The authors sincerely thank the Canadian Institutes of Health Research MOP 130258 and the Star Foundation for Children&#8217;s Health Research, along with the Molly Towell Foundation, for the provision of the research facility and financial support. The authors also sincerely thank Dr. Kinkead Richard for manuscript proofreading and advice.

שיטה זו נדרשה שימוש נושאי בעלי חיים, אפשרו על ידי הוועדה לאוואל אוניברסיטת בעלי החיים אתיקה (פרוטוקול # 2,012-170). 1. התקנה והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות aCSF על פי המתכונים 7,17 הבאים. מתכונים אחרים עם וריאציות ריכוז זמינים בספרות. פתרונות מניות חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיסת מלח: להוסיף 75.39 גרם של NaCl (129 מ&quot;מ סופי); 2.5 גרם של KCl (3.35 מ&quot;מ סופי); 0.81 גרם של NaH2PO4 (0.58 מ&quot;מ סופי); 2.33 גרם של MgCl2 (1.15 מ&quot;מ סופי); 1.85 גרם של CaCl2 (1.26 מ&quot;מ). ממיסים בכ -800 מיליליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן למלא לL 1 עם מים distillated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון ביקרבונט: להוסיף 17.65 גרם של NaHCO 3 (21 מ&quot;מ סופי). ממיסים בכ -900 מיליליטר של מים distillated לאחר מכן למלא לL 1 עם מים מזוקקים. וריאציות של הריכוז ביקרבונט יגרמו וריאציות pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון גלוקוז: להוסיף 54.06גרם של גלוקוז (30 מ&quot;מ סופי). ממיסים בכ -400 מיליליטר של מים distillated לאחר מכן למלא 500 מיליליטר מים מזוקקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aCSF על ידי דילול של תמיסת מלח 100 מיליליטר, של פתרון ביקרבונט 100 מיליליטר, 50 מ&quot;ל ושל פתרון גלוקוז ב1 ליטר של מים מזוקקים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודת זכוכית על ידי התחממות ומתיחת צינור זכוכית עד שזה נשבר. חול במורד הקצה לפני השימוש. האלקטרודה ניתן לעשות שימוש חוזר הרבה זמן כל עוד הוא נשאר נקי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ניסוי הערה: פרטי ההגדרה מוצגים באיור 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המגבר, נע Averager, נתוני מערכת רכישה, בקר טמפרטורה ומשאבה. בדוק את ההגברה האות (רווח = 10,000), סינון (סף נמוך, 10 הרץ; סף גבוה, 5 kHz), וקצב הדגימה של אנלוגי להמרה דיגיטלית של אות הגלם (2.5 kHz). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק עם aCSF ובועה זה עם carbogen (95% O 2 </sub&gt;, 5% CO 2). לגרום bubbled- וחמם aCSF זרימה בתא ההקלטה (נפח 5 מיליליטר) בשעה 4 מיליליטר / דקה. החזק את הטמפרטורה בחדר ההקלטה ב 26 (± 1) מעלות צלזיוס. pH צריך להיות 7.4 בתנאים סטנדרטיים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 50 מיליליטר של RT וaCSF-בועות carbogen במזרק 50 מיליליטר ליד חדר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב ולהפעיל את תוכנת ההקלטה. </li></ol></li></ol> 2. Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול וחזותי לקבוע את מינו של בעל החיים (זכרים כבר ano-גניטלי מרחק, ואילו נקבות יש מרחק ano באיברי המין קצר; זכרי איברי מין הם בדרך כלל כהים ואילו איברי המין נקביים הם ורוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את מכרסמים שזה עתה נולד על ידי אחת מהאפשרויות הבאות: cryoanesthesia (לטבול לחלוטין בבעלי החיים בקרח 4 - 5 דקות 18), הזרקה (equitensine ב 4 מיליליטר / קילוגרם) 19 או שאיפה של חומרי הרדמה נדיפים (isoflurane או אתר 21 20). Confirm מטוס נאות של הרדמה על ידי היעדר רפלקס נסיגת כפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה על הספסל, פני הגחון למטה. סעיף החלק מקורי של הראש coronally עם אזמל ברמת גבחת (גלויה דרך העור והגולגולת). לבצע שלב זה מייד לאחר החיה מורדמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף הגוף coronally עם אזמל תחת החברים הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר עור, שרירים, רקמות שומן וקיבה עם מספריים וצבת כירורגית ודקים. מאז העצמות רכות בגיל הזה, להיות זהיר שלא לפגוע במערכת העצבים. לבצע שלב זה על הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההכנה בתא לנתיחה. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה. מנקודה לסוף ההקלטה זו, השתמש במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פניו הגב של ההכנה, לחתוך את הגולגולת וחוליות מהמקוריות לחלק הזנב לאורך הציר הבינוני עם מספריים וצבת כירורגית ודקים. פתח את הגולגולת לחתוךוחוליות במטרה לחשוף את רקמת העצבים. השתמש בaCSF strored במזרק לחמצן ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם הצבת, להסיר את קרום נואיד, רקמה דקה המכסה את פני השטח של רקמת העצבים. שמור קרום רך וכלי דם נגד רקמת העצבים. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההכנה עם הגב עם פנים כלפי מטה, ובזהירות להפיל את גזע המוח וחוט השדרה על ידי חיתוך העצבים ורקמות חיבור עם המספריים תוך החזקת ההכנה במקום. גישת גב היא גם אפשרית. שמור את השורשים ועצבי זמן רב ככל האפשר. הסר את העצמות לבודד את גזע המוח וחוט השדרה. השתמש בaCSF מאוחסן במזרק לחמצן ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח הקטן ונותר מבנים מקורי על ידי חתכם עם האזמל. השתמש בaCSF מאוחסן במחט לחמצן ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין בהתאם experimenעיצוב טל, להסיר את פונס עם האזמל על ידי קדמי סעיף העטרה לעורק המוח הקטן הנחות 22. שימו לב שהשמירה על כל פונס יהיה להאט את קצב בחולדות ומלאה לעכב אותו בעכברים. הכנות הכוללות את חלק הזנב רק של פונס להציג פעילות כמו נשימה-עם תדר יציב בשורש C4. </li></ol> 3. הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ההכנה בחדר הקלטה, עם הפנים כלפי מעלה הגחון. תקן את ההכנה עם סיכות בחלק הנמוך ביותר של חוט השדרה והמקורי ביותר החלק מגזע המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק הצמוד לאלקטרודה על ידי מחטה, לגרום לדיכאון באלקטרודה (קוטר הקצה של כוס: 150-225 מיקרומטר) על ידי תלישת הבוכנה המזרק, כדי למלא באופן חלקי את האלקטרודה עם aCSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות micromanipulator, למקם בזהירות את האלקטרודה קרובה לאחד משורשי הגחון הרביעי. שורשי הגחון אחרים יכולים גם להציג כמו נשימה-פעילות (ה.ז., עצב גולגולת XII, C1 שורש הגחון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לדיכאון במכל אלקטרודה באמצעות המזרק ידי משיכת הבוכנה כדי לשאוב שָׁרשׁוֹן העצב בעדינות. לאחר מכן לעבור בזהירות את האלקטרודה ליישם אותו נגד חוט השדרה. הערה: באופן אידיאלי בגודל של שָׁרשׁוֹן מתאים לגודל של פתיחת האלקטרודה ובכך יוצר חותם בין התאים הפנימיים וחיצוניים של האלקטרודה. מאז מגברי ההפרש משמשים בדרך כלל להקלטות כאמור, כל פתיחה בין החלק הפנימי של האלקטרודה ותא ההקלטה מפחיתה את איכות האות ומקשה על למנוע רעש רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את קצב מיוצר על ידי ההכנה בתנאי normoxic (כלומר, aCSF מבעבע עם carbogen: 95% CO 2 O ו 5% 2) לפחות 20 דקות כדי לקבוע את הפרמטרים הבסיסיים של ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זלוף מaCSF-בועות carbogen לaCSF גירוי (כלומר, מבעבע עם 95% N 2, 5% CO 2 לגירוי היפוקסיה) במשך 15 דקות. לשנות משך חשיפה בהתאם לפרוטוקול הניסוי. רשום את משך החשיפה בגיליון הנתונים של ההקלטה ובעלי חיים. השתמש בצינורות נירוסטה בין בקבוק aCSF ותא בכל הזדמנות אפשרית, כדי למנוע דיפוזיה גז לחלק החיצוני של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זלוף בחזרה לaCSF-בועות carbogen הסטנדרטי לפחות 15 דקות להקלטת התאוששות. שיא זה בגיליון הנתונים של ההקלטה ובעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את ההקלטה. </li></ol> 4. ניתוח סטטיסטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהאות המשולבת, לחשב את התדירות כמו מספר ההתפרצויות לדקה (באה לידי ביטוי בהתפרצויות / min), משרעת כהפרש בין קו הבסיס והשיא של הפרץ (בא לידי ביטוי בmV), משך הפרץ כמשך מ המתחילה ועד סופו של הפרץ (באה לידי ביטוי בים), אזור הפרץ כאזור תחת נוכve של הפרץ באות המשולבת (באה לידי ביטוי בmV · ים) (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את התדירות, משרעת, משך פרץ ואזור פרץ תחת normoxic (בסיס), חוסר חמצן (גירוי) ותנאים שלאחר חוסר חמצן התאוששות (לאחר הגירוי) כממוצע של 5 דקות האחרונות של הקלטות לכל מצב. אל תנתח את החלק הראשון של כל מצב, כי יש עיכוב בין מיתוג הומוגניזציה זלוף וaCSF בתא ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה אז גירוי (כלומר, היפוקסיה) ופוסט-גירוי ערכי התאוששות (כלומר, לאחר חוסר חמצן) כאחוז מערכי הבסיס להקלטה המקבילה. הגעה התוצאות כאמצעי ± SD </li></ol>

