Name: dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster at JoVE.com

نود أن نشكر دونالد جاهز وكيفن موسى لتعليم JPK وتخيلي إجراء تشريح القرص الأصلي. كما نشكر بوني Weasner للقرص الأعضاء التناسلية في الشكل 1B والقرص العين في الشكل 2A، براندون Weasner عن الشكل 3، ومركز بلومينغتون الأسهم ذبابة الفاكهة ذبابة عن البقع والضفة الدراسات التنموية ورم هجين عن الأجسام المضادة. وقد تم دعم CMS بواسطة راتبا من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) GCMS التدريب المنحة (T32-GM007757)، وجورج بوتنام زمالة أبحاث فرانك، وزمالة أبحاث روبرت بريجز. ويدعم JPK من خلال منحة من المعهد الوطني للعيون (R01 EY014863)

1. إعداد يرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق بيتري 35 ملم مع عازلة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اليرقات في طبق بتري والسماح لهم تسبح حولها لبضع دقائق (الخطوة التنظيف الذاتي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقات إلى مجموعة من العازلة تشريح على طبق تشريح القائمة على السيليكون. يجب أن تكون على حافة واحدة من لوحة هذا التجمع. تتكون لوحة تشريح حل السيليكون التي تم سكب وتصلب داخل طبق بتري الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة باستور، ضع مجموعة أكبر من العازلة تشريح في منتصف لوحة التشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام # 5 ملقط، نقل يرقة واحدة تنظيفها من تجمع صغير إلى مجموعة أكبر من العازلة تشريح. </li></ol> 2. الخشنة تشريح اليرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين اليرقة لا تزال ضمن مجموعة كبيرة من العازلة تشريح قفل اليرقة مع ملقط. زوج واحد من ملقط ينبغي أن تستخدم للاستيلاء على السنانير الفم بينما يتم استخدام زوج آخر من ملقط لعقد أنيمالله لا يزال (والاستيلاء على يرقة بلطف في 1/3 طول الجسم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثابتا زوج من ملقط تحتوي على بشرة بالقرب من السنانير الفم حين سحب بسرعة بقية الجسم بعيدا مع الزوج الثاني من الملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تبدأ اليرقة بتمزيق ستشعر بيان طفيف في التوتر. الافراج عن يرقة من ملقط والسماح ل &quot;الشجاعة&quot; لليرقة لسفك بها. وهذا يسمح للأقراص تخيلي أن تبقى في التشكل وضعها الطبيعي ويمنعهم من التعرض للتشوه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج واحد من ملقط فهم السنانير الفم مرة أخرى لعقد الواجهة الأمامية لليرقة في مكان. استخدام زوج آخر من ملقط إزالة 2/3 أقل من اليرقات بما في ذلك الشجاعة الداخلية. ملاحظة: ستكون معقدة تحتوي على السنانير الفم، وأقراص العين antennal، نصفي الدماغ، والعقدة البطنية، والغدد اللعابية، وبعض الأقراص الساق، ويبقى بشرة المغطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من ملقط إزالة بلطف بشرة المغطي، والغدد اللعابية، وأقراص الساق والأنسجة الأخرى. ملاحظة: الأنسجة إلا أنه ينبغي أن يظل هو السنانير الفم، وأقراص العين antennal، نصفي الدماغ، والعقدة البطنية (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.1-2.5 مع يرقات إضافية لمدة 15-20 دقيقة. ملاحظة: أقراص تخيلي التي تبقى في المخزن تشريح لفترات أطول من الوقت تميل إلى أن تتحلل وستظهر في نهاية المطاف أنها أقل من عينات مثالية لتصويرها. وهكذا، وبعد مدة أقصاها 20 دقيقة يجب نقل جميع أنسجة تشريح لتثبيتي PLP (انظر أدناه). </li></ol> 3. تثبيت وتلون الأنسجة مع الأجسام المضادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipetman P-200، ونقل الأنسجة تشريح لكوب الساعات التي تحتوي على امتصاص العرق البارد ليسين-بريودات (حزب العمال التقدمي) مثبت. الحد من حجم نقل عازلة تشريح إلى 50 ميكرولتر للحد من التخفيف من حزب العمال التقدمي. تأكد من قطع رأس بشفرة الحلاقة بحيث افتتاح غيض هو كبير بما يكفي لاستيعاب الأنسجة تشريح. باستخدام زوج من ملقط أوإبرة التنغستن تضمن تشريح الأنسجة وغرقت تماما من أجل التثبيت السليم للتحدث. احتضان الأنسجة تشريح في تثبيتي PLP البارد لمدة 45 دقيقة. هذه الحضانة يمكن أن تتم في RT دون الانفعالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام pipetman P-200، ونقل الأنسجة تشريح لغسل عازلة (RT) باستخدام طرف الأصفر خفض آخر لمدة 45 دقيقة. حجم الحد من حزب العمال التقدمي نقل إلى 50 ميكرولتر للحد من التخفيف من غسل العازلة. ملاحظة: جميع أنسجة تشريح يجب مغمورة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مجموعات من 20-30 تشريح الأنسجة إلى 1.5 مل microfuge أنبوب. ملاحظة: