The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children&#8217;s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.

هذا الأسلوب يتطلب استخدام المواد الحيوانية، سمحت من قبل لجنة لافال جامعة الحيوان الأخلاق (بروتوكول # 2012-170). 1. إعداد والتحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول الأسهم ACSF وفقا للصفات التالية 7،17. تتوفر في الأدب وصفات أخرى مع وجود اختلافات التركيز. حلول تخزين المخزون في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الملح الحل: إضافة 75.39 غرام من كلوريد الصوديوم (129 ملي النهائي)؛ 2.5 غرام من بوكل (3.35 ملي النهائي)؛ 0.81 غرام من NaH2PO4 (0.58 ملي النهائي)؛ 2.33 غرام من MgCl2 (1.15 ملي النهائي)؛ 1.85 غرام من CaCl2 (1.26 ملم). تذوب في 800 مل من الماء المقطر ثم ملء إلى 1 L مع المياه المقطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بيكربونات: إضافة 17.65 غرام من NaHCO 3 (21 ملي النهائي). تذوب في 900 مل من الماء المقطرة ثم ملء إلى 1 L مع الماء المقطر. والاختلافات في تركيز البيكربونات يؤدي إلى تغيرات درجة الحموضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل الجلوكوز: إضافة 54.06غرام من الجلوكوز (30 ملي النهائي). تذوب في 400 مل من الماء المقطرة ثم ملء الى 500 مل بالماء المقطر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ACSF عن طريق تمييع 100 مل من محلول الملح، و 100 مل من محلول بيكربونات، و 50 مل من محلول الجلوكوز في 1 لتر من الماء المقطر. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الزجاج الكهربائي عن الاحترار وتمتد أنبوب زجاجي حتى يكسر. الرمال أسفل الحافة قبل الاستخدام. القطب يمكن إعادة استخدامها الكثير من الوقت طالما أنه يبقى نظيفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التجريبي ملاحظة: يتم عرض تفاصيل الإعداد في الشكل 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مكبر للصوت، والانتقال averager، ونظام الحصول على البيانات، تحكم في درجة الحرارة ومضخة. تحقق من تضخيم الإشارات (كسب = 10000)، والترشيح (عتبة منخفضة، 10 هرتز، عتبة عالية، 5 كيلو هرتز)، ومعدل أخذ العينات من البث التناظري إلى الرقمي التحويل من إشارة الخام (2.5 كيلو هرتز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء زجاجة مع ACSF وفقاعة مع كربوجين (95٪ O 2 </suب&gt;، 5٪ CO 2). لحث على bubbled- واستعد-ACSF التدفق في غرفة تسجيل (حجم 5 مل) في 4 مل / دقيقة. عقد درجة الحرارة في غرفة تسجيل في 26 (± 1) درجة مئوية. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني 7.4 في هذه الظروف القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبقي 50 مل من RT وفقاعات كربوجين ACSF في حقنة 50 مل بالقرب من غرفة التشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتشغيل الكمبيوتر وبدء برنامج تسجيل. </li></ol></li></ol> 2. تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن وتحديد بصريا جنس الحيوان (الذكور لها الشرج التناسلية مسافة أطول، في حين أن الإناث لديها مسافة الشرج الأعضاء التناسلية قصيرة؛ الذكور الأعضاء التناسلية غالبا ما تكون مظلمة بينما الأعضاء التناسلية للإناث وردي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير القوارض حديثي الولادة من جانب واحد من الخيارات التالية: تخدير بالبرد (تزج تماما الحيوان في الثلج لمدة 4-5 دقيقة 18)، والحقن (equitensine في 4 مل / كغم) 19 أو استنشاق التخدير المتطايرة (الأيزوفلورين 20 أو الأثير 21). Confiجمهورية مقدونيا طائرة كافية من التخدير بسبب عدم وجود رد فعل مخلب الانسحاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان على مقاعد البدلاء، وجها بطني أسفل. القسم جزء منقاري من الرأس coronally مع مشرط على مستوى bregma (وضوحا من خلال الجلد والجمجمة). تنفيذ هذه الخطوة مباشرة بعد تخدير الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القسم الجسم coronally مع مشرط تحت أعضاء الأمامي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجلد والعضلات والأنسجة الدهنية والأحشاء مع مقص جراحي ورقيقة وكماشة. منذ العظام لينة في هذا العصر، توخي الحذر حتى لا تضر الجهاز العصبي. تنفيذ هذه الخطوة على مقاعد البدلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مكان في غرفة التشريح. استخدام ACSF المخزنة في المحقنة إلى الأوكسجين التحضير. من هذه النقطة إلى نهاية التسجيل، استخدم المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الوجه الظهري للإعداد، وقطع الجمجمة والفقرات من منقاري إلى الجزء الذيلية على طول محور المتوسط ​​مع مقص جراحي ورقيقة وكماشة. فتح