وأيد هذا العمل من خلال منحة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC، منح أي 298515-2011). AL وهو حاصل على درجة الدكتوراه وأيد منحة دراسية من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC)، وMS من منحة مقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR، منح رقم MOP123246).

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمجلس الكندي للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان بعد موافقة اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان في مركز البحوث دو مركز HOSPITALIER DE L&#39;جامعة مونتريال (CRCHUM). 1. عزل، تحديد الهوية، والثقافة الفئران البريتوني الضامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3.8٪ البيرة المتوسطة thioglycollate. للقيام بذلك، تعليق 38 غرام من thioglycollate المتوسطة في 1000 مل من الماء المقطر. جلب حل لتغلي بحل المتوسطة تماما. تعقيم بواسطة التعقيم على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 15 دقيقة. تخزين ما يصل إلى 3 أشهر في الظلام، في RT 18. ملاحظة: تجاهل إذا تعكر يتطور وهو ما يشير إلى وجود تلوث جرثومي. يمكن أن تظل الحل لسنة واحدة في الظلام إذا ما واصلت عقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 1 مل الحقن المرفقة إلى 23 الإبر G، حقن 1 مل من 3.8٪ بروير thioglycollate المتوسطة في التجويف البريتوني كل مذكرة التفاهمحد ذاتها، والانتظار لمدة 3 أيام. استخدام حقنة جديدة وإبرة لكل الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغ / كلغ) والموت ببطء الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم. تأكيد التخدير المناسبة عن طريق التحقق من معدل التنفس. عادة التنفس السريع تشير إلى أن الماوس لا إفقاد إحساس عميق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل البطن من كل الفأر مع الايثانول 70٪. باستخدام مقص، وإجراء شق الوحشي على طول خط الوسط السفلي من الغشاء البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، والتراجع جلد البطن لفضح الجلد البريتوني شفافة. باستخدام 5 مل الحقن تعلق على 20 الإبر G، حقن 5 مل من DPBS الباردة في التجويف البريتوني من كل فأر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تدليك لطيف على التجويف البريتوني ثم نضح السوائل بعناية دون ثقب أي جهاز. إزالة الإبرة والاستغناء السائل البريتوني إلى 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 400 x ج في أجهزة الطرد المركزي المبردة.الخلايا يجب أن تبقى باردة أثناء الإجراء بأكمله. تجاهل طاف و resuspend الخلية بيليه في RPMI المتوسطة 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا وضبط لكثافة الخلايا إلى 1 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تميز النمط الظاهري للخلايا منعزلة عن طريق التدفق الخلوي باستخدام 1 × 10 6 خلايا في الماوس وantibodie ضد F4 / 80 (أ المستضد السطحي أعرب عن الضامة). </li></ol> 2. العلاج بالخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد العزلة، إضافة 1 × 10 6 خلايا في كل بئر. ترك الضامة البريتوني الفئران على الانضمام إلى 6 لوحات جيدا من قبل زراعة لهم ل1-2 ساعة عند 37 ° C. إزالة الخلايا غير ملتصقة عن طريق غسل بلطف 3 مرات مع PBS الدافئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي وقت لاحق، والخلايا الثقافة في 900 ميكرولتر المصل خالية DMEM لمدة 24 ساعة في وجود بروابط TLR التالية: (Pam3CSK4-TLR1 / 2 (0.5 ملغ / مل)؛ بولي (I: C) -TLR3 (10 ملغ / مل) ؛ LPS-TLR4 (100 نانوغرام / مل)؛ فلاجيلين-TLR5 (100 نانوغرام / مل)؛ FSL1-TLR6 / 2 (100 نانوغرام / مل)؛ ssRNA40-TLR7 (1 ميكروغرام / مل)؛ ODN1826-TLR9 (1 ميكرومتر). ملاحظة: إعداد لكل يجند حل 10X الأسهم. إضافة 100 ميكرولتر من هذه الأخيرة إلى كل بئر، وبالتالي إجراء التخفيف 10 أضعاف. </li></ol> 3. عزل الحمض النووي الريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع الخلايا المتوسطة وليز مباشرة في لوحات ستة جيدا عن طريق إضافة 1 مل TRIzol إلى كل بئر واجتياز المحللة الخلية عدة مرات من خلال ماصة. احتضان عينات متجانسة لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT، للسماح التفكك الكامل للمجمعات البروتين النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحللة إلى 1.5 مل RNase- وأنابيب microcentrifuge خالية من الدناز. إضافة 0.2 مل كلوروفورم في 1ML TRIzol. هزة بقوة أنابيب باليد لمدة 15 ثانية، واحتضان لهم في RT لمدة 5 إلى 10 دقيقة. الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. مراقبة الخليط يفصل في أقل المرحلة الحمراء (الفينول كلوروفورم)، والبيني والمرحلة المائية العليا عديم اللون. RNA يبقى حصرا في المرحلة المائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترانSFER بعناية المرحلة المائية العليا لأنبوب جديد دون إزعاج البيني. ترسيب الحمض النووي الريبي من ذلك عن طريق خلط مع 0.5 مل من الكحول الآيزوبروبيل. احتضان العينات في RT لمدة 10 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. الحمض النووي الريبي رواسب تشكيل بيليه الأبيض على الجانب السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. غسل RNA بيليه مرة واحدة مع 1 مل من الايثانول 75٪. مزج العينات من قبل vortexing وأجهزة الطرد المركزي في 7500 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. لفترة وجيزة تجفيف RNA (الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة). حل RNA في 0.1 مل DEPC (ريبونوكلياز المياه مجانا)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 55 مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد RNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي. للقيام بذلك، وتمييع عينات 100 مرة في المياه DEPC وقراءة في موجات من 260 نانومتر. فإن تركيز الحمض النووي الريبي ثم يكون: OD 260 × 40 نانوغرام / UL س عامل التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعادل تركيزات RNA وتوليف [كدنا حسب تعليمات الشركة المصنعة باستخدام نظام RT-PCR لالإسعافات ستراند التجميعي [كدنا]. كمافي تعليمات الشركة الصانعة، وقياس مستويات مرنا الجينات التي في الوقت الحقيقي PCR (45 دورات) في نظام الكشف عن الحمض النووي في الوقت الحقيقي. تطبيع مستويات التعبير الجيني مع اثنين من الجينات التدبير المنزلي على سبيل المثال β-الأكتين وGAPDH. ملاحظة: تطبيع تركيز الحمض النووي الريبي إلى 500 ميكروغرام / مل واستخدام 0.5 ميكروغرام لتخليق [كدنا]. </li></ol>

