التطور الجنيني درس على نطاق واسع 10،11 كنها طسا غير البقوليات وتفاصيل مرحلة التطور الجنيني ليست متطابقة إلى Medicago 8،10. التطور الجنيني اقحي في M. truncatula ديها ميزات مثيرة للاهتمام، مع الغدة النخامية متعددة الخلايا المميزة، وهي suspensor endoployploid ونقل الخلية القاعدية 8. يستخدم مرحلة التطور الجنيني الجسدية (SE) عادة لتجديد النباتات 12. في نموذج البقوليات M. truncatula، خط البذور Jemalong 2HA (2HA) تم تطويره من الوالد Jemalong أن يكون ارتفاع معدلات التطور الجنيني الجسدية 13. وقد تم مؤخرا زيادة عدد الأجنة المنتجة بشكل جوهري بإضافة كل من حمض الجبريليك (GA) وحمض التسقيط (ABA) إلى متوسطة عريقة 14. في هذه الحالة GA والعمل ABA تآزر، وهو أمر غير معتاد نظرا لأن GA وABA عادة ما تتصرف بعدوانية 14. الأجنة المنتجة من الكالس تتطور على السطح الذي يسمح مرحلة التطور الجنيني يتم تحديدها بسهولة بصرياذ وتحصد بسهولة. وجود بالقرب من خطوط إسوي التي تخلقي (2HA) وغير تخلقي (Jemalong) يسهل التحقيق في مرحلة التطور الجنيني الجسدية وجود كل المجراة في أنظمة المختبر يوفر إمكانيات التجريبية المختلفة. فهم الآليات الخلوية والجزيئية لتطور الجنين هو ضروري لبذور التفاهم وتطوير المصنع. في البقوليات، كما هو الحال في الفلقتين أخرى، فمن النبتات من الجنين الذي تخزين المنتجات التي تستخدم لتغذية الإنسان. مرحلة التطور الجنيني المبكر ينطوي على انقسام الخلايا السريع والصحيح الجنين الزخرفة. في بعد حوالي 8 أيام الإخصاب، M. truncatula الجنين تصل إلى مراحل فلقة في وقت مبكر. لا يتم الإشارة إلى الخصائص المورفولوجية بالضبط قبل أيام بعد الإخصاب في ظروف البيوت الزجاجية. وهكذا، وهو نهج موحد فعال للإشارة إلى مرحلة الأجنة النامية قيمة في دراسة regul الجينيأوجه من أوائل مرحلة التطور الجنيني اقحي. في هذه الورقة، ونحن نقدم اثنين من بروتوكولات موحدة لجمع الأجنة النامية للدراسات البيولوجية للمرحلة التطور الجنيني في نموذج البقول M. truncatula. أول واحد هو جمع الأجنة اقحي من خلال ربط التطور الجنيني وجراب التشكل في حين أن الثانية هي مرحلة التطور الجنيني الجسدية عبر إإكسبلنتس أوراق زراعة لتوفير أعداد كبيرة الجنين الوصول إليها بسهولة.

<table><tbody><tr><td>P4 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td></tr><tr><td>Major salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minor salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>Bacto agar</td></tr><tr><td>Plant hormones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthaleneacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Abscisic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td></tr><tr><td>Gibberellic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Dissolve in small amount of ethanol</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>Or similar, with suitable optics</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Sterilising leaves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>Autoclavable</td></tr></tbody></table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

مرحلة التطور الجنيني المبكر بدءا من البيضة الملقحة خلية واحدة يمر انقسام الخلايا السريع والتشكل، ويتميز شكليا لما قبل كروي، كروي، والقلب، ونسف فلقة مراحل. هذا التطور التدريجي تحت تنظيم محكم من شبكة الجزيئية المعقدة. حصاد الأجنة المبكرة كافية في مرحلة مماثلة من التنمية ضروري لتحقيق التنظيم الخلوي والجزيئي للمرحلة التطور الجنيني المبكر. هذه ليست واضحة منذ مرحلة التطور الجنيني المبكر يخضع التشكل السريع في فترة قصيرة على سبيل المثال 8 أيام لMedicago truncatula للوصول إلى مرحلة فلقة في وقت مبكر. هنا، نعالج هذه القضية من خلال النهجين. أول واحد بتأسيس الربط بين تطور الجنين وجراب التشكل في مساعدة تشير إلى مرحلة من مراحل الجنين اقحي. ويستند هذا بشكل خاص على عدد من اللوالب جراب والتنمية في العمود الفقري. وسيلة بديلة لتكمل في الجسم الحي الصورةtudies هو عن طريق إإكسبلنتس أوراق زراعة لإنتاج الأجنة الجسمية. يتضمن المتوسطة تركيبة هرمون غير عادي - وأوكسين (حمض 1-naphthaleneacetic)، وهو سيتوكينين (6 benzylaminopurine)، حمض التسقيط وحمض الجبريليك. مراحل مختلفة يمكن تمييزها المتزايد من الكالس دون تشريح.

وتظهر لمرحلة التطور الجنيني مختلف الهياكل جراب اقحي المقابلة لمراحل الجنين المختلفة في الشكل 1A - F بينما أظهرت مراحل الجنين المختلفة في الشكل 2A - F. عن طريق اختيار القرون في نفس المرحلة، وعينات من البويضات التي هي موحدة تماما ويمكن ...

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.9K Views.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

Video: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Genetics

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

حقن الأجنة للطفرات بوساطة كريسبر في مملح النمل Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

العزل والتنميط الجيني لجنين الفأر المتراكم لتسلسل الخلية الواحدة

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

تسليط الضوء على المؤلف: خط أنابيب لتحليل الأجنة الطافرة الخاصة بالنسب بدقة خلية واحدة

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

زرع الخلايا البدائية كريسبر/Cas9-تعتمد قفزات واسعة في النمو

أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

حقن الأجنة للطفرات بوساطة كريسبر في مملح النمل Harpegnathos

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لأجنة الفئران الكاملة الطافرة: من الأرومة إلى نهاية المعدة