This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.

ملاحظة: بعض الخطوات للبروتوكول تتطلب أدناه العمل في غطاء الدخان نظيفة. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب طريقة المجهر تشريح الخميرة الرباعيات مجهزة هدفا بعد 10X العمل الطويلة لمراقبة spheroplasting. يجب تعيين المجهر يصل في غطاء محرك السيارة في وقت مبكر. إزالة الذراع micromanipulator وحامل لوحة من نطاق ووضع هذه العناصر في مكان آمن بعيدا عن منطقة العمل. 1. إعداد Spheroplasts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخميرة في ظل ظروف المطلوب. استخدام حوالي 2 × 10 8 خلايا لكل عينة، على سبيل المثال 4 مل من ثقافة في OD600 1.4 = 5 × 10 7 خلية / مل. على الرغم من معالجته فورا من عينات قد يكون من الأفضل في بعض الحالات، بالنسبة لمعظم التطبيقات، قسامات خلية يمكن تخزينها على الجليد لمدة تصل إلى 8 ساعات قبل أن يتم معالجتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وتدور في أجهزة الطرد المركزي السريري في تحديد 5 (2345 دورة في الدقيقة / 857.5 x ج) لمدة 3 دقائق لخلايا بيليه. </lI&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب المتوسطة مع الحرص على عدم فقدان الخلايا من بيليه. بلطف resuspend الخلايا في 1 مل العازلة ZK ثم إضافة 40 ميكرولتر 1 M dithiothreitol (DTT). احتضان 2 دقيقة مع خلط لطيف. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكريات resuspend في 1 مل العازلة ZK. إضافة 5 ميكرولتر من حل الطازجة من 100T zymolyase التي تم خلطها بشكل تام. احتضان لمدة 20-30 دقيقة في 30 ° C لإزالة جدار الخلية وإنتاج spheroplasts. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقايسة قطرات 10 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة المجهر لتحديد ما إذا كان spheroplasting كاملة. خلايا ينظر تحت المجهر تشريح دون ساترة. يجب أن تظهر خلايا منتفخة ومستديرة بدلا من مستطيل قليلا، وينبغي أن ليز التالية إضافة 20 ميكرولتر من الماء. إذا فشلت الخلايا لليز، والعودة العينة إلى 30 درجة مئوية، وإعادة فحص-كل 10 دقيقة حتى لوحظ المياه الناجم عن تحلل بسهولة. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend برفق ويغسل خلية بيليه طن 2.5 مل MES البارد / العازلة السوربيتول. خلايا بيليه كما كان من قبل (انظر الخطوة 1.2). و resuspend بلطف بيليه خلية في 300-400 MES الباردة ميكرولتر / العازلة السوربيتول. يمكن أن تبقى الخلايا على الجليد في هذه المرحلة لعدة ساعات. </li></ol> 2. كروموسوم نشر ملاحظة: الواجهات الزجاجية التي تقوم عليها سيتم الشرائح أو بإحدى هاتين العقوبتين تنتشر الكروموزومات coverslips-يجب أن يكون مستعدا في وقت مبكر. يجب أن يغطس كل شريحة أو ساترة في الماء، ثم ETOH، ثم يترك ليجف، ومصقول مع ورقة العدسة. إذا كان سيتم نشر الكروموسومات coverslips على أنه ينبغي اضافته ساترة لشريحة بشريط لاصق أو الاسمنت والمطاط. ما لم يذكر غير ذلك، فإن بقية بروتوكول يصف نشر على أي شريحة أو ساترة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor P20، الماصة 20 ميكرولتر من تعليق خلية على سطح شريحة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor P200، إضافة 40 ميكرولتر من 3٪ PFA / محلول السكروز وتخلط بلطف solutioن من قبل &quot;يحوم&quot; الشريحة مع اليد حتى تختفي خطوط انعراجي. ضع الشريحة تحت المجهر والتأكد من أن الخلايا هي في التركيز. يجب أن يكون الحل PFA أعدت-الطازج في غطاء الدخان في يوم من الاستخدام. ملاحظة: إذا لم يتم فحص البروتين من الاهتمام من خلال الأسلوب السابق، فإنه من المستحسن لإعداد الشرائح إضافية باستخدام الحلول التي تحتوي على 2 و 4٪ PFA لتحديد ما إذا كان الإبقاء على البروتين حساس للشروط