<ol>
	<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophic+macrophages+in+development+and+disease.">Trophic macrophages in development and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (4), 259-270 (2009).</li><li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages.">Alternative activation of macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li><li>Koury, M. J., Ponka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+erythropoiesis:+the+roles+of+folate,+vitamin+B12,+and+iron.">New insights into erythropoiesis: the roles of folate, vitamin B12, and iron.</a> Annu Rev Nutr. 24, 105-131 (2004).</li><li>Sheftel, A. D., Kim, S. F., Ponka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-heme+induction+of+heme+oxygenase-1+does+not+alter+cellular+iron+metabolism.">Non-heme induction of heme oxygenase-1 does not alter cellular iron metabolism.</a> J Biol Chem. 282 (14), 10480-10486 (2007).</li><li>Hershko, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+iron+regulation.">Storage iron regulation.</a> Prog Hematol. 10, 105-148 (1977).</li><li>Collins, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Withholding+iron+as+a+cellular+defence+mechanism--friend+or+foe.">Withholding iron as a cellular defence mechanism--friend or foe.</a> Eur J Immunol. 38 (7), 1803-1806 (2008).</li><li>Noyes, W. D., Bothwell, T. H., Finch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+reticulo-endothelial+cell+in+iron+metabolism.">The role of the reticulo-endothelial cell in iron metabolism.</a> Br J Haematol. 6, 43-55 (1960).</li><li>Layoun, A., Huang, H., Calve, A., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+signal+adaptor+protein+MyD88+is+required+for+sustained+endotoxin-induced+acute+hypoferremic+response+in+mice.">Toll-like receptor signal adaptor protein MyD88 is required for sustained endotoxin-induced acute hypoferremic response in mice.</a> Am J Pathol. 180 (6), 2340-2350 (2012).</li><li>Zumerle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+hepcidin+in+the+liver+recapitulates+the+hemochromatotic+phenotype.">Targeted disruption of hepcidin in the liver recapitulates the hemochromatotic phenotype.</a> Blood. 123 (23), 3646-3650 (2014).</li><li>Nguyen, N. B., Callaghan, K. D., Ghio, A. J., Haile, D. J., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepcidin+expression+and+iron+transport+in+alveolar+macrophages.">Hepcidin expression and iron transport in alveolar macrophages.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (3), L417-L425 (2006).</li><li>Nemeth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepcidin,+a+putative+mediator+of+anemia+of+inflammation,+is+a+type+II+acute-phase+protein.">Hepcidin, a putative mediator of anemia of inflammation, is a type II acute-phase protein.</a> Blood. 101 (7), 2461-2463 (2003).</li><li>Nemeth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepcidin+regulates+cellular+iron+efflux+by+binding+to+ferroportin+and+inducing+its+internalization.">Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization.</a> Science. 306 (5704), 2090-2093 (2004).</li><li>Constante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+Hfe+in+basal+and+induced+hepcidin+levels+in+iron+overload+and+inflammation.">Distinct requirements for Hfe in basal and induced hepcidin levels in iron overload and inflammation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291 (2), G229-G237 (2006).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 14 (Unit 14 11), (2008).</li><li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells.">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Leijh, P. C., van Zwet, T. L., ter Kuile, M. N., van Furth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+thioglycolate+on+phagocytic+and+microbicidal+activities+of+peritoneal+macrophages.">Effect of thioglycolate on phagocytic and microbicidal activities of peritoneal macrophages.</a> Infect Immun. 46 (2), 448-452 (1984).</li><li>Dy, M., Debray-Sachs, M., Kamoun, P., Hamburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+thioglycollate+on+macrophage+lysosomal+enzymes.">Effect of thioglycollate on macrophage lysosomal enzymes.</a> Biomedicine. 29 (5), 167-170 (1978).</li><li>Li, Y. M., Baviello, G., Vlassara, H., Mitsuhashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycation+products+in+aged+thioglycollate+medium+enhance+the+elicitation+of+peritoneal+macrophages.">Glycation products in aged thioglycollate medium enhance the elicitation of peritoneal macrophages.</a> J Immunol Methods. 201 (2), 183-188 (1997).</li><li>Layoun, A., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+constituents+induce+hepcidin+expression+in+macrophages+through+MyD88+signaling.">Bacterial cell wall constituents induce hepcidin expression in macrophages through MyD88 signaling.</a> Inflammation. 35 (4), 1500-1506 (2012).</li><li>Oppenheim, J. J., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alarmins:+chemotactic+activators+of+immune+responses.">Alarmins: chemotactic activators of immune responses.</a> Curr Opin Immunol. 17 (4), 359-365 (2005).</li><li>Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+recognition+and+innate+immunity.">Pathogen recognition and innate immunity.</a> Cell. 124 (4), 783-801 (2006).</li><li>Lang, R., Patel, D., Morris, J. J., Rutschman, R. L., Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+gene+expression+in+activated+and+resting+primary+macrophages+by+IL-10.">Shaping gene expression in activated and resting primary macrophages by IL-10.</a> J Immunol. 169 (5), 2253-2263 (2002).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+murine+macrophages+from+bone+marrow,+spleen+and+peritoneum.">Characterization of murine macrophages from bone marrow, spleen and peritoneum.</a> BMC Immunol. 14 (6), (2013).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J Cell Physiol. 77 (2), 121-134 (1971).</li><li>Cannon, G. J., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+capacity+for+phagocytosis.">The macrophage capacity for phagocytosis.</a> J Cell Sci. 101 (Pt 4), 907-913 (1992).</li><li>Wang, Y., Harris, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+renal+disease.">Macrophages in renal disease.</a> J Am Soc Nephrol. 22 (1), 21-27 (2011).</li><li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations.">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li><li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica:+defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents.">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J Immunol. 132 (3), 1487-1493 (1984).</li><li>Schleicher, U., Bogdan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+culture+and+flow-cytometric+characterization+of+primary+mouse+macrophages.">Generation culture and flow-cytometric characterization of primary mouse macrophages.</a> Methods Mol Biol. 531, 203-224 (2009).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