<ol>
	<li>Feldman, J. L., Del Negro, ., A, C., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+rhythm+of+breathing:+so+near,+yet+so+far.">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annu Rev Physiol. 75, 423-452 (2013).</li><li>Taylor, A. C., Kollros, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+in+the+normal+development+of+Rana+pipiens+larvae.">Stages in the normal development of Rana pipiens larvae.</a> Anat Rec (Hoboken). 94, 7-13 (1946).</li><li>Takeda, R., Remmers, J. E., Baker, J. P., Madden, K. P., Farber, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+potentials+of+bulbar+respiratory+neurons+of+the+turtle.">Postsynaptic potentials of bulbar respiratory neurons of the turtle.</a> Respir Physiol. 64, 149-160 (1986).</li><li>Bouverot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+breathing+in+birds+compared+with+mammals.">Control of breathing in birds compared with mammals.</a> Physiol Rev. 58, 604-655 (1978).</li><li>Adrian, E. D., Buytendijk, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+changes+in+the+isolated+brain+stem+of+the+goldfish.">Potential changes in the isolated brain stem of the goldfish.</a> J Physiol. 71, 121-135 (1931).</li><li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat.">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> J Physiol. 354, 173-183 (1984).</li><li>Fournier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+stress+promotes+pathological+apneas+and+sex-specific+disruption+of+respiratory+control+development+in+newborn+rat.">Gestational stress promotes pathological apneas and sex-specific disruption of respiratory control development in newborn rat.</a> J Neurosci. 33, 563-573 (2013).</li><li>Caravagna, C., Kinkead, R., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-natal+hypoxic+activity+of+the+central+respiratory+command+is+improved+in+transgenic+mice+overexpressing+Epo+in+the+brain.">Post-natal hypoxic activity of the central respiratory command is improved in transgenic mice overexpressing Epo in the brain.</a> Respir Physiol Neurobiol. 200, 64-71 (2014).</li><li>Onimaru, H., Arata, A., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+mechanisms+of+respiratory+rhythm+generation:+an+approach+using+in+vitro+preparation.">Neuronal mechanisms of respiratory rhythm generation: an approach using in vitro preparation.</a> Jpn J Physiol. 47, 385-403 (1997).</li><li>Onimaru, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+respiratory+center+using+isolated+brainstem-spinal+cord+preparations.">Studies of the respiratory center using isolated brainstem-spinal cord preparations.</a> Neurosci Res. 21, 183-190 (1995).</li><li>Ballanyi, K., Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+network+function+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+newborn+rats.">Respiratory network function in the isolated brainstem-spinal cord of newborn rats.</a> Prog Neurobiol. 59, 583-634 (1999).</li><li>Viemari, J. C., Burnet, H., Bevengut, M., Hilaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+maturation+of+the+mouse+respiratory+rhythm-generator:+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Perinatal maturation of the mouse respiratory rhythm-generator: in vivo and in vitro studies.</a> Eur J Neurosci. 17, 1233-1244 (2003).</li><li>Rybak, I. A., Abdala, A. P., Markin, S. N., Paton, J. F., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+and+state-dependent+mechanisms+for+respiratory+rhythm+and+pattern+generation.">Spatial organization and state-dependent mechanisms for respiratory rhythm and pattern generation.</a> Prog Brain Res. , 165-201 (2007).</li><li>Hilaire, G., Viemari, J. C., Coulon, P., Simonneau, M., Bevengut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+respiratory+rhythm+generator+by+the+pontine+noradrenergic+A5+and+A6+groups+in+rodents.">Modulation of the respiratory rhythm generator by the pontine noradrenergic A5 and A6 groups in rodents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 143, 187-197 (2004).</li><li>Okada, Y., Kawai, A., Muckenhoff, K., Scheid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+pons+in+hypoxic+respiratory+depression+in+the+neonatal+rat.">Role of the pons in hypoxic respiratory depression in the neonatal rat.</a> Respir Physiol. 111, 55-63 (1998).</li><li>Voituron, N., Frugiere, A., Gros, F., Macron, J. M., Bodineau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diencephalic+and+mesencephalic+influences+on+ponto-medullary+respiratory+control+in+normoxic+and+hypoxic+conditions:+an+in+vitro+study+on+central+nervous+system+preparations+from+newborn+rat.">Diencephalic and mesencephalic influences on ponto-medullary respiratory control in normoxic and hypoxic conditions: an in vitro study on central nervous system preparations from newborn rat.</a> Neuroscience. 132, 843-854 (2005).