نشكر رون ديفيس ، Deutschbauer آدم ، والهيب هوب بأكمله مختبر في جامعة تورونتو للمناقشات والمشورة. CN معتمد من المنح المقدمة من المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشرية (رقم المنحة HG000205) ، RO1 HG003317 ، CIHR MOP - 84305 ، والجمعية الكندية للسرطان (# 020380). كان مدعوما من قبل JO التدريب ستانفورد برنامج الجينوم (المنحة رقم T32 HG00044 من المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشرية) ، والمعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم P01 GH000205). معتمد من قبل GG HG003317 RO1 NHGRI وجمعية السرطان الكندية ، وغرانت # 020380 ، TD وتسلسل دونيلي مركز معتمد في جزء من المنح المقدمة من المؤسسة الكندية للإبداع إلى الدكاترة. بريندا اندروز جرينبلات وجاك. معتمد من قبل هيئة علماء المسلمين في جامعة تورنتو زمالة فتح.

<ol>
	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+serotype+4+Streptococcus+pneumoniae+virulence+factors.">Large-scale identification of serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors.</a> Molecular microbiology. 45, 1389-1406 (2002).</li><li>Costanzo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genetic+Landscape+of+a+Cell.">The Genetic Landscape of a Cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Tong, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Pan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+toolkit+for+functional+profiling+of+the+yeast+genome.">A robust toolkit for functional profiling of the yeast genome.</a> Molecular cell. 16, 487-496 (2004).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+Function+and+Organization+of+the+Yeast+Early+Secretory+Pathway+through+an+Epistatic+Miniarray+Profile.">Exploration of the Function and Organization of the Yeast Early Secretory Pathway through an Epistatic Miniarray Profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Deutschbauer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+haploinsufficiency+revealed+by+genome-wide+profiling+in+yeast.">Mechanisms of haploinsufficiency revealed by genome-wide profiling in yeast.</a> Genetics. 169, 1915-1925 (2005).</li><li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomic+profiling:+identifying+the+functional+interactions+of+small+molecules+in+yeast.">Chemogenomic profiling: identifying the functional interactions of small molecules in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 793-798 (2004).</li><li>Lum, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Hillenmeyer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+TagModule+collection+for+parallel+genetic+analysis+of+microorganisms.">A universal TagModule collection for parallel genetic analysis of microorganisms.</a> Nucleic acids research. 38, e146-e146 (2010).</li><li>Oh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+annotation+and+drug+target+discovery+in+Candida+albicans+with+a+tagged+transposon+mutant+collection.">Gene annotation and drug target discovery in Candida albicans with a tagged transposon mutant collection.</a> PLoS pathogens. 6, (2010).</li><li>Nislow, C., Giaever, G., Stark, I., Stansfields, M. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+387.">Chapter 387.</a> Yeast Gene Analysis. , 387-414 (2007).</li><li>Pierce, S. E., Davis, R. W., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+barcoded+Saccharomyces+cerevisiae+gene-deletion+mutants+in+pooled+cultures.">Genome-wide analysis of barcoded Saccharomyces cerevisiae gene-deletion mutants in pooled cultures.</a> Nature protocols. 2, 2958-2974 (2007).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phenotyping+via+deep+barcode+sequencing.">Quantitative phenotyping via deep barcode sequencing.</a> Genome Res. , (2009).</li><li>Hamady, M., Walker, J. J., Harris, J. K., Gold, N. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Error-correcting+barcoded+primers+for+pyrosequencing+hundreds+of+samples+in+multiplex.">Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.</a> Nature. 5, 235-237 (2008).