الضامة هي الحاسمة من أجل البقاء وتوفر هدفا مغريا للتلاعب المضيف لتحقيق أهداف المناعية. وقد أجرى اكتشاف TLRs والجزيئات الأخرى الاعتراف الضامة لمحور النقاش المناعية. الضامة تستجيب لمجموعة متنوعة من المحفزات، بما في ذلك السيتوكينات، الجزيئات المرتبطة الضرر الجزيئية نم...

ويتكون النظام أكلة شبكية من الخلايا في الأنسجة والأعضاء المختلفة مثل نخاع العظام والدم والكبد والطحال. يتم توزيع الضامة على نطاق واسع في جميع أنحاء الجسم، حيث يشارك خصوصا في فطرية وقابلة للتكيف الاستجابات المناعية للسيطرة على العدوى واضحة. بالإضافة إلى دورها في الدفاع المضيف، الضامة أيضا أن تلعب دورا هاما في شفاء الجروح والحفاظ على النسيج التوازن 1،2. وعلاوة على ذلك، الضامة ليست مهمة فقط لعمل جهاز المناعة ولكن أيضا تشارك بنشاط في الحديد التوازن 3. في الجسم، ما يقرب من 80٪ من الحديد موجودة في الهيموجلوبين في كريات الدم الحمراء، والتي عندما يتم هضم هرمة الضامة 4. يوميا، هذه الضامة إعادة تدوير 25 ملغ من الحديد المشتق من كرات الدم الحمراء وتوفير وسائل النقل لفي البلازما 5. وعلاوة على ذلك، خلال العدوى والالتهابات، الضامة الموالية للالتهابات تصادر الحديد في الدم للحد من availabili الحديدتي واي لمسببات الأمراض، على الصعيدين النظامية والمحلية 6-8. كذلك، فقد أظهرت الدراسات أن الضامة وأساسا خلايا الكبد تنتج الببتيد مضادات الميكروبات اسمه hepcidin الذي يعتبر المنظم الرئيسي لاستقلاب الحديد 9، 10. يتم زيادة Hepcidin أساسا من محفزات للالتهابات ويكون مسؤولا جزئيا عن عزل الحديد في بلعم على التهاب مزمن 11-13. كما لم يتم فهم التعبير hepcidin في الضامة بشكل جيد للغاية، درسنا الدور المحتمل للمستقبلات تول مثل (TLRs) في هذه اللائحة. تم العثور على TLRs في المقام الأول على الضامة، وتلعب دورا محوريا في تفعيلها. بالإضافة إلى ذلك، LPS hepcidin الناجم عن التعبير في الكبد يعتمد على TLR4 13. لذلك، لتنفيذ دراستنا، استخدمنا طريقة تقوم على عزل الضامة البريتوني في الفئران. وتستخدم خطوط الخلايا البلعمية على نطاق واسع في استيلاد بلعمالمنشأ. مع ذلك يمكن أن ثقافة ممتدة يثير فقدان الجينات وانخفضت وظائف المناعة في هذه خطوط الخلايا. وبالتالي، عزل الضامة من التجويف البريتوني أمر بالغ الأهمية. يعرض التجويف البريتوني الماوس موقع مثالي لحصاد الضامة 13-15. المعزولة الضامة البريتوني الفئران هي مريحة لعدة دراسات حول وظيفتها المناعية. ومع ذلك، فإن عدد الضامة في الصفاق غير كاف لدراسات مستفيضة ويقدر حوالي 1 × 10 6 الضامة في الماوس. وهكذا، لزيادة الانتاج بلعم، تم حقن عامل انتزاع معقمة مثل thioglycollate في التجويف البريتوني التي تسبق الحصاد الخلية. بعد حقن thioglycollate، تم زيادة العائد من الضامة في الماوس بنسبة 10 أضعاف. على الرغم من الزيادة في العائد الضامة، أعمال متوسطة thioglycollate بيرة كما مصدرا للإزعاج الذي يسبب استجابة التهابية، مما أدى إلى توظيف الضامة، والتي أماهذ لكن ليس من الضروري تؤثر على التعبير الجيني. وبالتالي، يجب أن تدرج مجموعة مراقبة تتكون من الضامة غير المعالجة في كل تجربة. في أيدينا، لم يتم الكشف عن التعبير hepcidin التي يتم تحفيز كبير من قبل التهاب في thioglycollate غير المعالجة أثارت الضامة البريتوني. وعلاوة على ذلك، فقد أظهرت الدراسات أن thioglycollate بيرة تجند العديد من الضامة، ولكن لا تفجيرها 16. من جهة أخرى، أثارت thioglycollate بيرة أظهرت الضامة زيادة في انزيم الليزوزومية لكن انخفاضا في قتل الكائنات الحية الدقيقة بلعها 17. ومع ذلك، لم تتأثر القدرة أكلة بالمقارنة مع الضامة غير استخلاصها 16. مرة واحدة مثقف في أطباق، الضامة البريتوني تصبح ملتصقة، وبالتالي السماح فصلهم عن نوع آخر من الخلايا المعزولة من التجويف البريتوني. وفي وقت لاحق، وقد تم الطعن الضامة معزولة مع منبهات TLRs مختلفة.وأخيرا، تم استخراج مرنا من الخلايا المستزرعة وتم تحليل التعبير الجيني باستخدام كمية عكس سلسلة الناسخ-تفاعل البلمرة (QRT-PCR).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA)</td>
			<td>475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycollate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td>
			<td>19032-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% sodium pentobarbital (Used for mice anesthesia (80 mg/kg, i.p.))</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (DPBS), placed on ice and will serve to harvest macrophages</td>
			<td>WISENT INC Canada (QC)</td>
			<td>311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI medium 1640 (Supplement with penicillin, streptomycin, L-glutamine, and 10 % fetal calf serum).</td>
