The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children&#8217;s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.

Diese Methode erforderte den Einsatz von Versuchstieren, die von der Universität Laval Tierethikkommission (Protokoll # 2012-170) erlaubt. 1. Aufbau und Vorbereitung <ol><li> Lösungen <ol><li> Bereiten aCSF Stammlösungen gemäß den folgenden Rezepturen 7,17. Weitere Rezepte mit Konzentrationsschwankungen sind in der Literatur. Shop-Stammlösungen bei 4 ° C für bis zu einem Monat. <ol><li> Salzlösung: add 75,39 g NaCl (129 mM final); 2,5 g KCl (3,35 mM final); 0,81 g NaH2PO4 (0,58 mM final); 2,33 g MgCl &amp; sub2; (1,15 mM final); 1,85 g CaCl2 (1,26 mM). Man löst in 800 ml destilliertem Wasser, dann mit 1 l mit destilliertem Wasser zu füllen. </li><li> Bicarbonat-Lösung: fügen 17,65 g NaHCO 3 (21 mM final). Man löst in 900 ml destilliertem Wasser, dann auf 1 Liter mit destilliertem Wasser zu füllen. Variationen der Bicarbonat-Konzentration wird im pH-Schwankungen führen. </li><li> Glucose-Lösung: fügen 54,06g Glucose (30 mM Endkonzentration). Man löst in 400 ml destilliertem Wasser und dann auf 500 ml mit destilliertem Wasser zu füllen. </li></ol></li><li> Vorbereitung aCSF durch Verdünnen mit 100 ml Salzlösung, 100 ml Natriumbicarbonat-Lösung und 50 ml Glukoselösung in 1 l destilliertem Wasser. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bereiten Sie eine Glaselektrode durch Erwärmen und Strecken einer Glasröhre, bis er bricht. Sand auf der Spitze vor dem Gebrauch. Die Elektrode kann viele Zeit wiederverwendet werden, solange es sauber bleibt. </li></ol></li><li> Versuchsaufbau Hinweis: Die Setup-Details sind in Abbildung 2 dargestellt. <ol><li> Einschalten des Verstärkers, Bewegen Mittelwertbildner, Datenerfassungssystem, einem Temperaturregler und der Pumpe. Sie können die Signalverstärkung (Verstärkung = 10.000), die Filtration (niedrige Schwelle, 10 Hz; hohe Schwelle, 5 kHz) und die Abtastrate des Analog-Digital-Umwandlung des Rohsignals (2,5 kHz). </li><li> Füllen Sie eine Flasche mit aCSF und blasen es mit Carbogen (95% O 2 </sub&gt;, 5% CO 2). Induzieren eine bubbled- und erwärmten aCSF Fluss in der Aufzeichnungskammer (Volumen 5 ml) bei 4 ml / min. Halten der Temperatur in dem Aufnahmeraum auf 26 (± 1) ° C. pH-Wert sollte 7,4 in diesen Standardbedingungen ist. </li><li> Halten Sie 50 ml RT und Carbogen blasigen aCSF in einem 50-ml-Spritze in der Nähe der Dissektion Kammer. </li><li> Schalten Sie den Computer und starten Sie die Aufnahme-Software. </li></ol></li></ol> 2. Dissection <ol><li> Wiegen und das Geschlecht des Tieres visuell zu bestimmen (Männer haben eine längere anogenitalen Abstand, während Frauen haben eine kurze anogenitalen Abstand; Männchen Genitalien sind oft dunkel, während weiblichen Genitalien sind rosa). </li><li> Betäuben die neugeborenen Nagern durch eine der folgenden Optionen: cryoanesthesia (das Tier im Eis vollständig einzutauchen für 4 - 5 min 18), Injektion (equitensine bei 4 ml / kg) 19 oder Einatmen von volatilen Anästhetika (Isofluran 20 oder Ether-21). Konfirm ein ausreichender Ebene Anästhesie durch das Fehlen einer Pfotenrückzugsreflex. </li><li> Legen Sie das Tier auf der Bank, Bauchseite nach unten. Abschnitt der rostralen Teil des Kopfes koronal mit einem Skalpell am Bregma Ebene (durch die Haut und Schädel sichtbar). Führen Sie diesen Schritt unmittelbar nach dem das Tier narkotisiert. </li><li> Abschnitt der Körper koronal mit einem Skalpell unter den vorderen Mitglieder. </li><li> Entfernen Sie Haut, Muskeln, Fettgewebe und Eingeweide mit chirurgischen und dünne Scheren und Zangen. Da die Knochen sind weich in diesem Alter, seien Sie vorsichtig, um das Nervensystem nicht beschädigen. Führen Sie diesen Schritt auf der Bank. </li><li> Legen Sie die Zubereitung in der Dissektion Kammer. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze aufbewahrt, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. Von diesem Punkt an das Ende der Aufzeichnung, mit einem Mikroskop. </li><li> Auf der Rückenseite der Vorbereitung, schneiden Sie den Schädel und Wirbel von der rostral zur Schwanzteil entlang der mittleren Achse mit einer chirurgischen und dünne Scheren und Zangen. Öffnen Sie die Schnitt Schädelund Wirbeln, um das Nervengewebe freizulegen. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze strored, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Mit der Zange, entfernen Sie die Arachnoidea, eine, die die Oberfläche des Nervengewebes dünne Gewebe. Bewahren Sie die Pia mater und der Blutgefäße gegenüber dem Nervengewebe. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze aufbewahrt, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Platzieren Sie das Präparat mit der Rückenseite nach unten, und sorgfältig bringen den Hirnstamm und Rückenmark, indem die Nerven und Bindegewebe mit der Schere, während Sie die Zubereitung vorhanden. Ein dorsalen Zugang ist ebenfalls möglich. Halten Sie die Wurzeln und Nerven so lange wie möglich. Entfernen Sie die Knochen, um den Hirnstamm und Rückenmark zu isolieren. Verwenden Sie die aCSF in der Spritze aufbewahrt, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Entfernen Sie das Kleinhirn und Rest rostral Strukturen durch Schneiden sie mit dem Skalpell. Verwenden Sie die aCSF im Nadel gespeichert werden, um die Herstellung mit Sauerstoff zu versorgen. </li><li> Gegebenenfalls in Abhängigkeit experimental Design, entfernen Sie die Brücke mit dem Skalpell durch einen Frontalschnitt ventral des unteren Kleinhirnarterie 22. Beachten Sie, dass das Halten der gesamten Brücke wird den Rhythmus bei Ratten zu verlangsamen und vollständig zu