الجمجمة قطعوالفقرات من أجل فضح النسيج العصبي. استخدام ACSF strored في المحقنة إلى الأوكسجين التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع كماشة، وإزالة الغشاء العنكبوتي، الأنسجة رقيقة تغطي سطح النسيج العصبي. تحتفظ الأم الحنون والأوعية الدموية ضد النسيج العصبي. استخدام ACSF المخزنة في المحقنة إلى الأوكسجين التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مكان مع ظهري وجهه لأسفل، وبعناية اسقاط الدماغ والحبل الشوكي عن طريق قطع الأعصاب والنسيج الضام مع مقص حين عقد إعداد في المكان. نهج ظهري هو ممكن أيضا. الحفاظ على الجذور والأعصاب أطول فترة ممكنة. إزالة العظام لعزل الدماغ والحبل الشوكي. استخدام ACSF المخزنة في المحقنة إلى الأوكسجين التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المخيخ وتبقى الهياكل منقاري من قبل باجتزاء لهم مشرط. استخدام ACSF المخزنة في الإبرة إلى الأوكسجين التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا اعتمادا على التجربهتصميم التل، وإزالة الجسر مع مشرط من قبل القسم الأمامي الإكليلي إلى الشريان المخيخي السفلي 22. لاحظ أن الحفاظ على بونس كلها سوف تبطئ إيقاع في الفئران وبشكل كامل وتمنع في الفئران. الاستعدادات التي تشمل فقط الجزء الذيلية للبونس عرض النشاط مثل الجهاز التنفسي مع وتيرة مستقرة في جذور C4. </li></ol> 3. تسجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مكان في غرفة تسجيل، بطني مكشوفة. إصلاح إعداد مع دبابيس في أدنى جزء من الحبل الشوكي ومنقاري أقصى جزء من الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة مرتبطة القطب بواسطة إبرة لها، لحث على الاكتئاب في القطب (قطر الزجاج نصيحة: 150-225 ميكرون) من خلال سحب المكبس حقنة، من أجل سد جزئيا القطب مع ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام micromanipulator، ضع بعناية القطب بالقرب من الجذور البطنية الرابعة. يمكن أن الجذور البطنية الأخرى أيضا تقديم مثل الجهاز التنفسي النشاط (ه.ز.، العصب القحفي الثاني عشر، C1 الجذر البطني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحث على الاكتئاب في الخزان الكهربائي عبر حقنة من خلال سحب المكبس من أجل نضح بلطف جذير العصبية. ثم نقل بعناية القطب تطبيقه ضد الحبل الشوكي. ملاحظة: من الناحية المثالية حجم جذير يطابق حجم الفتحة الكهربائي وبالتالي يخلق ختم بين المقصورات الداخلية والخارجية من القطب. منذ تستخدم مكبرات الصوت التفاضلي عادة لمثل هذه التسجيلات، أي انفتاح بين داخل القطب وغرفة تسجيل يقلل من جودة الإشارة ويجعل من الصعب للقضاء على الضوضاء الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل الإيقاع التي تنتجها إعداد ظل ظروف normoxic (أي فقاعات ACSF مع كربوجين: 95٪ O 2 و 5٪ CO 2) لمدة 20 دقيقة على الأقل لتحديد خط الأساس المعلمات من التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل نضح من-فقاعات كربوجين ACSF لACSF التحفيز (أي فقاعات مع 95٪ N 2 و 5٪ CO 2 لنقص الأكسجة التحفيز) لمدة 15 دقيقة. تغيير مدة التعرض وفقا للبروتوكول تجريبي. تسجيل مدة التعرض على تسجيل والحيوان ورقة البيانات. استخدام أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ بين زجاجة ACSF وغرفة كلما أمكن ذلك لتجنب انتشار الغاز إلى خارج الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل نضح إلى المعايير فقاعات كربوجين ACSF لمدة 15 دقيقة على الأقل لتسجيل الانتعاش. تسجيل هذا على تسجيل والحيوان ورقة البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء التسجيل. </li></ol> 4. التحليل الإحصائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من إشارة متكاملة، وحساب التردد حيث بلغ عدد رشقات نارية في الدقيقة (معبرا عنها رشقات نارية / دقيقة)، واتساع بالفرق بين خط الأساس وذروة انفجار (معبرا عنها بالسيارات)، ومدة انفجر مثل مدة من بداية لنهاية انفجار (معبرا في الصورة)، ومنطقة انفجار كما المنطقة تحت لئيملقد للانفجار في إشارة متكاملة (معبرا عنها بالسيارات · ق) (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تردد، والسعة، ومدة انفجر ومنطقة الانفجار تحت normoxic (خط الأساس)، ميتة (التحفيز) وبعد ميتة الشروط (ما بعد التحفيز) الانتعاش كمتوسط ​​لمدة 5 دقائق الأخير من التسجيلات لكل حالة. لا تحليل الجزء الأول من كل حالة لأن هناك تأخير بين التحول نضح وACSF التجانس في غرفة تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعبير ثم التحفيز (أي نقص الأكسجين) وبعد التحفيز (أي بعد نقص الأوكسجين) القيم الانتعاش كنسبة مئوية من القيم الأساسية لتسجيل المقابلة. التعبير عن النتائج على النحو يعني ± SD </li></ol>