			<td>WISENT INC Canada (QC)</td>
			<td>350-000-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 and 5 ml syringes</td>
			<td>BD USA (NJ)</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated (NY, USA)</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLRL-pm25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyionosine&#8211;polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLRL-PIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLR-FLIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLR-FSL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 &#956;g/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLR-LRNA-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 &#956;M)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>11B16-MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZOL</td>
			<td>Invitrogen, (Burlington, ON, Canada)</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20g and 23g needles</td>
			<td>BD USA (NJ)</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes placed on ice</td>
			<td>Sarstedt (Newton, MA, USA)</td>
			<td>62.547.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td>
			<td>R7757-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 antibody</td>
			<td>BIO-RAD ( CA, USA)</td>
			<td>MCA497APC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 antibodies</td>
			<td>Pharmingen, {Mississauga, ON, CA)</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Coulter Epics Elite counter, Coulter, (Hialeah, FL,USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well plates</td>
			<td>Corning Incorporated (NY, USA)</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial lipoprotein Pam3CSK4 (0.5 mg/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLRL-pm25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyionosine&#8211;polycytidylic acid (Poly(I:C)) (10 mg/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLRL-PIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from Escherichia coli 055:B5 (100 ng/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified flagellin from Salmonella typhimurium (100 ng/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLR-FLIC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipoprotein synthetic FSL1 (100 ng/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLR-FSL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssRNA derived from the HIV-1 long terminal repeat ssRNA40 (1 &#956;g/ml)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>TLR-LRNA-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type B CpG oligonucleotide ODN1826 (1 &#956;M)</td>
			<td>InvivoGen (San Diego, USA)</td>
			<td>11B16-MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZOL</td>
			<td>Invitrogen, (Burlington, ON, Canada)</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Axygen Scietific (CA,USA)</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific (ON, Canada)</td>
			<td>UN1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>JT Baker (PA, USA)</td>
			<td>70566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol (in DEPC treated water)</td>
			<td>Commercial Alchohols (QC, Canada)</td>
			<td>17394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01% diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated water (let stand overnight and autoclave)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, (St. Louis, MO)</td>
			<td>216.542.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omniscript RT-PCR system</td>
			<td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canada)</td>
			<td>205113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor Gene 3000</td>
			<td>Montreal Biotech, (Kirkland, QC, Canada)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiTect SYBR Green I PCR kits</td>
			<td>Qiagen, (Mississauga, ON, Canada)</td>
			<td>204141</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon toll-like receptors stimulation