إذا تم الجمع بين أعداد أكبر من المجمعات القرص العين antennal داخل أنبوب، هناك إمكانية أن الأنسجة في الجزء السفلي من الأنبوب لن يتعرض بشكل صحيح إلى الأجسام المضادة. لأفضل النتائج يجب أن لا يزيد عن 20-30 المجمعات القرص العين antennal الحالي ضمن أنبوب واحد. سوف تشريح الأنسجة تستقر في قاع microfuge أنبوب. الخطوات لذلك، في لاحقة شحد ذاته pipetman لإزالة واستبدال غسل العازلة، حل حظر، والأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غسل العازلة واستبدالها مع 100 ميكرولتر من عرقلة الحل: 10٪ مصل الماعز العادي في غسل العازلة. في احتضان RT مع دوران طيف على أحد كبار المدورة الجدول لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل إزالة الحجب واستبدالها مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية التي تم مخففة بشكل مناسب في 10٪ مصل الماعز العادي. في احتضان RT مع دوران طيف لمدة 16 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة الأولية واستبدالها مع 750 ميكرولتر من غسل العازلة. وضع أنابيب على nutator والسماح لnutate في RT لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية يمكن حفظ (مخزن في 4 درجات مئوية) وإعادة استخدامها في وقت لاحق. يمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة عدة مرات مساعدة في الحد غير محددة وملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح رؤساء لتستقر في قاع الأنبوب، ثم إزالة غسل العازلة وإضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية التي تم المخفف مناسب في 10٪ مصل طبيعي. في احتضان RT مع دوران طيف ل2̵1، 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حلول الأجسام المضادة الثانوية من الأنسجة واستبدالها مع 500 ميكرولتر من غسل العازلة. تسمح الأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام P-200 وتلميح قطع الأصفر، ونقل جميع أنسجة تشريح لمجموعة من غسل العازلة التي تم وضعها على طبق تشريح. في حين الشروع في الخطوة التالية من تشريح ما يرام، فإن احتضان الأنسجة في غسل العازلة. هذا يساعد على إزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة. </li></ol> 4. تشريح الجميلة في العين Antennal القرص مجمعات وتصاعد على الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج واحد من ملقط لقفل بشرة بواسطة السنانير الفم مع الجانب البطني من مجمع أسفل. مع الزوج الثاني من ملقط إزالة فصوص الدماغ اثنين عن طريق إغلاق ملقط الثانية في الفضاء بين أقراص المخ والعين (الشكل 3، السهم الأحمر) وبسرعة سحب الدماغ بعيدا عن السنانير الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الاستمرار في التمسك السنانير الفم، قرصة قبالةالأنسجة أقرب وقت ممكن للاتصال بين قسم antennal من القرص العين antennal والسنانير الفم (الشكل 3، السهم الأزرق). ملاحظة: يجب أن تكون المجمعات القرص العين antennal خالية من جميع الأنسجة (الشكل 1A). تستمر حتى تم تشريح جميع الأنسجة المرجوة المرجوة التي يمكن وضعها على الشرائح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لعزل الجناح، haltere والساق وأقراص تخيلي التناسلية (الشكل 1B-E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة اثنين من قطع صغيرة من المناديل الورقية (حجم coverslips) حوالي 3 في. بصرف النظر على طبق تشريح. وضع شريحة زجاجية على الطبق - يجب أن قطعتين من المناديل الورقية تكون تحت نهايات الشريحة. هذا سيمنع الشريحة من الالتصاق إلى قاعدة سيليكون للطبق تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام P-20 مع تلميح غير المصقول، إضافة 9 ميكرولتر من وكيل لمكافحة تبييض لمنتصف شريحة المجهر والزجاج. هذا يمنع تبييض الأنسجة عند عرضها مع الفلورسنتالضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نفس الطرف غير المصقول، وجمع كل أسطوانة العين antennal وإضافتها إلى قطرة مكافحة تبييض كاشف. تقليل كمية من غسل العازلة التي يتم ترحيلها. في محاولة للحد من كمية من غسل العازلة إلى 10 ميكروليتر أو أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج من ملقط لفصل وانتشرت الأقراص العين antennal داخل قطرة مكافحة تبييض كاشف. تسمح أقراص لاحتضان في مكافحة تبييض كاشف لعدة دقائق. ملاحظة: سوف تتحول الأقراص واضح الأنسجة تمتص كاشف مكافحة التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فرشاة الرسام غرامة خفض بلطف ساترة على العينة. هذا يمنع تشكيل فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لعرض أقراص تخيلي العين antennal أو غيرها باستخدام الضوء أو المجهري الفلورسنت. </li></ol>