التثبيت. يتم استخدام 4٪ PFA حل / السكروز في الحالات التي يكون من المرغوب فيه تصور ميكروتثبول تويولين المرتبطة بها. العيب من تركيز تثبيتي العالي هو أن الكروموسومات ستكون &quot;underspread،&quot; يميل 2٪ PFA أيضا أن تسفر الكروموسومات &quot;underspread&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipettor P200، إضافة 80 ميكرولتر من 1٪ Lipsol، دوامة كما كان من قبل لخلط حلول تماما بقدر الإمكان، وبدء الموقت. إذا Lipsol غير متوفرة، 80 ميكرولتر 1٪ NP40 أو 80 ميكرولتر درهم 2 O قد يكوناستبدال (انظر ممثل النتائج، الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاهدة الخلايا بعناية وبلطف دوامة الشريحة كل 15 ثانية. عندما هي lysed حوالي 80٪ من الخلايا (اختفى) إيقاف الموقت، إزالة الشريحة مباشرة من المجهر، إضافة 80 ميكرولتر من PFA / محلول السكروز، ودوامة لخلط. تحلل ينبغي أن يحدث من ما بين 30 و 90 ثانية بعد بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت. ملاحظة: إذا أظهرت عدة شرائح تحلل في نفس الوقت تقريبا، يمكن للمرء أن يغفل في نهاية المطاف المراقبة المجهرية للفترة المتبقية من الشرائح وببساطة توقيت بعناية الفترة ما بين إضافة lipsol وإضافة قسامة النهائية من تثبيتي. ومع ذلك، هذا الخفض القصير هو موثوق بها فقط عند إعداد عدة شرائح من نفس العينة. فمن الأفضل لمراقبة تحلل من كل عينة مجهريا عند إعداد الشرائح المختلفة من عينات أخذت في أوقات مختلفة أو من ثقافات مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة على سطح مستو نظيفة وتنتشر السائل عبر surfac unfrosted كامل(ه) من الشريحة باستخدام جانب نظيفة، يمكن التخلص منها الماصة المراعي التي عقدت تحت الغضروف المفصلي من &quot;بركة&quot; ولكن فوق سطح الشريحة نفسها، أي. لا &quot;أشعل النار&quot; على سطح الشريحة مع الماصة. لا إعادة استخدام الماصة على الشرائح المختلفة لتجنب تلوث العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها في غطاء الدخان. والمكونات النووية غير قابلة للذوبان يستقر على سطح الشريحة وربط ذلك. للتجارب كبيرة، والتخطيط لاستخدام الفضاء للخطوة التجفيف هو المهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جفت مرة واحدة، ويتم الحصول على أفضل النتائج من خلال التقدم إلى المرحلة المناعية في نفس اليوم. ومع ذلك، فإن الحل السكروز المجففة يضمن انتشار الصبغيات في &quot;العسل&quot; الذي يسمح بتجميد عينات: يمكن نقل الشرائح إلى مربع الشريحة البلاستيكية وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة سنة. </li></ol> 3. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في 0.2٪ صور فلو لمدة 30 ثانية. لإزالة العسل. الشرائح الهزيل علىميزة، مع حافة يستريح على منشفة ورقية، لإزالة بقايا صور فلو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في TBS 1X لمدة 5 دقائق لغسل. إزالة السائل الزائد بالانحناء الشرائح على الحافة، ولكن لا تسمح لهم تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرائح متجمد حتى الجانب، الماصة 300 ميكرولتر TBS / BSA على الشريحة عبر الجزء unfrosted من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في غرفة رطبة في RT لمدة 15 دقيقة. (حاوية بلاستيكية كبيرة تصطف مع المياه المشبعة مناشف ورقية تحت لوحة معدنية أو بلاستيكية مربع الشريحة مثقب مع المناشف الورقية المشبعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف الشرائح التي يستريح على حافة قصيرة من الشريحة على منشفة ورقية ويميل الشريحة ضد الدعم المناسب (مثل أنبوب اختبار رف). لا تسمح السطح ليجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق على الفور 80 ميكرولتر من TBS / BSA العازلة التي تحتوي على التخفيف المناسب من الأجسام المضادة