</li><li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Danneman, P. J., Mandrell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+five+agents/methods+for+anesthesia+of+neonatal+rats.">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 386-395 (1997).</li><li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats.">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behav Brain Res. 272, 8-15 (2014).</li><li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups.">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> J App Physiol. 116, 47-53 (2014).</li><li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane,+propofol,+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats.">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respir Physiol Neurobiol. 205, 61-65 (2015).</li><li>Ruangkittisakul, A., Secchia, L., Bornes, T. D., Palathinkal, D. M., Ballanyi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+on+extracellular+Ca2+/K++antagonism+of+inspiratory+centre+rhythms+in+slices+and+en+bloc+preparations+of+newborn+rat+brainstem.">Dependence on extracellular Ca2+/K+ antagonism of inspiratory centre rhythms in slices and en bloc preparations of newborn rat brainstem.</a> J Physiol. 584, 489-508 (2007).</li><li>Cayetanot, F., Bodineau, L., Frugiere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-HT+acting+on+5-HT(1/2)+receptors+does+not+participate+in+the+in+vitro+hypoxic+respiratory+depression.">5-HT acting on 5-HT(1/2) receptors does not participate in the in vitro hypoxic respiratory depression.</a> Neurosci Res. 41, 71-78 (2001).</li><li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+recordings+from+respiratory+neurons+in+the+medulla+of+brainstem-spinal+cord+preparations+isolated+from+newborn+rats.">Whole cell recordings from respiratory neurons in the medulla of brainstem-spinal cord preparations isolated from newborn rats.</a> Pflugers Archiv : European journal of physiology. 420, 399-406 (1992).</li><li>Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+bursting+of+pre-+and+post-inspiratory+neurones+during+central+apnoea+in+mature+mice.">Rhythmic bursting of pre- and post-inspiratory neurones during central apnoea in mature mice.</a> J Physiol. 502 (Pt 3), 623-639 (1997).</li><li>Morin-Surun, M. P., Boudinot, E., Kato, F., Foutz, A. S., Denavit-Saubie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+NMDA+receptors+in+the+respiratory+phase+transition+is+different+in+the+adult+guinea+pig+in+vivo+and+in+the+isolated+brain+stem+preparation.">Involvement of NMDA receptors in the respiratory phase transition is different in the adult guinea pig in vivo and in the isolated brain stem preparation.</a> J Neurophysiol. 74, 770-778 (1995).</li><li>Otsuka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+volatile+anesthetics+on+respiratory+activity+and+chemosensitivity+in+the+isolated+brainstem-spinal+cord+of+the+newborn+rat.">Effects of volatile anesthetics on respiratory activity and chemosensitivity in the isolated brainstem-spinal cord of the newborn rat.</a> Hokkaido Igaku Zasshi. 73, 117-136 (1998).</li><li>Gestreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Task2+potassium+channels+set+central+respiratory+CO2+and+O2+sensitivity.">Task2 potassium channels set central respiratory CO2 and O2 sensitivity.</a> PNAS. 107, 2325-2330 (2010).</li><li>Caravagna, C., Soliz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+and+MEK+molecular+pathways+are+involved+in+the+erythropoietin-mediated+regulation+of+the+central+respiratory+command.">PI3K and MEK molecular pathways are involved in the erythropoietin-mediated regulation of the central respiratory command.</a> Respir Physiol Neurobiol. 206C, 36-40 (2014).</li><li>Tree, K., Caravagna, C., Hilaire, G., Peyronnet, J., Cayetanot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anandamide+centrally+depresses+the+respiratory+rhythm+generator+of+neonatal+mice.">Anandamide centrally depresses the respiratory rhythm generator of neonatal mice.</a> Neuroscience. 170, 1098-1109 (2010).</li><li>Arata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+activity+of+the+neonatal+dorsolateral+pons+in+vitro.">Respiratory activity of the neonatal dorsolateral pons in vitro.</a> Respir Physiol Neurobiol. 168, 144-152 (2009).</li><li>Onimaru, H., Homma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+functional+neuron+group+for+respiratory+rhythm+generation+in+the+ventral+medulla.">A novel functional neuron group for respiratory rhythm generation in the ventral medulla.</a> J Neurosci. 23, 1478-1486 (2003).</li><li>St-John, W. M., Paton, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizations+of+eupnea,+apneusis+and+gasping+in+a+perfused+rat+preparation.">Characterizations of eupnea, apneusis and gasping in a perfused rat preparation.</a> Respir Physiol. 123, 201-213 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests or conflicts of interests to disclose.