<ol>
	<li>Feldman, J. L., Del Negro, ., A, C., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+rhythm+of+breathing:+so+near,+yet+so+far.">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).</li><li>Taylor, A. C., Kollros, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+in+the+normal+development+of+Rana+pipiens+larvae.">Stages in the normal development of Rana pipiens larvae.</a> Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).</li><li>Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+potentials+of+bulbar+respiratory+neurons+of+the+turtle.">Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle.</a> Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).</li><li>Bouverot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+breathing+in+birds+compared+with+mammals.">Control of breathing in birds compared with mammals.</a> Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).</li><li>Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+changes+in+the+isolated+brain+stem+of+the+goldfish.">Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish.</a> J Physiol. 71, 121-135 (1931).</li><li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat.">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li><li>Fournier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+stress+promotes+pathological+apneas+and+sex-specific+disruption+of+respiratory+control+development+in+newborn+rat.">Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat.</a> J Neurosci. 33, 563-573 (2013).</li><li>Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-natal+hypoxic+activity+of+the+central+respiratory+command+is+improved+in+transgenic+mice+overexpressing+Epo+in+the+brain.">Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain.</a> Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).</li><li>Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mechanisms+of+respiratory+rhythm+generation:+an+approach+using+in+vitro+preparation.">Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation.</a> Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).</li><li>Onimaru, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+respiratory+center+using+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations.">Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations.</a> Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).</li><li>Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+network+function+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+newborn+rats.">Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats.</a> Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).</li><li>Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+maturation+of+the+mouse+respiratory+rhythm-generator:+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies.</a> Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).</li><li>Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+state-dependent+mechanisms+for+respiratory+rhythm+and+pattern+generation.">Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation.</a> Prog Brain Res. , 165-201 (2007).</li><li>Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+respiratory+rhythm+generator+by+the+pontine+noradrenergic+A5+and+A6+groups+in+rodents.">Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).</li><li>Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+pons+in+hypoxic+respiratory+depression+in+the+neonatal+rat.">Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat.</a> Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).</li><li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions:+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat.">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li><li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Danneman, P. J., Mandrell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+five+agents/methods+for+anesthesia+of+neonatal+rats.">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).</li><li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats.">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).</li><li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups.">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> J App Physiol. 116, 47-53 (2014).</li><li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane,+propofol,+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats.">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).</li><li>Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+on+extracellular+Ca2+/K++antagonism+of+inspiratory+centre+rhythms+in+slices+and+en+bloc+preparations+of+newborn+rat+brainstem.">Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem.</a> J Physiol. 584, 489-508 (2007).</li><li>Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+acting+on+5-HT(1/2)+receptors+does+not+participate+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression.">5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).</li><li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+recordings+from+respiratory+neurons+in+the+medulla+of+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats.">Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).</li><li>Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+bursting+of+pre-+and+post-inspiratory+neurones+during+central+apnoea+in+mature+mice.">Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice.</a> J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).</li><li>Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+NMDA+receptors+in+the+respiratory+phase+transition+is+different+in+the+adult+guinea+pig+in+vivo+and+in+the+isolated+brain+stem+preparation.">Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation.</a> J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).</li><li>Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+volatile+anesthetics+on+respiratory+activity+and+chemosensitivity+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+the+newborn+rat.">Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat.</a> Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).</li><li>Gestreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Task2+potassium+channels+set+central+respiratory+CO2+and+O2+sensitivity.">Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity.</a> PNAS. 107, 2325-2330 (2010).</li><li>Caravagna, C., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+and+MEK+molecular+pathways+are+involved+in+the+erythropoietin-mediated+regulation+of+the+central+respiratory+command.">PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command.</a> Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).</li><li>Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+centrally+depresses+the+respiratory+rhythm+generator+of+neonatal+mice.">Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice.</a> Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).</li><li>Arata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+activity+of+the+neonatal+dorsolateral+pons+in+vitro.">Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro.</a> Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).</li><li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+functional+neuron+group+for+respiratory+rhythm+generation+in+the+ventral+medulla.">A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla.</a> J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).</li><li>St-John, W. M., Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizations+of+eupnea,+apneusis+and+gasping+in+a+perfused+rat+preparation.">Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation.</a> Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests or conflicts of interests to disclose.