الأولية. إذا الأجسام المضادة يحد من استخدام 40 ميكرولتر و22 × 22 مم ساترة. لمصل الأرنب الخام، وهذا هو عادة بين 1/50 و 1/500 التخفيف. ملاحظة:أداء المعايرة للتحضير الأجسام المضادة الجديدة. يتم اختيار إعداد معظم المخفف التي تعطي إشارة عالية فوق الخلفية. للسيطرة على مستوى تلوين الخلفية، ينبغي إعداد نواة من سلالة متحولة الحذف المناسب و / أو الشرائح المكررة وينبغي ملطخة المصل قبل المناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المصقول 22 × 50 مم ساترة على الشريحة تجنب الفقاعات. القيام بذلك عن طريق الضغط على ساترة بين الإبهام والسبابة على طول الحافة الطويلة في مواقع بالقرب من حافة واحدة قصيرة. عقد ساترة على زاوية 30 درجة بالنسبة إلى الشريحة، يتم إنزال أقصى حافة قصيرة من الأصابع حتى يستقر على الشريحة فقط داخل حافة &quot;بركة&quot; الأقرب إلى المنطقة متجمد من الشريحة. ثم خفض ببطء ساترة في حركة سلسة حتى الأصابع عقد لمسة الشريحة على مقاعد البدلاء، ثم يفرج عنه. لا تحاول ضبط الموقف من ساترة بمجرد أن يهبط. ملاحظة: إذا تم إعداد ينتشر كروموسوم علىcoverslips ملحقة (وليس مباشرة على سطح شرائح)، وهذه عينة ساترة تظل الملصقة على الشريحة في جميع أنحاء تلطيخ والغسيل الخطوات. سيتم وضع ساترة إضافية على رأس ساترة عينة لتوزيعها بالتساوي على حل الأجسام المضادة خلال تلطيخ ومن ثم التخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في غرفة رطبة مختومة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد نقل حافة بلوري الشرائح إلى شريحة زجاجية تلطيخ الرف ويغرق في جرة تلطيخ التي تحتوي على TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع بلطف الشريحة صعودا وهبوطا لإزالة ساترة. ليس محاولة لاستخدام الكثير من القوة للقيام بذلك. تغسل الشرائح 2X 10 دقيقة بواسطة غمر في TBS. إزالة الشرائح من الرف واستنزاف السوائل الزائدة عن طريق لمس حافة منشفة ورقية. لا تدع سطح جاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل تحت ضوء مهزوما، إضافة على الفور 80 ميكرولتر TBS / BSA تحتوي على 1/1000 تخفيف أضعاف تألقي الضد الثانوية مترافق (أو 40 ميكرولتر مع 22 × 22 مم ساترة). إعلاند ساترة كما كان من قبل واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في غرفة رطبة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة coverslips كما كان من قبل، واستنزاف الشرائح، والسماح للسطح في الهواء الجاف ل1-2 ساعة في الظلام. الشرائح الهزيل على مناشف ورقية كما كان من قبل. ملاحظة: إذا تم تنفيذ نشر على ساترة محمولة، فصل ساترة من الشريحة قبل التجفيف. ثم يتم تجفيفها Coverslips كما هو موضح الشرائح في الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل تحت ضوء مهزوما، إضافة حوالي 30 ميكرولتر من تصاعد المتوسط ​​تحتوي على دابي (ثلاث قطرات 10 ميكرولتر) ومن ثم خفض بعناية ساترة. إذا كان ينتشر هي coverslips على، ضع قطرات من تصاعد المتوسطة على شريحة نظيفة وخفض ساترة، الجانب كروموسوم إلى أسفل، على الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تزال تحت ضوء مهزوما، الانتظار 2 دقيقة لساترة لتسوية وختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضحة. وضع الشرائح في مربع الشريحة شقة. ملاحظة: للحصول على المجهر STED، جبل مع إطالة الذهب. استخدام 30 ميكرولتر من إطالة الذهبدون دابي والسماح لعلاج بين عشية وضحاها. ختم بطلاء الأظافر غير ضرورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض الشرائح التي widefield المجهر epifluorescence مع 40 أو الهدف 100X باستخدام فلتر مجموعة مناسبة للدابي على التركيز. اختياريا تخزين الشريحة في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة عدة أسابيع. لا تجمد. </li></ol>