خلال العدوى والالتهابات، وحيدات تعميم مغادرة مجرى الدم وتنتقل إلى أنسجة، حيث تفرق في الضامة. الضامة تعبر عن سطح مستقبلات تول مثل (TLRs)، والتي تعترف أنماط الجزيئية الحفظ من خلال التطور في مجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة. TLRs تلعب دورا محوريا في تنشيط البلاعم التي عادة ما يرتبط التعبير الجيني التغيير. الضامة حاسمة في كثير من الأمراض، وقد ظهرت كما أهدافا جذابة للعلاج. في بروتوكول التالية، وصفنا إجراء لعزل الضامة البريتوني في الفئران باستخدام المتوسطة thioglycollate بيرة. وهذا الأخير سوف تعزز الهجرة الوحيدات في الصفاق، وفقا لهذا سيرفع العائد بلعم بنسبة 10 أضعاف. وقد أجريت العديد من الدراسات باستخدام نخاع العظم والطحال أو البريتوني المستمدة الضامة. ومع ذلك، فقد أظهرت الضامة البريتوني لتكون أكثر نضجا على العزلة وأكثر استقرارا في الوظيفيةإيتي والنمط الظاهري. وبالتالي، الضامة معزولة عن التجويف البريتوني الفئران تعرض السكان خلية الهام الذي يمكن أن تخدم في مختلف الدراسات المناعية والتمثيل الغذائي. مرة واحدة معزولة، وحفز الضامة مع يغاندس TLR مختلفة، وبالتالي تم تقييم التعبير الجيني.