<ol>
	<li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria.">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 .</li><li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaginal disc development. , 747-841 (1993).</li><li>Held, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+Discs:+The+Genetic+and+Cellular+Logic+of+Pattern+Formation.">Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation.</a> Developmental and Cell Biology Series. 39, 460 (2002).</li><li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus.">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 .</li><li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects.">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li><li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+(Lepidoptera).">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li><li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage,+growth,+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, 263-290 (1969).</li><li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster:+morphogenesis,+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna.">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 165-242 (1972).</li><li>Anderson, D. T., Counce, S., Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+hemimetabolous+insects.">The development of hemimetabolous insects.</a> Developmental Systems. , 96-163 (1972).</li><li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+polyclones+in+insect+development.">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li><li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li><li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods.">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li><li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster.">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development.">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My+what+big+eyes+you+have:+how+the+Drosophila+retina+grows.">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li><li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome.">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics.">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells.">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li><li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina.">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li><li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye.">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li><li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog.">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li><li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye.">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li><li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic.">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li><li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina.">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li><li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3'+cis-regulatory+elements.">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li><li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li><li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster:+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific.">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li><li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages.">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li><li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype.">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li><li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atonal,+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina.">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li><li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless/Pax6+to+control+eye+specification.">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

على الرغم من أن هذا الإجراء قد ركزت بشكل كبير على العزلة ومعالجة لاحقة الأقراص العين antennal، فمن قابلة للتستخدم لعزل وتحليل الجناح، haltere والساق وأقراص التناسلية (الشكل 4). والتعديل الوحيد المطلوب من بروتوكول لعزل هذه الأقراص (على العكس من القرص العين antennal) هو ط?...