כימות מדויק של פעילות נשימה יכול להיות מאתגר. ואכן, נשימה היא פונקציה שיכולה להיות גם אוטומטי ורצון, וכי הוא מווסת בהתאם לסביבה, הצרכים של הגוף, המצב הרגשי וההתנהגות. היתרון של שיטה זו הוא הבידוד של האלמנטים העצביים האחראים לייצור את פקודת דרכי הנשימה. לפיכך, קלטות אלק...

נשימה היא פעילות מורכבת וחיונית הנשלטת על ידי המוח, המאפשרת dioxygen (O 2) ספיגה ופחמן דו חמצני (CO 2) חיסול. כונן הנשימה המרכזי מופק על ידי רשת מורכבת ממוקמת בגזע המוח בשני היונקים 1, דו-חיים 2, זוחלים 3, 4 ציפורים ודגים 5. גם אם המחקר של נשימה יכול להיות מעובד בvivo, חקירות מכניסטית מדויקות דורשות גישה ישירה לרשת שליטה בדרכי הנשימה. לשם כך, אדריאן וBuytendijk פיתחו הכנת דג זהב מופחתת, שבו אלקטרודות המונחת על משטח שיא גזע המוח קצב שנוצר קשור לאוורור זימים 5. גישה זו הותאמה לאחר מכן על ידי Suzue בשנת 1984 6 לשימוש במכרסמים שזה עתה נולד. כניסתו של תכשיר זה הובילה להתקדמות משמעותית בנוירוביולוגיה בדרכי הנשימה. מאז הוא פשוט יחסית, הטכניקה הציגה hבטרם ניתנים למגוון רחב של חקירות בסיסיות של התנהגויות מוטוריות קצביות ומקורותיהם במכרסמים שזה עתה נולד. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקליט את התשתית העצבית של פעילות שאיפה, קצב כמו-נשימה נקרא נשימה פיקטיבית, המיוצרת על ידי הרשת בדרכי הנשימה. שיטה זו יכולה להיות מועסק במגוון רחב של מטרות מחקר, מיקוד תגובות שאיפה לשינויים או פרמקולוגיה נשימה בסוג 7 ומהונדסים 8 שני חיות בר. בהתחשב בכך שהניסויים מבוצעים בטמפרטורה נמוכה, ללא afferents חושית, ובתנאים שבי הריכוזים של גלוקוז וO 2 בתוך aCSF גבוהים, שאלות הועלו לגבי הרלוונטיות הפיזיולוגיות של האות נרשמה. אמנם יש הבדלים ברורים בין in vivo ובתנאי מבחנה (למשל., התדירות של התפרצויות שאיפה) העובדה היא שהנוכחות שלמרכיבי הליבה של רשת הנשימה 6 לעשות את זה אפשרי ללמוד מקצב חזק הקשורים לתפקוד homeostatic חיוני 9,10. הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בטכניקה זו הוא להקל על גישה ישירה לאלמנטי גזע המוח של הרשת בדרכי הנשימה, שהם כמעט ולא נגישים in vivo, במיוחד בתינוקות. גזע המוח ממוקם בתנאים מבוקרים בקפדנות: קצב שנרשם לא מווסת על ידי תשומות מביא היקפיים מהריאות או גופי התרדמה, המאפשר המחקר להתמקד בכונן הנשימה המרכזי עצמו 11. לפיכך, גישה זו מנוצלת ליישם גירויים ולהקליט את אות הפלט. בניגוד לplethysmography הקלטות, קצב הנשימה הוא מווסת על ידי כל מרכיביו בכל הגוף (לדוגמא., התנפחות ריאות, chemosensors ההיקפי), ולכן קשה ליישם גירויים מדויקים. בעכברוש ewborn, הפרוטוקול מורכב מהקלטת האות הרביעית הגחון שורש בגזע מוח מבודד וחוט השדרה קטוע, נשמר בנוזל מלאכותי Cerebro-השדרה (aCSF). קצב שנוצר על ידי הכנות כבל גזע המוח-השדרה מורכב מהתפרצויות איטיות בודדות שצמודות לאות השאיפה 9. הכנות כבל גזע המוח-השדרה מבודדות בקלות לצריבה בחולדות מיום שלאחר הלידה 0-4 (P0 - P4) 7. גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את