نحن يتميز أولا الضامة البريتوني في الفئران المعزولة التي التدفق الخلوي. للقيام بذلك، استخدمنا (F4 / 80) الأجسام المضادة التي تعترف تحديدا علامات أعرب إلا عن طريق الضامة. مطلوب هذا التوصيف لتحديد النسبة المئوية للبلعم معزولة والتمييز بينها وبين الخلايا التي تم الحصول ع?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation at JoVE.com

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

عزل الفئران البريتوني الضامة لتنفيذ جين تحليل التعبير عند تول مثل مستقبلات تحفيز

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

isolation-murine-peritoneal-macrophages-to-carry-out-gene-expression

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.2K Views.  Institut du cancer de Montréal. We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Video: Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

عزل خلايا فأر التجويف البريتوني

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of microbial (e.g., viruses, bacteria and parasite) infections, they also play an important role in the pathophysiology of infectious diseases, inflammatory diseases, and possibly in autoimmune diseases. Thus, the intensity and duration of TLR responses against infectious diseases must be tightly controlled. It follows that understanding the structural integrity of sensor receptors, their ligand interactions and signaling components is essential for subsequent immunological protection. It would also provide important opportunities for disease modification through sensor manipulation. Although the signaling pathways of TLR sensors are well characterized, the parameters controlling interactions between the sensors and their ligands still remain poorly defined. We have recently identified a novel mechanism of TLR activation by its natural ligand, which has not been previously observed 1,2. It suggests that ligand-induced TLR activation is tightly controlled by Neu1 sialidase activation. We have also reported that Neu1 tightly regulates neurotrophin receptors like TrkA and TrkB 3, which involve Neu1 and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk in complex with the receptors 4. The sialidase assay has been initially use to find a novel ligand, thymoquinone, in the activation of Neu4 sialidase on the cell surface of macrophages, dendritic cells and fibroblast cells via GPCR G&alpha;i proteins and MMP-9 5. For TLR receptors, our data indicate that Neu1 sialidase is already in complex with TLR-2, -3 and -4 receptors, and is induced upon ligand binding to either receptor. Activated Neu1 sialidase hydrolyzes sialyl &alpha;-2,3-linked &beta;-galactosyl residues distant from ligand binding to remove steric hinderance to TLR-4 dimerization, MyD88/TLR4 complex recruitment, NFkB activation and pro-inflammatory cell responses. In a collaborative report, Neu1 sialidase has been shown to regulate phagocytosis in macrophage cells 6. Taken together, the sialidase assay has provided us with powerful insights to the molecular mechanisms of ligand-induced receptor activation. Although the precise relationship between Neu1 sialidase and the activation of TLR, Trk receptors has yet to be fully elucidated, it would represent a new or pioneering approach to cell regulation pathways.

The sialidase assay is a simple technical approach that will elucidate novel molecular mechanism(s) of TLR sensors of microbial infections and involvement in inflammatory diseases at the receptor level on the cell surface of live macrophages.

