يهدف هذا البروتوكول إلى الحصول على كميات كبيرة من البلاعم غير المحفزة المشتقة من نخاع العظام ولم تتعرض أبدا لعوامل الأنسجة أو السيتوكينات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي عدد الخلايا المكتسبة من واحد. مع الإجراء الصحيح ، يمكن الحصول على ما يقرب من 2 مرات 10 إلى قوة 7 البلاعم.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين من مختلف المجالات في دراسة البلاعم مثل بيولوجيا الخلية وعلم الأمراض والمناعة وعلم الطفيليات ، نظرا لأن الخلايا دائما ما تكون عرضة للتلوث ، فإن توخي الحذر في جميع الخطوات المعقمة واستخدام خزانة السلامة الحيوية للتدفق الصفحي ضرورية للحفاظ على صلاحية الخلية. مما يدل على الإجراء سيكون إيزابيلا أباريسيدا دي سوزا. طالب درجة الماجستير من مختبرنا.
لبدء الإجراء على الفأر الذكر من النوع البري C57BL / 6 الذي تم قتله رحيما بشكل صحيح ، انقع الماوس بمحلول إيثانول بنسبة 70٪. باستخدام مقص معقم ، قم بعمل شق سنتيمتر واحد على طول البطن وإزالة الجلد حتى تتعرض عضلة الساقين الخلفيتين بالكامل. ثم قم بإزالة الأرجل الخلفية بعناية في ذروة الورك دون كسر عظم الفخذ والساق.
ضع الأرجل الخلفية السليمة في أنبوب طرد مركزي مخروطي يحتوي على 70٪ محلول إيثانول. داخل خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي ، انقل الأرجل المعزولة من 70٪ إيثانول إلى برنامج تلفزيوني معقم. باستخدام ملقط ومناديل مطهرة ، قم بتنظيف العظام عن طريق إزالة جميع العضلات واللفافة المرفقة.
بعد ذلك ، استخدم شفرة مشرط جراحية معقمة لقطع المشاش العظمي على كلا الطرفين ، وكشف نخاع العظام. املأ حقنة 20 ملليلتر ب 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم مكمل بمحلول 2٪ بنسلين ستربتومايسين ، وقم بتوصيل إبرة قياس 26 به. امسك العظم باستخدام ملقط تشريح تشريحي بيد واحدة.
استخدم اليد الأخرى لإدخال الإبرة في تجويف العظام بعناية دون سحق العظم. بعد ذلك ، اغسل الجزء الداخلي من العظم باستخدام برنامج تلفزيوني واجمع نخاع العظم في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقمة. بمجرد غسلها ، يجب أن يظهر تجويف العظام أبيض.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا التي تم جمعها عند 300 جرام وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من وسط DMEM / F1210. قم بتجانس التعليق وإضافة تسعة ملليلتر أخرى من الوسط لرفع الحجم الإجمالي إلى 10 ملليلتر.
أضف ملليلترا واحدا من معلق الخلية السلفية إلى كل من 10 أطباق بتري بلاستيكية مستديرة ، بقياس 100 ملليلتر × 20 ملم. انشر الخلايا عبر الألواح باستخدام ماصة للحصول على توزيع موحد. ثم أضف تسعة ملليلتر من DMEM / F1210 المكمل ب 20٪ من طافية الخلية L929 إلى كل طبق.
احتضان الأطباق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الثالث ، أضف 10 ملليلتر من وسط DMEM / F1210 المكمل ب 20٪ من طافية الخلية L929 إلى كل طبق. 20 ملليلتر الناتجة من وسط الثقافة في كل طبق كافية لنمو الخلايا حتى النضج.
تخلص من المواد الطافية من جميع أطباق الثقافة. اغسل كل طبق ثقافة ب 10 ملليلتر من المغنيسيوم المعقم و PBS الخالي من الكالسيوم ، مسخنا إلى 37 درجة مئوية ، وتخلص من المحلول بعد الغسيل. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول تفكك الخلايا غير الأنزيمية ، مسخن إلى 37 درجة مئوية لكل طبق.
احتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، استخدم مجهرا مقلوبا لتصور ما إذا كانت البلاعم تنفصل عن أطباق زراعة الخلايا. باستخدام ماصة مصلية ، اغسل الأطباق بمحلول تفكك الخلايا غير الأنزيمية الذي يقوم بحركات دائرية بشكل متكرر لضمان تفكك البلاعم الكامل.
جمع ودمج الحل من جميع أطباق الثقافة في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 ملليلتر. مرة أخرى ، أضف 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم ومسخن مسبقا إلى أطباق الثقافة الفارغة. جهاز طرد مركزي الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على المحلول المجمع عند 300 جرام وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بمليلتر واحد من DMEM / F1210. قم بتجانس التعليق ببطء وبعناية عن طريق سحبه لأعلى ولأسفل دون إتلاف الخلايا. تمييع حصص 10 ميكرولتر من محلول البلاعم عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من تريبان الأزرق لحساب الخلايا باستخدام مقياس الدم.
في اليوم السابع ، سينتج كل طبق ما يقرب من 2 مليون بلاعم. أدى التعرض لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم من طاف L929 إلى تحويل أسلاف نخاع العظم تدريجيا إلى بلاعم ناضجة ، مما يعرض مورفولوجيا نموذجية منتشرة بسبب الامتدادات السيتوبلازمية. في اليوم الثالث ، ظهر عدد قليل من البلاعم غير الناضجة ، ولها مورفولوجيا نموذجية مستديرة الشكل مع عدد قليل من الإسقاطات الغشائية.
على الرغم من أنها تحولت على طول العملية برمتها ، إلا أن سبعة أيام كانت ضرورية لتحقيق عدد ونضج كافيين. أظهرت البلاعم التي تم الحصول عليها مجموعة متجانسة من حيث الحجم والدقة في تحليل قياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، عبر 100٪ من السكان عن جزيئات سطح F480 و CD11B المميزة ، مما يشكل مجموعة واحدة محددة جيدا من الخلايا.
تم تأكيد قدرة البلعمة للبلاعم الناضجة والمتمايزة جيدا من خلال صور الفحص المجهري الفلوري التي تظهر طفيليات الليشمانيا البلعمية الرئيسية داخل البلاعم. يجب إزالة الأرجل من بعناية لأنه يتم إجراؤه في بيئة غير معقمة وهو أهم مصدر للتلوث. يجب عدم كسر الأرجل خارج خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الصفحي.
يمكن استخدام البلاعم المشتقة من نخاع العظم التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول لأداء الضامة لاحقا في استقطاب المختبر لفهم فسيولوجيا البلاعم.