תגובת חוסר חמצן של רשת דרכי הנשימה, וגם התגובה לhypercapnia, חמצת או סמים. פרוטוקול היפוקסיה חריף מוצג כאן. גירוי זה מתקבל על ידי נסיגה של O 2 בaCSF; גישה זו משמשת בדרך כלל כדי להעריך את הסובלנות והיענות לעלבונות חוסר חמצן. הפרוטוקול גורם דיכאון קצב מהרגע הראשון ועד לסוף חשיפת היפוקסיה (איור 1) 12. דיכאון זה מתהפךבמהלך 12 התאוששות לאחר חוסר חמצן. בנוגע לעיצוב ניסיוני, חשוב לשים לב שפונס, הממוקם בחלקו מקורי של גזע המוח, יש פעולה מעכבת על הגנרטור קצב 8. כך, הכנות של גזע המוח וחוט השדרה מלאים מקורי להציג קצב נמוך יותר. הכללה של פונס במדגם המבודד להקלטה נקבעה בהתאם למטרת הניסוי 13; המחקר של השפעת פונטיני ברשת הלשד המוארכת ידרוש הקלטות עם ובלי פונס להשוות את התוצאות 14. יתר על כן, אחד היתרונות של שיטה זו היא האפשרות להארכת החלק מקורי של ההכנה לכולל mesencephalic ו / או אזורי diencephalic 15,16, כך שניתן להעריך את ההשפעה של אזורים אלה ברשת הנשימה פונטו-לשדי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>761036-5EA</td>
			<td>Use under hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>MAG510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOB999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SPM306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>GLU501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Linde</td>
			<td>343-02-0006&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suction electrode</td>
			<td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td>
			<td>model 573000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential AC amplifier</td>
			<td>A-M Systems, Everett, WA, USA</td>
			<td>model 1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moving averager</td>
			<td>CWE, Ardmore, PA, USA</td>
			<td>model MA-821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition system</td>
			<td>Dataq Instruments, Akron, OH, USA</td>
			<td>model DI-720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart software</td>
			<td>ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism sofware</td>
			<td>Graphpad, La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection chamber</td>
			<td>Plastic box (e.g. petri box) will do</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td>
			<td>MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, USA</td>
			<td>KITE-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Kanetec, Bensenville, IL, USA</td>
			<td>MB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson, Middleton, WI, USA</td>
			<td>MINIPULS 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiology on isolated brainstem-spinal cord preparations from newborn rodents allows neural respiratory network output recording