تقدير دقيق لنشاط الجهاز التنفسي يمكن أن يكون تحديا. في الواقع، والتنفس هو وظيفة التي يمكن أن تكون تلقائية وطوعية، وأنه هو منظم وفقا للبيئة، واحتياجات الجسم، والحالة العاطفية والسلوك. وميزة هذا الأسلوب هو عزل العناصر العصبية المسؤولة عن إنتاج الأمر التنفسي. وهكذا، و?...

التنفس هو نشاط معقد وحيوي يسيطر عليها الدماغ، مما يسمح dioxygen (O 2) امتصاص وثاني أكسيد الكربون (CO 2) القضاء. يتم إنشاء محرك التنفسي المركزي عن طريق شبكة معقدة تقع في الدماغ في كل من الثدييات 1، 2 البرمائيات والزواحف 3، 4 الطيور والأسماك 5. حتى لو كان يمكن معالجتها دراسة التنفس في الجسم الحي، والتحقيقات الآلية الدقيقة تتطلب الوصول المباشر إلى شبكة التحكم في الجهاز التنفسي. تحقيقا لهذه الغاية، وضعت أدريان وBuytendijk مستحضر ذهبية انخفاض، والتي أقطاب توضع على سجل سطح الدماغ إيقاع لدت المرتبطة الخيشومية التهوية 5. وقد تم تكييف هذا النهج في وقت لاحق من قبل Suzue في عام 1984 6 لاستخدامها في القوارض حديثي الولادة. وقد أدى ظهور هذا المستحضر إلى تقدم كبير في علم الأعصاب في الجهاز التنفسي. لأنها بسيطة نسبيا، قدمت تقنية حيحرث غير قابلة للمجموعة واسعة من التحقيقات الأساسية من السلوكيات الحركية الإيقاعية وأصولهم في القوارض حديثي الولادة. الهدف العام من هذه الطريقة لتسجيل المتعلقات العصبية النشاط الشهيق، ودعا إيقاع مثل الجهاز التنفسي في التنفس الوهمية، التي تنتجها الشبكة في الجهاز التنفسي. هذه الطريقة يمكن أن تستخدم في مجموعة واسعة من أهداف البحث، واستهداف الردود الشهيق إلى تغيرات في الجهاز التنفسي أو الصيدلة في كل البرية نوع 7 و 8 المعدلة وراثيا الحيوانات. وبالنظر إلى أن التجارب التي تجرى عند درجة حرارة منخفضة، دون afferents الحسية، وتحت الظروف التي تركيزات الجلوكوز وO 2 في ACSF مرتفعة، وقد أثيرت تساؤلات بشأن مدى ملاءمة الفسيولوجية في الإشارات المسجلة. في حين أن هناك اختلافات واضحة بين المجراة في ظروف المختبر (على سبيل المثال، تردد رشقات نارية الشهيق) تظل الحقيقة أن وجودالعناصر الأساسية لشبكة الجهاز التنفسي 6 تجعل من الممكن لدراسة الإيقاع القوي يرتبط إلى وظيفة التماثل الساكن الحيوية 9،10. الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية لتسهيل الوصول المباشر إلى عناصر الدماغ للشبكة في الجهاز التنفسي، والتي هي بالكاد يمكن الوصول إليها في الجسم الحي، وخاصة في الأطفال حديثي الولادة. يتم وضع الدماغ في ظل ظروف رقابة صارمة: لا التضمين إيقاع سجلتها المدخلات وارد الطرفية من الرئتين أو الهيئات السباتي، والسماح للدراسة في التركيز على محرك الأقراص التنفسي المركزي نفسه 11. وهكذا، ويستخدم هذا الوصول إلى تطبيق مؤثرات وتسجيل إشارة خرج. وعلى النقيض من تخطيط التحجم التسجيلات، هو منظم إيقاع التنفس من قبل جميع مكوناته في جميع أنحاء الجسم (على سبيل المثال، وانتفاخ الرئة، chemosensors الطرفية)، مما يجعل من الصعب تطبيق مؤثرات دقيقة. فيالفئران ewborn، يتكون البروتوكول من تسجيل رابع إشارة بطني الجذر على الدماغ معزولة والحبل الشوكي اقتطاع، حافظت في الاصطناعي