لأكثر من قرن من الزمان ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، فقد كان نظام رئيس الوزراء لدراسة تطوير والسلوك وعلم وظائف الأعضاء. ويمكن تقسيم تطور في الطيران إلى مرحلتين رئيسيتين: الجنينية وبعد الجنينية مع الكثير من أخذ مكان الأخير ضمن أحادي الطبقة الظهارة تسمى أقراص تخيلي 1-3. ونشرت رسومات من أقراص تخيلي لأول مرة في عام 1864 بحلول أغسطس ايزمان كجزء من له دراسة واسعة النطاق على التنمية الحشرات 1. هذه الأقراص تبدأ تنميتها خلال مرحلة التطور الجنيني، ونمط خلال مراحل اليرقات، البقاء على قيد الحياة تحلل النسج الهائل من المراحل المبكرة العذراء، وفي نهاية المطاف تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار الهياكل التي تم العثور عليها ضمن الكبار يطير 1-14. خلال نمو اليرقات كل أسطوانة يجعل عدة قرارات حاسمة بشأن مصير والشكل والحجم. ضمن الأعمار اليرقية الأولى والثانية، وكلف الأقراص مع اعتماد مصير الابتدائي، تأسيس العهدهينج حدود المقصورة، واعتماد الشكل الصحيح وتوليد العدد المطلوب من الخلايا 15-16. خلال الطور اليرقي الثالث وأوائل مرحلة ما قبل العذراء، ما زالت أقراص تخيلي لتقسيم ومنقوشة كما تعتمد خلايا مصائرهم الطرفية 16. خلال التاريخ المبكر للذبابة الفاكهة البيولوجيا التطورية، وتمت دراسة أقراص تخيلي تقريبا حصرا في سياق التطور الطبيعي وفي حالات محدودة حيث كانت الخسارة أو الربح من وظيفة متحولة قابلة للحياة. استخدام الأشعة السينية للحث على إعادة التركيب الإنقسامية يسمح للطفرات مميتة ليتم تحليلها في استنساخ خلايا داخل أنسجة اليرقات والكبار. تم تحسين هذه الطريقة من خلال إدخال الأساليب المعدلة وراثيا لتحليل الخسارة وكسب-وظيفة الطفرات في كل أنسجة اليرقات والكبار. عدد الأجسام المضادة، للصحفيين النسخي والفخاخ البروتين لوصف المشهد الجزيئي من النوع البري والأنسجة متحولة هو أيضا CONSTتزايد antly. جعلت استخدام هذه الواسمات الجزيئية لتحليل الخسارة وكسب-وظيفة استنساخ خلية متحولة من الممكن على نحو متزايد لاكتساب فهم في الوقت الحقيقي كيف تنحرف خلايا متحولة من أبناء عمومة النوع البري من خلال التنمية. لاتخاذ صحيح الاستفادة من هذه الأدوات والكواشف فمن الأهمية بمكان أن يكون الإعداد عالية الجودة من أقراص تخيلي التي يمكن مشاهدتها وتصويرها وتحليلها. الهدف من هذا المخطوط هو توفير بروتوكول الأمثل لعزل وإعداد مجمع القرص العين antennal (الشكل 1A). فإنه يمكن أيضا أن تستخدم بنجاح لعزل طائفة واسعة من أقراص إضافية بما في ذلك تلك التي تؤدي إلى الأجنحة، halteres والساقين T1-T3 والأعضاء التناسلية (الشكل 1B-E). هذا الإجراء، مع تعديلات طفيفة، وقد استخدمت لعزل أقراص تخيلي من ذبابة الفاكهة ما يقرب من ثمانين عاما. كما هو موضح أعلاه، حيث يتم التعبير عن معظم الجينات خلال موltiple مراحل التنمية وفي العديد من الأنسجة، وغالبا ما يكون من المستحيل لدراسة الآثار التي المسوخ فارغة لها على العين بأكملها كما يموت الحيوان جيدا قبل مرحلة اليرقات الطور الثالث. حققت أربع طرق دراسة الأنسجة الأكثر تقدما مثل شبكية العين بشكل ملحوظ أكثر لين العريكة. الأول هو طريقة Flippase (FLP) / Flippase إعادة التركيب الهدف (FRT) لتوليد الحيوانات المستنسخة خلية متحولة ضمن نوع الأنسجة البرية خلاف 17-19. في هذه الحالة يتم التعرف على الأنسجة متحولة بسبب عدم وجود علامة بصرية مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ويمكن مقارنة المحيطة البرية نوع الأنسجة التي GFP هو الحاضر (الشكل 2D). والثاني هو الأسلوب &quot;FLP التدريجي&quot; الذي يتم التعبير التحوير في مجموعة من الخلايا 20. في هذه الحالة يتم تحديد استنساخ الخلية وجود GFP وبالمقارنة مع الأنسجة المحيطة النوع البري الذي يفتقر مراسل GFP (الشكل2E). والثالث هو تحليل الفسيفساء مع علامة الخلية كظوم (MARCM) تقنية، الذي يجمع بين عناصر من استنساخ متحولة FLP / FRT وأنظمة التعبير عن FLP من 21. مع هذا الأسلوب التحوير يمكن التعبير ضمن مجموعة من الخلايا التي هي في نفس الوقت متحولة لموضع الجيني الفردي. مثل الحيوانات المستنسخة، FLP بها، ويتم تحديد استنساخ MARCM بحضور GFP وبالمقارنة مع الأنسجة المحيطة النوع البري الذي يفتقر إلى علامة GFP (الشكل 2F). وأخيرا، فإن الجينات ويبني رني يمكن التعبير داخل أنسجة تخيلي تحت سيطرة بنيات محددة المروج-GAL4. هذه الطرق الأربعة قد زادت من الاهتمام في دراسة أقراص تخيلي منذ استنساخ متحولة أو الإفراط في التعبير أو أنماط يمكن مقارنتها مباشرة إلى الأنسجة المجاورة نوع البرية. وقد تم تطوير الطريقة الموضحة في هذا الإجراء حتى أن الباحثين الذين يدرسون تطور آخر الجنينية من أنسجة البالغين في ذبابة الفاكهة،لا سيما تلك المتأتية من القرص العين antennal، سوف تكون قادرة على الحصول على الأنسجة جودة عالية للتحليل. على الرغم من جعلت الباحثين الأفراد تعديلات طفيفة، ظلت جوهر هذا الإجراء (الذي وصفنا هنا) دون تغيير إلى حد كبير. منذ الحصول على الأنسجة جودة عالية أمر بالغ الأهمية لدراسة أقراص تخيلي نأمل أن هذا البروتوكول المكتوبة والفيديو المرافق بمثابة مورد التدريس قيمة.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 KG</td><td>Used to create base for dissection plate</td></tr><tr><td>Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>Use the cover for dissection plate</td></tr><tr><td>#5 Dissecting Forceps</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>Forceps must be kept very sharp</td></tr><tr><td>9 well watch glass</td><td>Vairous Vendors</td><td></td><td>Used for fixation of imaginal disc complexes</td></tr><tr><td>50 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small Stir Bar</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Small enough to fit into Erlenmeyer Flask</td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microfuge Tubes</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Clear or Dark depending upon application</td></tr><tr><td>Microfuge Rack</td><td>Various Vendors</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Rotator</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>100 &amp;#956;l volume should not splatter at low setting</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>Serves as fixative</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>Used to make dissection and wash buffers</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>Used to make dissection and wash buffers</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>Used in the fixative solution</td></tr><tr><td>Sodium Periodate</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>Used in the fixative solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>MTX1568-1</td><td>Used to perforate imaginal discs</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>Used to dissolve paraformaldehyde</td></tr><tr><td>100% Normal Goat Serum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Serves as a blocking solution</td></tr><tr><td>Primary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td></tr><tr><td>Secondary Antibodies</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Molecular Probes</td><td>H-1000</td><td>Prevents bleaching of samples</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Glass Cover Slips 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Tissue</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Prevents Glass slides from adhering to silicone base</td></tr><tr><td>Panit Brush 000</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>Use to gently lower coverslip on to samples</td></tr></tbody></table>

dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster

جزء كبير من التنمية في مرحلة ما بعد الجنينية في ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، يحدث ضمن مجموعة من الهياكل التي تشبه الكيس تسمى أقراص تخيلي. هذه الأقراص تؤدي إلى نسبة عالية من الكبار الهياكل التي تم العثور عليها داخل ذبابة الكبار. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم الأمثل لاستعادة هذه الأقراص وإعدادهم للتحليل مع الأجسام المضادة للصحفيين النسخي والفخاخ البروتين. هو الانسب هذا الإجراء لأنسجة رقيقة مثل أقراص تخيلي، ولكن يمكن تعديلها بسهولة للاستخدام مع الأنسجة سمكا مثل اليرقات الدماغ والكبار المبيض. سوف بروتوكول مكتوبة والفيديو المصاحبة توجيه القارئ / المشاهد من خلال تشريح يرقات الطور الثالث، تثبيت الأنسجة، والعلاج من أقراص تخيلي مع الأجسام المضادة. بروتوكول يمكن استخدامها لتشريح أقراص تخيلي من الأصغر سنا يرقات الطور الأول والثاني كذلك. وميزة هذا البروتوكول هو أنه قصير نسبيا ولها أن تكونأون الأمثل للحفاظ جودة عالية من الأنسجة تشريح. ميزة أخرى هي أن الإجراء التثبيت أن يعمل يعمل بشكل جيد مع العدد الهائل من الأجسام المضادة التي تعترف البروتينات ذبابة الفاكهة. في تجربتنا، وهناك عدد قليل جدا من الأجسام المضادة الحساسة التي لا تعمل بشكل جيد مع هذا الإجراء. في هذه الحالات، فإن العلاج يبدو أن لاستخدام كوكتيل تثبيت البديل مع الاستمرار في اتباع المبادئ التوجيهية التي وضعناها عليها للخطوات تشريح وحضانات الأجسام المضادة.

طريقة الموضح أعلاه موثوق تنتج مواد ذات جودة عالية للتحليل مع تحقيقات في الموقع، للصحفيين النسخي، والفخاخ البروتين والأجسام المضادة. في الشكل 1 نعرض العين الهوائي، والأعضاء التناسلية، الجناح، haltere والساق الأقراص التي يتم استردادها بشكل روتيني مع هذا ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

26.6K Views.  Indiana University. The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Video: Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

تشريح الجهاز العصبي المركزي اليرقات في Melanogaster ذبابة الفاكهة

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

تشريح أقراص تخيلي من يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي 3

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Neuroscience

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Developmental Biology

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; شبكية العين

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

تشريح وكيمياء الهيستولوجية المناعية وتركيب أدمغة ذبابة الفاكهة اليرقية والبالغة لتصور الفص البصري

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

تشريح وتركيب<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء أقراص العين

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video