الكشف عن نشاط تنظيم سياليداز Neu1 في اتصال مثل تنشيط مستقبلات

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome. Aging is associated with an increased susceptibility to viral and bacterial infections and decreased responsiveness to vaccines with a well-documented decline in humoral as well as cell-mediated immune responses1,2. We have recently assessed the effects of aging on Toll-like receptors (TLRs), key components of the innate immune system that detect microbial infection and trigger antimicrobial host defense responses3. In a large cohort of healthy human donors, we showed that peripheral blood monocytes from the elderly have decreased expression and function of certain TLRs4 and similar reduced TLR levels and signaling responses in dendritic cells (DCs), antigen-presenting cells that are pivotal in the linkage between innate and adaptive immunity5. We have shown dysregulation of TLR3 in macrophages and lower production of IFN by DCs from elderly donors in response to infection with West Nile virus6,7. 
Paramount to our understanding of immunosenescence and to therapeutic intervention is a detailed understanding of specific cell types responding and the mechanism(s) of signal transduction. Traditional studies of immune responses through imaging of primary cells and surveying cell markers by FACS or immunoblot have advanced our understanding significantly, however, these studies are generally limited technically by the small sample volume available from patients and the inability to conduct complex laboratory techniques on multiple human samples. ImageStream combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging and thus facilitates investigation in multiple cell populations contemporaneously for an efficient capture of patient susceptibility. Here we demonstrate the use of ImageStream in DCs to assess TLR7/8 activation-mediated increases in phosphorylation and nuclear translocation of a key transcription factor, NF-&kappa;B, which initiates transcription of numerous genes that are critical for immune responses8. Using this technology, we have also recently demonstrated a previously unrecognized alteration of TLR5 signaling and the NF-&kappa;B pathway in monocytes from older donors that may contribute to altered immune responsiveness in aging9.

We describe use of ImageStream technology (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank">www.amnis.com</a>), which combines quantitative flow cytometry with simultaneous high-resolution digital imaging, to quantify cellular mechanisms of primary immune cells from well-defined patient cohorts. Our studies provide a blueprint for translational investigations to quantify lineage specific cellular responses in small samples from subject cohorts.

الكمية التصوير من النسب المحددة اشارة مستقبلات بوساطة الرقم تشبه في وحيدات والخلايا الجذعية من عينات صغيرة من دم الإنسان

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique and important tissue to study immune mechanisms because it is involved in host immune response against oral biofilm that might cause periodontal diseases. Furthermore, the close proximity of the gingiva to alveolar bone tissue enables also studying bone remodeling under inflammatory conditions. Our method yields large amount of immune cells that allows analysis of even rare cell populations such as Langerhans cells and T regulatory cells as we demonstrated previously 1. Employing mice to study local immune responses involved in alveolar bone loss during periodontal diseases is advantageous because of the availability of various immunological and experimental tools. Nevertheless, due to their small size and the relatively inconvenient access to the murine gingiva, many studies avoided examination of this critical tissue. The method described in this work could facilitate gingival analysis, which hopefully will increase our understating on the oral immune system and its role during periodontal diseases.

This study describes an efficient technique to isolate and process gingival tissues from the mouse oral cavity in order to produce a single-cell culture. The resulting cells can be further used for flow cytometry analysis and molecular studies.

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct a tree to show the evolutionary relationship among different taxa (classification units) at the molecular level. Phylogenetic analysis can also be used to investigate domain relationships within an individual taxon, particularly for organisms that have undergone substantial change in morphology and physiology, but for which researchers lack fossil evidence due to the organisms&#39; long evolutionary history or scarcity of fossilization.
In this text, a detailed protocol is described for using the phylogenetic method, including amino acid sequence alignment using Clustal Omega, and subsequent phylogenetic tree construction using both Maximum Likelihood (ML) of Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) and Bayesian Inference via MrBayes. To investigate the origin of eukaryotic Sugars Will Eventually be Exported Transporters (SWEET) genes, 228 SWEETs including 35 SWEET proteins from unicellular eukaryotes and 57 SemiSWEET proteins from prokaryotes were analyzed. Interestingly, SemiSWEETs were found in prokaryotes, but SWEETs were found in eukaryotes. Two phylogenetic trees constructed using theoretically distinct methods have consistently&#160;suggested that the first eukaryotic SWEET gene might stem from the fusion of a bacterial SemiSWEET gene and an archaeal SemiSWEET gene.&#160;It is worth noting that one should be cautious to draw a conclusion based only on phylogenetic analysis, although it is useful to explain the underlying relationship between different taxa, which is difficult or even impossible to discern through experimental means.

A method of constructing a phylogenetic tree based on sequence homology of SWEETs from eukaryotes and SemiSWEETs from prokaryotes is described. Phylogenetic analysis is a useful tool for explaining the evolutionary relatedness between homologous proteins or genes from different organism groups.

باستخدام تحليل النشوء والتطور للتحقيق التوكسينات الجينات الأصل

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

تقييم آثار المخدرات على أساس الأجسام المضادة على موريني نخاع العظام وتنشيط بلعم البريتوني

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...