الدماغي الشوكي السائل (ACSF). يتكون إيقاع الناتجة عن الاستعدادات الحبل الشوكي الدماغ من رشقات نارية بطيئة الفردية التي ترتبط إشارة الشهيق 9. المعزولة الاستعدادات الحبل الشوكي الدماغ وللتسجيل بسهولة في الفئران من يوم بعد الولادة 0-4 (P0 - P4) 7. يستخدم هذا الأسلوب عادة لتقييم الاستجابة ميتة الشبكة في الجهاز التنفسي، وكذلك استجابة لفرط ثنائي أكسيد الكربون في الدم، والحماض أو المخدرات. ويرد بروتوكول نقص الأكسجين الحاد هنا. يتم الحصول على هذا التحفيز عن طريق سحب O 2 في ACSF. يستخدم هذا الأسلوب عادة لتقييم التسامح والقدرة على الاستجابة للإهانات ميتة. بروتوكول يؤدي الى الاكتئاب الإيقاع من الدقيقة الأولى حتى نهاية التعرض نقص الأكسجة (الشكل 1) 12. يتم عكس هذا الاكتئابخلال مرحلة ما بعد ميتة الانتعاش 12. وفيما يتعلق تصميم تجريبي، فمن المهم أن نلاحظ أن بونس، وتقع في الجزء منقاري من جذع الدماغ، لديه عمل كابح بشكل خاص على مولد إيقاع 8. وهكذا، والأعمال التحضيرية من الدماغ والحبل الشوكي الكامل منقاري عرض إيقاع أقل. يتم تحديد إدراج بونس في عينة معزولة للتسجيل وفقا لهدف التجربة 13؛ سوف دراسة تأثير جسري على شبكة النخاع المستطيل تتطلب التسجيلات مع وبدون بونس لمقارنة النتائج 14. وعلاوة على ذلك، واحدة من مزايا هذه التقنية إمكانية تمديد الجزء المنقاري لإعداد لتشمل الدماغ المتوسط ​​و / أو مناطق دماغية بينية 15،16، مما يجعل من الممكن لتقييم أثر هذه المناطق على الشبكة الجهاز التنفسي-بونتو النخاع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td>Use under hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>MAG510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPM306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLU501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>343-02-0006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td>
			<td>model 573000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential AC amplifier</td>
			<td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td>
			<td>model 1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moving averager</td>
			<td>CWE, Ardmore, PA, USA</td>
			<td>model MA-821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition system</td>
			<td>Dataq Instruments, Akron, OH, USA</td>
			<td>model DI-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart software</td>
			<td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism sofware</td>
			<td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection chamber</td>
			<td>Plastic box (e.g. petri box) will do</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td>
			<td>MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td>
			<td>MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson, Middleton, WI, USA</td>
			<td>MINIPULS 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