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to stimuli remain to be fully understood. To overcome the difficulty of accessing the brainstem in the whole animal, isolation of the brainstem and part of the spinal cord is performed. This preparation is maintained in artificial cerebro-spinal fluid where gases, concentrations, and temperature are controlled and monitored. The output signal from the respiratory network is recorded by a suction electrode placed on the fourth ventral root. In this manner, stimuli can be directly applied onto the brainstem, and the effect can be recorded directly. The signal recorded is linked to the inspiratory signal sent to the diaphragm via the phrenic nerve, and can be described as bursts (around 8 bursts per minute). Analysis of these bursts (frequency, amplitude, length, and area under the curve) allows precise characterization of the stimulus effect on the respiratory network. The main limitation of this method is the viability of the preparation beyond the early post-natal stages. Thus, this method greatly focuses on the study of the whole network without the peripheral inputs in the newborn rat.

כפי שצוין במבוא, אחד היתרונות החשובים ביותר של טכניקה זו היא הגישה הישירה לגזע המוח ליישם גירויים שונים. כדוגמא, היפוקסיה יושמה כאן. איור 1. א.ב. מציג הקלטת פרוטוקול מלאה, עם שני תנאי normoxic וחוסר חמצן. איור 1.CE מציגה את קצב שנרשם בתנאי normoxic (כלומר, aCSF...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording at JoVE.com

Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

אלקטרופיזיולוגיה בהכנות כבל מבודדות גזע המוח-השדרה מיילוד מכרסמים מאפשרת הקלטת תפוקת רשת הנשימה עצבית

While it is well known that the central respiratory drive is located in the brainstem, several aspects of its basic function, development, and response to ...

electrophysiology-on-isolated-brainstem-spinal-cord-preparations-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K Views.  Laval University. The central respiratory drive is located in the brainstem. Spontaneous respiratory motor output from an isolated brainstem-spinal cord is recorded by placing an electrode on the fourth ventral root. This experimental approach is valuable for pharmacological investigations or the assessment of respiratory challenges and genetic manipulations on rhythmic motor behavior.

Video: Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

עצבית במעגל הקלטה ממערכת עצבים מקק שלמה

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

הקלטה אופטית חד-שלמה של פוטון בפרוסות מוח באמצעות שימוש במתח-צבע רגיש

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

הקלטת פעילות רשת במעגלים נוסיקפטיים בעמוד השדרה באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרוניקה

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

מודל ראש סגור מבוקר אלקטרומגנטי של פגיעה מוחית טראומטית קלה בעכברים

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...

הבנת תגובות נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

מחבר זרקור: קידום גירוי חוט השדרה - חקר התגובות התאיות של נוירונים מוטוריים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

הכנת Ex vivo של פרוסת חוט השדרה להקלטת מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים במהלך גירוי חוט השדרה

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...