<ol>
	<li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast.">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li><li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast.">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li><li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes.">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li><li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis.">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li><li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+identifies+Monopolin:+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I.">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li><li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+RecA-like+recombinases:+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis.">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li><li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1/Aurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint.">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes &amp; Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li><li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast.">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li><li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation.">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li><li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+:+a+publication+of+the.">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize...

الخميرة في مهدها خميرة الخباز توفر العديد من المزايا للدراسات الآليات الجزيئية من العمليات البيولوجية، بما في ذلك دراسة البروتينات التي تتحكم في وظيفة كروموسوم. على الرغم من أن هناك مزايا معروفة من مهدها الخميرة للدراسات الجينية والجزيئية والكيمياء الحيوية، ودراسات الخلوي لتوزيع البروتينات في نواة الخلية معقد بسبب صغر حجمها. نواة الخميرة النموذجية التي يبلغ قطرها ميكرون أقل من واحد، هو فقط حوالي 5 أضعاف الحد قرار من الضوء المرئي. وهكذا، فإن كمية المعلومات حول توزيع البروتينات النووية التي يمكن الحصول عليها من المناعية التقليدية أو باستخدام علامات بروتين فلوري، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، محدودة. نهج مفيد لتميز توزيع النووية الدقيقة من البروتينات السطحية كروموسوم الانتشار. هذا النهج ينطوي على إزالة جدار الخلية، وتعطيل الخلايا والأغشية النووية، والنماذج التالية محتويات غير قابلة للذوبان من نواة ليستقر على سطح شريحة المجهر. وتشمل هذه المكونات غير القابلة للذوبان المصفوفة النووية والكروموسومات. بالإضافة إلى السماح إزالة محتويات النووية القابلة للذوبان، التي تعزز من القدرة على الكشف عن لونين البروتينات ملزمة، الكروموسوم نشر نتائج الأسلوب في الضغط كبيرا من الكروموسومات مثل أن انتشار نواة لها أقطار حوالي 3-5 ميكرون (لنوى الانتصافي مضاعفا) و 2-3 ميكرون لنوى الإنقسامية مضاعفا. هذا الضغط يسمح الكشف عن التحتية النووية التي من الصعب نسبيا أو المستحيل حلها في نواة سليمة. والقصور الواضح للكروموسوم نشر هو إمكانية أن الإجراء قد نشر جزئيا أو كليا يعطل بنية الفائدة. ومما يثير القلق بشكل خاص هو أن كروموسوم ملزمة بروتين معين قد تضيع نتيجة لهذا الإجراء الانتشار. هذا شو المضاعفات المحتملةأن تبقى دينار في الاعتبار عند تفسير البيانات. مثال واحد من البروتين التي تعتبر حساسة لإجراء نشر هو بيتا تويولين. تحت بعض الظروف، المغزل، التي تتألف أساسا من تويولين، يتم الاحتفاظ خلال نشر 3. التصور من المغزل في كثير من الأحيان من المفيد تنظيم نوى الفائدة. ومع ذلك، تصور تويولين يتطلب العلاج مع تثبيتي تركيز عال. يتم فقدان مغزل وفقا للشروط القياسية الموضحة أدناه. يوضح هذا المثال، عند تحليل توزيع بروتين لم يسبق توصيفها، من المهم أن تختلف تركيز تثبيتي لتحديد مدى حساسية البروتين هو هذا الاختلاف. على الرغم من القلق بشأن تأثير الظروف نشر على بنية الصبغي، فقد ثبت فائدة وقوة الأسلوب تنتشر في العديد من السياقات ولها فائدة واسعة في توصيف الإنقسامية، وخصوصا الخلايا الانتصافي 4-7. TWس استخدمت أساليب نشر على نطاق واسع. أول هذه الطرق، التي وضعتها تسريحة وجيرو 8، ويتجنب استخدام المنظفات ويمكن أن تسفر عن منتشرة