hemmen sie in Mäusen. Präparate, die nur das Schwanzteil der Brücke sind zeigen eine Atem-ähnliche Aktivität mit einer stabilen Frequenz am C4 Wurzel. </li></ol> 3. Aufnahme <ol><li> Legen Sie die Zubereitung in der Aufnahme Kammer, Bauchseite nach oben. Befestigen Sie die Vorbereitung mit Stiften im untersten Teil des Rückenmarks und rostral-größten Teil des Hirnstamms. </li><li> Unter Verwendung einer Spritze zu der Elektrode durch die Nadel verbunden ist, induzieren eine Vertiefung in der Elektrode (Glas Spitze einen Durchmesser von 150 bis 225 um) durch Herausziehen des Spritzenkolbens, um die Elektrode teilweise zu füllen mit aCSF. </li><li> Mit einem Mikromanipulator, vorsichtig die Elektrode in der Nähe von einer der vierten Vorderwurzeln. Andere ventralen Wurzeln könnte auch präsentieren eine Atem-ähnliche Aktivität (z.g., XII Hirnnerv, C1 ventralen Wurzel). </li><li> Induzieren eine Vertiefung in der Elektrodentank über der Spritze durch Herausziehen des Kolbens, um sanft saugen Sie den Nerven rootlet. Dann vorsichtig die Elektrode zu bewegen, um es gegen das Rückenmark an. Anmerkung: Idealerweise wird die Größe des rootlet passt die Größe der Elektrodenöffnung und schafft so eine Dichtung zwischen den inneren und äußeren Kammern der Elektrode. Da Differenzverstärker werden üblicherweise für solche Aufzeichnungen verwendet, jede Öffnung zwischen der Innenseite der Elektrode und dem Aufzeichnungsraum reduziert die Qualität des Signals und macht es schwierig, Hintergrundrauschen zu beseitigen. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. </li><li> Aufzeichnung der durch die Herstellung unter normoxischen Bedingungen hergestellt Rhythmus (dh geperlt aCSF mit Carbogen: 95% O 2 und 5% CO 2) für mindestens 20 min, um die Basislinienparameter der Zubereitung bestimmen. </li><li> Schalten Sie die Perfusion von Carbogen blasigen aCSF zuaCSF Stimulus (dh mit 95% N 2 und 5% CO 2 für Hypoxie Stimulus perlt) für 15 min. Alter Expositionsdauer in Abhängigkeit der Versuchsprotokoll. Notieren Sie sich die Expositionsdauer auf das Aufzeichnungs und Tier Datenblatt. Verwenden Edelstahlrohre zwischen aCSF Flasche und der Kammer, wenn möglich, Gasdiffusion zu der Außenseite des Rohres zu vermeiden. </li><li> Schalten Sie die Durchblutung wieder in Standard Carbogen blasigen aCSF für mindestens 15 Minuten auf eine Erholung Aufnahme. Nehmen Sie diese auf dem Aufzeichnungs und Tier Datenblatt. </li><li> Beenden Sie die Aufnahme. </li></ol> 4. Statistische Analyse <ol><li> Aus dem integrierten Signal, die Berechnung der Frequenz wie die Anzahl der Bursts pro Minute (in Bursts / min ausgedrückt wird), die Amplitude der Differenz zwischen dem Ausgangswert und der Spitze des Bursts (in mV), die Burstdauer als die Dauer von Anfang bis zum Ende des Bursts (ausgedrückt in s), die Burst-Fläche wie die Fläche unter der curve des Bursts auf dem integrierten Signal (in mV · s) (Abbildung 3). </li><li> Berechnen Sie die Frequenz, Amplitude, Burstdauer und Burst-Bereich unter normoxischen (Baseline), hypoxische (Stimulus) und Post-hypoxischen (post-Stimulus) Erholung Bedingungen wie der Durchschnitt der letzten 5 Minuten der Aufnahmen für jede Bedingung. Analyse nicht den ersten Abschnitt einer jeden Zustand, da es eine Verzögerung zwischen dem Einschalten der Perfusion und aCSF Homogenisierung im Aufnahmeraum. </li><li> Express dann Stimulus (dh Hypoxie) und Post-Stimulus (dh post-hypoxischen) Recovery-Werte als Prozentsatz der Baseline-Werte für die entsprechende Aufnahme. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD </li></ol>

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	<li>Feldman, J. L., Del Negro, ., A, C., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+rhythm+of+breathing:+so+near,+yet+so+far.">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).</li><li>Taylor, A. C., Kollros, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+in+the+normal+development+of+Rana+pipiens+larvae.">Stages in the normal development of Rana pipiens larvae.</a> Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).</li><li>Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+potentials+of+bulbar+respiratory+neurons+of+the+turtle.">Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle.</a> Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).</li><li>Bouverot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+breathing+in+birds+compared+with+mammals.">Control of breathing in birds compared with mammals.</a> Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).</li><li>Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+changes+in+the+isolated+brain+stem+of+the+goldfish.">Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish.</a> J Physiol. 71, 121-135 (1931).</li><li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat.">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li><li>Fournier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+stress+promotes+pathological+apneas+and+sex-specific+disruption+of+respiratory+control+development+in+newborn+rat.">Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat.</a> J Neurosci. 33, 563-573 (2013).</li><li>Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-natal+hypoxic+activity+of+the+central+respiratory+command+is+improved+in+transgenic+mice+overexpressing+Epo+in+the+brain.">Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain.</a> Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).</li><li>Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mechanisms+of+respiratory+rhythm+generation:+an+approach+using+in+vitro+preparation.">Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation.</a> Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).</li><li>Onimaru, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+respiratory+center+using+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations.">Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations.</a> Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).</li><li>Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+network+function+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+newborn+rats.">Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats.</a> Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).</li><li>Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+maturation+of+the+mouse+respiratory+rhythm-generator:+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies.</a> Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).</li><li>Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+state-dependent+mechanisms+for+respiratory+rhythm+and+pattern+generation.">Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation.</a> Prog Brain Res. , 165-201 (2007).</li><li>Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+respiratory+rhythm+generator+by+the+pontine+noradrenergic+A5+and+A6+groups+in+rodents.">Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).</li><li>Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+pons+in+hypoxic+respiratory+depression+in+the+neonatal+rat.">Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat.</a> Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).</li><li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions:+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat.">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li><li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Danneman, P. J., Mandrell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+five+agents/methods+for+anesthesia+of+neonatal+rats.">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).</li><li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats.">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).</li><li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups.">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> J App Physiol. 116, 47-53 (2014).</li><li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane,+propofol,+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats.">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).</li><li>Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+on+extracellular+Ca2+/K++antagonism+of+inspiratory+centre+rhythms+in+slices+and+en+bloc+preparations+of+newborn+rat+brainstem.">Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem.</a> J Physiol. 584, 489-508 (2007).</li><li>Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+acting+on+5-HT(1/2)+receptors+does+not+participate+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression.">5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).</li><li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+recordings+from+respiratory+neurons+in+the+medulla+of+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats.">Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).</li><li>Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+bursting+of+pre-+and+post-inspiratory+neurones+during+central+apnoea+in+mature+mice.">Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice.</a> J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).</li><li>Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+NMDA+receptors+in+the+respiratory+phase+transition+is+different+in+the+adult+guinea+pig+in+vivo+and+in+the+isolated+brain+stem+preparation.">Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation.</a> J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).</li><li>Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+volatile+anesthetics+on+respiratory+activity+and+chemosensitivity+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+the+newborn+rat.">Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat.</a> Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).</li><li>Gestreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Task2+potassium+channels+set+central+respiratory+CO2+and+O2+sensitivity.">Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity.</a> PNAS. 107, 2325-2330 (2010).</li><li>Caravagna, C., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+and+MEK+molecular+pathways+are+involved+in+the+erythropoietin-mediated+regulation+of+the+central+respiratory+command.">PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command.</a> Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).</li><li>Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+centrally+depresses+the+respiratory+rhythm+generator+of+neonatal+mice.">Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice.</a> Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).</li><li>Arata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+activity+of+the+neonatal+dorsolateral+pons+in+vitro.">Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro.</a> Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).</li><li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+functional+neuron+group+for+respiratory+rhythm+generation+in+the+ventral+medulla.">A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla.</a> J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).</li><li>St-John, W. M., Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizations+of+eupnea,+apneusis+and+gasping+in+a+perfused+rat+preparation.">Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation.</a> Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests or conflicts of interests to disclose.