كما ذكر في المقدمة، واحدة من أهم مزايا هذه التقنية هو الوصول مباشرة إلى الدماغ لتطبيق مؤثرات المختلفة. وكمثال على ذلك، تم تطبيق نقص الأكسجة هنا الشكل 1. AB يعرض تسجيل بروتوكول الكامل، مع كل الظروف normoxic ونقص الأوكسجين. الشكل 1.CE يعرض إيقاع سجلت في ظروف n...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording at JoVE.com

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

الكهربية المعزولة على الاستعدادات الحبل الشوكي-جذع الدماغ من القوارض الوليد يسمح الشبكات العصبية التنفسية تسجيل الإخراج

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

electrophysiology-on-isolated-brainstem-spinal-cord-preparations-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K Views.  Laval University. The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Video: Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress has been made in our understanding of differences in response properties of neurons in different cortical layers5-8, yet there is still a great deal left to learn about whether and how neuronal populations encode information in a laminar-specific manner.
Existing multi-electrode array techniques, although informative for measuring responses across many millimeters of cortical space along the cortical surface, are unsuitable to approach the issue of laminar cortical circuits. Here, we present our method for setting up and recording individual neurons and local field potentials (LFPs) across cortical layers of primary visual cortex (V1) utilizing multi-contact laminar electrodes (Figure 1; Plextrode U-Probe, Plexon Inc).
The methods included are recording device construction, identification of cortical layers, and identification of receptive fields of individual neurons. To identify cortical layers, we measure the evoked response potentials (ERPs) of the LFP time-series using full-field flashed stimuli. We then perform current-source density (CSD) analysis to identify the polarity inversion accompanied by the sink-source configuration at the base of layer 4 (the sink is inside layer 4, subsequently referred to as granular layer9-12). Current-source density is useful because it provides an index of the location, direction, and density of transmembrane current flow, allowing us to accurately position electrodes to record from all layers in a single penetration6, 11, 12.

A fundamental issue in our understanding of cortical circuitry is how networks in different cortical layers encode sensory information. Here we describe electrophysiological techniques utilizing multi-contact laminar electrodes to record single-units and local field potentials and present analyses to identify cortical layers.

دراسة تصنيع المحلي باستخدام شبكة الاتصال متعدد القطب تسجيل رقائقي

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

العصبية الدائرة تسجيل من الصرصور الجهاز العصبي سليمة

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

إعداد نشط إيقاعي في الحبل الشوكي الدماغ القوارض الولدان المختبر وشريحة رقيقة

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

تسجيل بصري ذو صورة واحدة في شرائح الدماغ باستخدام صبغ حساس للجهد الكهربائي

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

تسجيل نشاط الشبكة في الدوائر الحساسة للألم في العمود الفقري باستخدام صفائف الأقطاب الدقيقة

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

فهم استجابات الخلايا العصبية الحركية لتحفيز الحبل الشوكي

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير تحفيز الحبل الشوكي - استكشاف الاستجابات الخلوية للخلايا العصبية الحركية من خلال الفيزيولوجيا الكهربية للرقعة المشبك 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

التحضير خارج الجسم الحي لشريحة الحبل الشوكي لتسجيل المشبك التصحيحي للخلية الكاملة في الخلايا العصبية الحركية أثناء تحفيز الحبل الشوكي

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...