الاستعدادات التي يبدو أن لها نسبيا المحفوظة جيدا التشكل كروموسوم عندما الملون لDNA محددة صبغ دابي. ومع ذلك، وهذه الطريقة من الصعب نسبيا لاتقان وجودة انتشار نوى يختلف بشكل كبير، وعندما تتم مقارنة منطقة واحدة من الانزلاق إلى مناطق أخرى. هذه المشكلة يمكن أن يعقد النهج الكمي التي تنطوي على تصوير العديد من الأنوية غير محددة من شريحة واحدة لتجنب الحصول على البيانات التحيز. الكروموسوم الثاني نشر الطريقة، التي وضعتها LOIDL وكلاين 1، ينطوي على موازنة التثبيت بواسطة امتصاص العرق، مع تحلل وإزالة الضغط لونين التي يروج لها حل المنظفات. عندما أدائها على الوجه الصحيح، وهذا الأسلوب يعطي نتائج استنساخه جدا مع أقل التباين من منطقة إلى منطقة مقارنة لطريقة تسريحة وجيرو. ويركز هذا العرض على modifieنسخة يوميا من طريقة LOIDL وكلاين، بسبب موثوقيتها والبساطة. كروموسوم نشر ليست معقدة أو تستغرق وقتا طويلا. ما يصل الى 100 الشرائح يمكن أن تكون على استعداد لالمناعية في يوم واحد. وعلاوة على ذلك، قد يتم تخزين انتشار الاستعدادات في الثلاجة لسنوات قبل المناعية، وبالتالي مختبرات يمكن أن تتطور مستودعا للهوامش كروموسوم المجمدة التي يمكن استخدامها عندما تنشأ أسئلة البيولوجية الجديدة أو أصبح الكواشف تلطيخ الجديدة المتاحة. يتم استخدام طريقة كروموسوم نشر الأكثر شيوعا في تركيبة مع المناعية وwidefield مضان المجهر، ولكن من الممكن أيضا لإعداد الشرائح لسوبر قرار ضوء أساليب المجهرية مثل استنزاف الانبعاث المستحث (STED) المجهري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymolyase</td>
			<td>US Biological&#160;</td>
			<td>Z1004</td>
			<td>Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4&#176;C until ready for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipsol&#160;</td>
			<td>L.I.P. Ltd&#160;</td>
			<td>no longer commercially available</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>USB</td>
			<td>19628</td>
			<td>Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75x25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard coverslip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-E or 12-540-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High resolution coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200 solution</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>P-7417</td>
			<td>Prepare 0.2% (v/v) solution in water.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4&#176;C for up to a month.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector 
			Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-1</td>
			<td>Store slides containing dried spreads in slots at -20&#176;C. Also, use as a wet chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-816</td>
			<td>Use as a wash basin for slides.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface spreading and immunostaining of yeast chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

ظهور انتشار نوى يعتمد بشكل حاسم على التوازن بين تثبيت كروموسوم وإزالة الضغط. حتى عندما يتم متوازنة الكواشف بشكل صحيح، يمكن أن يحدث الاختلاف في درجة كروموسوم دي الضغط في مناطق مختلفة من نفس الشريحة و / أو بين الشرائح المختلفة. وبالتالي، ينبغي تقييم نوعية ينتشر في منطق?...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes at JoVE.com

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

surface-spreading-and-immunostaining-of-yeast-chromosomes

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Views.  University of Chicago. A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Video: Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

الطمع القائم على فحص التفاعل خارج الخلية (AVEXIS) للكشف قابلة منخفضة تقارب التفاعلات مستقبلات يجند خارج الخلية

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

طريقة بسيطة لDNA الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لسحق الكروموسومات

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

تحليل الزمانية المكانية من Cytokinetic الأحداث في الخميرة الانشطار

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...