Genaue Quantifizierung der Atmungsaktivität kann eine Herausforderung sein. In der Tat ist die Atmung eine Funktion, die automatische und freiwillig sein kann, und das ist entsprechend der Umgebung, die Bedürfnisse des Körpers, den emotionalen Zustand und das Verhalten moduliert. Der Vorteil dieser Technik ist die Isolierung von den neuronalen Elementen zur Erzeugung des Atembefehl verantwortlich. Somit elektrophysiologische Aufzeichnungen von Hirnstamm-Rückenmarkspräparaten und Plethysmographie komplementäre Tech...

Die Atmung ist eine komplexe und Lebenstätigkeit vom Gehirn gesteuert, so dass Disauerstoff (O 2) Aufnahme und Kohlendioxid (CO 2) Beseitigung. Der zentraler Atemantrieb wird durch ein komplexes Netzwerk im Hirnstamm sowohl in Säugetieren als 1 liegt, Amphibien 2, Reptilien 3, 4 Vögel und Fische 5 generiert. Auch wenn die Untersuchung der Atmung kann in vivo verarbeitet werden, präzise mechanistische Untersuchungen erfordern einen direkten Zugang zu dem Atemsteuerungsnetz. Hierzu Adrian und Buytendijk entwickelt eine reduzierte Goldfischzubereitung, bei dem Elektroden auf der Hirnoberfläche aktenkundig den erzeugten Rhythmuskiemen Belüftung 5 verbunden. Dieser Ansatz wurde später von Suzue 1984 6 zur Verwendung bei neugeborenen Nagern angepasst. Das Aufkommen dieser Zubereitung zu erheblichen Fortschritten in der Atem Neurobiologie geführt. Da es relativ einfach ist, hat die Technik here zugänglich ist eine breite Palette von Grundlagenuntersuchungen der rhythmische motorische Verhaltensweisen und ihren Ursprung in der neugeborenen Nagern. Das allgemeine Ziel dieser Methode ist es, das neuronale Korrelat inspiratorischen Aktivität aufzuzeichnen, eine Atemwegsartigen Rhythmus genannte fiktive Atmung, ausgelöst durch den Atem Netzwerk hergestellt. Dieses Verfahren kann in einem breiten Spektrum von Forschungsziele eingesetzt werden, Targeting Inspirations antwortet Atemschwankungen oder Pharmakologie in beiden Wildtyp 7 und 8 transgenen Tieren. Da die Versuche werden bei einer niedrigen Temperatur durchgeführt wird, ohne afferenten Neuronen, und unter Bedingungen, bei denen die Konzentrationen von Glucose und O 2 in der aCSF hoch sind Fragen aufgeworfen über die physiologische Bedeutung des aufgezeichneten Signals. Zwar gibt es deutliche Unterschiede zwischen den in-vivo- und in-vitro-Bedingungen (z. B. die Frequenz des inspiratorischen Bursts) bleibt die Tatsache, dass das Vorhandensein vondie Kernelemente der Atemnetz 6 ist es möglich, eine robuste Rhythmus zu einer lebenswichtigen homöostatischen Funktion 9,10 assoziiert zu studieren. Das Grundprinzip hinter der Entwicklung und der Einsatz dieser Technik ist es, einen direkten Zugang zum Hirnstamm Elemente des Atem Netzwerk, das in vivo schwer zugänglich sind, insbesondere bei Neugeborenen zu erleichtern. Der Hirnstamm unter streng kontrollierten Bedingungen ausgesetzt: das aufgezeichnete Rhythmus nicht von peripheren afferenten Inputs der Lunge oder der Halsschlagkörpern moduliert, so dass die Untersuchung auf den zentralen Atemantrieb selbst 11 konzentrieren. Somit ist dieser Zugang genutzt, um Reize gelten und notieren Sie die Ausgangssignal. Im Gegensatz zu Aufzeichnungen Plethysmographie wird der Atemrhythmus durch alle ihre Komponenten im ganzen Körper moduliert (z. B. Lungendehnung, periphere Chemosensoren) und macht es schwierig, eine genaue Stimuli anzuwenden. In einem (newborn Ratte, das Protokoll aus der Aufzeichnung der vierten ventralen Wurzel Signal auf einem isolierten Hirnstamm und ein verkürztes Rückenmark, in künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) gehalten. Die von Hirnstamm-Rückenmarkspräparationen erzeugten Rhythmus der einzelnen langsamen Bursts, die auf der Inspirationssignal 9 verknüpft sind. Isolated Hirnstamm-Rückenmarkspräparationen sind leicht bei Ratten bespielbar von postnatalen Tag 0-4 (P0 - P4) 7. Dieser Ansatz wird häufig verwendet, um die hypoxische Reaktion der Atem Netzwerk und auch die Antwort auf Hyperkapnie, Azidose oder Arzneimittel zu bewerten. Eine akute Hypoxie Protokoll wird hier vorgestellt. Diese Stimulation wird durch Entnahme von O 2 in der aCSF erhalten; Dieser Ansatz wird häufig verwendet, um die Toleranz und Ansprechbarkeit auf hypoxische Beleidigungen beurteilen. Das Protokoll verursacht eine Rhythmus Vertiefung von der ersten Minute, bis zum Ende der Belichtung Hypoxie (1) 12. Diese Vertiefung wird umgekehrtwährend der post-hypoxischen Recovery 12. Bezüglich der Versuchsanordnung ist es wichtig, zu bemerken, daß die Brücke, an der rostralen Teil der Hirnstamm, eine hemmende Wirkung auf den Rhythmusgenerator 8. So Zubereitungen der volle Hirnstamm und Rückenmark rostral zeigen eine geringere Rhythmus. Einbeziehung der Brücke in der isolierten Probe auf die Aufzeichnung wird entsprechend dem Ziel des Experiments 13 bestimmt wird; das Studium der pontine Einfluss auf das verlängerte Mark Netz erfordern würde Aufnahmen mit und ohne die Brücke, um die Ergebnisse 14 zu vergleichen. Außerdem ist einer der Vorteile dieser Technik die Möglichkeit einer Ausdehnung des rostralen Teil der Vorbereitung auf Mesencephalon-und / oder Zwischenhirnregionen 15,16 umfassen, die es ermöglicht, die Wirkung dieser Regionen auf dem ponto-medullären Atemnetz bewerten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td>Use under hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>MAG510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPM306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLU501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>343-02-0006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td>
			<td>model 573000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential AC amplifier</td>
			<td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td>
			<td>model 1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moving averager</td>
			<td>CWE, Ardmore, PA, USA</td>
			<td>model MA-821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition system</td>
			<td>Dataq Instruments, Akron, OH, USA</td>
			<td>model DI-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart software</td>
			<td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism sofware</td>
			<td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection chamber</td>
			<td>Plastic box (e.g. petri box) will do</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td>
			<td>MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td>
			<td>MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson, Middleton, WI, USA</td>
			<td>MINIPULS 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

Wie in der Einleitung erwähnt, ist einer der wichtigsten Vorteile dieser Technik die direkten Zugang zum Hirnstamm verschiedene Stimuli anzuwenden. Als Beispiel wurde hier Hypoxie aufgetragen. Abbildung 1. AB zeigt eine vollständige Protokollaufzeichnung, mit beiden normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Abbildung 1.CE zeigt den Rhythmus in normoxischen Bedingungen (dh aufgezeichnet, sprudelte aCSF mit 95% O 2 und 5% CO 2 bei 26 ° C). Wie zuvor in diesem genaue...

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Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Elektrophysiologie auf isolierte Hirnstamm-Rückenmarks Zubereitungen aus Newborn Nagetiere Ermöglicht Neural Atem Netzwerk Output Recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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