</li><li>Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-Level+Analysis+of+Genes+and+Functions+Affecting+Survival+During+Nutrient+Starvation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">System-Level Analysis of Genes and Functions Affecting Survival During Nutrient Starvation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 187, 299-317 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هنا ، حددت لدينا بروتوكول ، مع التعديل متواضعة ، ويمكن بسهولة أن تتكيف مع مجموعة واسعة من مجموعات القائمة من مجموعات متحولة barcoded من الكائنات الحية الدقيقة المختلفة لإنشاء مجموعات متحولة المفتاحية. فإننا نؤكد أنه على الرغم من أننا قد أبلغت بروتوكولا حول الطفرات ينقول المفتاحية للالخميرة الممرضة C. يمكن albicans ، يمكن تكييفها على بروتوكول مشابهة جدا لمجموعة واسعة من الفطريات وحيدة الخلية. تعديل هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد في البكتيريا 13 ، ومجموعات حاليا لعدد من العوامل الوراثية إضافية الفطرية والبكتيرية هي قيد الانشاء. في الوقت الحاضر ، يوفر هذا الاختبار الشامل فقط ، الجينوم على نطاق الشاشة غير منحازة للتفاعل الجينات جزيء صغير. ميزة واحدة مقنعة خاصة للمقايسة هو أن هناك حاجة إلى المعرفة المسبقة للجينات أو جزيء صغير. على الرغم من نطاق وقوة هذه المقايسات ، وعرقل نقلها إلى مختبرات أخرى إلى حد ما من الاستثمارات الرأسمالية الأولية والأدوات المعلوماتية لتحليل النتائج. مع اعتماد قراءة تسلسل الجيل المقبل جنبا إلى جنب مع أدوات قوية لتحليل ، فإننا نتوقع زيادة اعتمادها.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المضادات الحيوية </td><td> البائعين وأرقام التسويقي </td></tr><tr><td> كربنيسيلين </td><td> سيغما ، الجزء # C1613 </td></tr><tr><td> الكاناميسين </td><td> سيغما ، الجزء # K1876 </td></tr><tr><td> سبكتينوميسين </td><td> سيغما ، الجزء # S0692 </td></tr><tr><td> الكلورامفينيكول </td><td> سيغما ، الجزء # C0378 </td></tr><tr><td> الحمض النووي تنظيف ومجموعات التركيز </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep سبين Miniprep كيت </td><td> Qiagen ، الجزء # 27106 </td></tr><tr><td> HiSpeed ​​كيت ماكسي البلازميد </td><td> Qiagen ، الجزء # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick أدوات تنقية PCR </td><td> Qiagen ، الجزء # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick جل استخراج كيت </td><td> Qiagen ، الجزء # 28704 </td></tr><tr><td> PCR والكواشف الكهربائي </td><td></td></tr><tr><td> طق الحمض النووي بوليميريز (ميغاغرام مجانا) العازلة </td><td> نيو إنجلاند Biolabs ، الجزء # M0320L </td></tr><tr><td> Deoxynucleotide الحل ميكس </td><td> نيو إنجلاند Biolabs ، الجزء # N0447L </td></tr><tr><td> 25 ملم MgCl 2 </td><td> سيغما ، الجزء # 63036 </td></tr><tr><td> Agarose ، صبغ التحميل ، والحمض النووي وصمة عار مناسبة للهلام إستشراد </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> 10X تاي العازلة </td><td> سيغما ، الجزء # T8280 </td></tr><tr><td> 1 كيلوبايت زائد سلم DNA </td><td> Invitrogen ، الجزء # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD مرق </td><td></td></tr><tr><td> 10 غراما من خلاصة الخميرة </td><td> سيغما ، الجزء # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 غراما Bacto ببتون </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني ، وهي جزء # 211677 </td></tr><tr><td> 20 غرام من سكر العنب </td><td> سيغما ، الجزء # D9434 </td></tr><tr><td> ابوار </td><td></td></tr><tr><td> ماصات الأقنية (1000 ، 200 ، وميكرولتر 20) </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> المتاح الخزانات pipetting </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> 15 و 50 مل من أنابيب الطرد المركزي </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> 96 -- و384 بئر عميقة لوحات حسنا </td><td> Axygen العلمية ، الجزء # P - SQ - 2ML - CS &amp; P - 384240SQCS </td></tr><tr><td> 96 - جيدا و 384 جيدا لوحات PCR وفيلم الختم </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> الأسطوانة لوحة لوحات متعددة جيدا الختم </td><td> سيغما ، الجزء # R1275 </td></tr><tr><td> 30 درجة مئوية و 37 درجة مئوية تهز حاضنات لنمو البكتيريا والخميرة وعلى لوحات في أنابيب </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> الطفرات في المختبر ينقول </td><td></td></tr><tr><td> EZ - Tn5 Transposase </td><td> Epicentre الحيوية ، الجزء # TNP92110 </td></tr><tr><td> الإنتاجية العالية التحول </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT طقم الإعدادية البلازميد </td><td> حافة النظم البيولوجية ، الجزء # 84359 </td></tr><tr><td> البولي ايثيلين جلايكول ، الوزن الجزيئي 3350 </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> خلات ليثيوم </td><td> سيغما ، الجزء # 517992 </td></tr><tr><td> 6 كذلك لوحات ، ومعقمة </td><td> كورنينج ، الجزء # 3335 </td></tr><tr><td> 50 ملغ / مل يوريدين </td><td> سيغما ، الجزء # U3750 </td></tr><tr><td> 100X حل العازلة تريس - EDTA </td><td> سيغما ، الجزء # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> السلمون خصية DNA </td><td> سيغما ، الجزء # 1626 </td></tr><tr><td> نمو مجموعات barcoded </td><td></td></tr><tr><td> 48 لوحات جيدة ، وإذا تزايد الثقافات في لوحات </td><td> غرينر ، الجزء # M9437 </td></tr><tr><td> لوحة الأختام لاصقة </td><td> ABgene ، الجزء # AB - 0580 </td></tr><tr><td> 200 مل ثقافة القوارير </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> قادرة على امتصاص الطيف الضوئي </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> درجة الحرارة التي تسيطر عليها شاكر ل 250 مل أو قوارير معمل الهز </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> آمن قفل أنبوب Microcentrifuge ، 2 مل </td><td> إيبندورف ، الجزء # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> التهجين المعدات </td><td></td></tr><tr><td> فرن التهجين 640 </td><td> Affymetrix ، الجزء # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip Fluidic محطة 450 </td><td> Affymetrix ، الجزء # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray ماسح 3000 </td><td> Affymetrix ، الجزء # 00-0212 </td></tr><tr><td> حمام ماء يغلي مع رف العائمة </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> التهجين الاستهلاكية </td><td></td></tr><tr><td> Genflex صفيف 16K العلامات V2 </td><td> Affymetrix ، الجزء # 511331 </td></tr><tr><td> دينهارت في الحل ، والتركيز 50X </td><td> سيغما ، الجزء # D2532 </td></tr><tr><td> Streptavidin ، R - فيكوإيريترين المتقارن (SAPE) </td><td> Invitrogen ، الجزء # S866 </td></tr><tr><td> آمن قفل أنبوب Microcentrifuge ، و 0.5 مل </td><td> إيبندورف ، الجزء # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> صغير صارم البقع </td><td> تنوعا في مجال التكنولوجيا الحيوية ، الجزء # LTTM - 1000 </td></tr><tr><td> 0.5 M EDTA </td><td> BioRad ، الجزء # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10 ٪ توين </td><td> سيغما ، الجزء # T2700 </td></tr><tr><td> MES مونوهيدرات حامض مجانا </td><td> سيغما ، الجزء # M5287 </td></tr><tr><td> MES الصوديوم الملح </td><td> سيغما ، الجزء # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما ، الجزء # 71386 </td></tr><tr><td> 20X SSPE </td><td> سيغما ، الجزء # S2015 </td></tr><tr><td> البيولوجيا الجزيئية المياه الصف </td><td> سيجما ، الجزء # W4502 </td></tr><tr><td> التهجين الاشعال </td><td> مختلف الموردين (تحلية قياسي) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;البيوتين GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;البيوتين GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;البيوتين CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> التسلسل الاشعال : منهاج البورشيد </td><td> مختلف الموردين </td></tr><tr><td> UpTag الأمام (100uM) </td><td> 5 &#39;GCA CAA GAA GAC GGC ATA GCT CTT CGA CCG ATC T GAG CAC GTC GAT GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag عكسي (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG فريق التنسيق العالمي ACC ACC TCC CTT GAC ACT CTA CAC CCG GAC GCT CTT ATC T NNNNN GAC GTC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag الأمام (100uM) </td><td> 5 &#39;GCA CAA GAA GAC GGC ATA GCT CTT CGA CCG AAC GAG ATC T CTC GAA GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag عكسي (100uM) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG فريق التنسيق العالمي ACC ACC TCC CTT GAC ACT CTA CAC CCG GAC GCT CTT ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3` </td></tr><tr><td> قراءة UP - 1 علامة التمهيدي وما يليها (100uM) </td><td> 5 &#39;GAC GTC CTG CAG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> 1 وما يليها قراءة التمهيدي أسفل علامة (100uM) </td><td> 5 &#39;CGG TGT CGG TCT CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> 2 قراءة تسلسل مؤشر التمهيدي (معيار التمهيدي البورشيد R1) (100uM) </td><td> 5 &#39;ACT AC CTT TCC CTA CAC CCG GAC GCT CTT ATC تي 3&quot; </td></tr><tr><td> الكواشف تسلسل إضافية / معدات </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF أدوات تنقية PCR </td><td> Qiagen ، الجزء # 29051 </td></tr><tr><td> فراغ مضخة </td><td> أي بائع </td></tr><tr><td> Macherey - ناجل فراغ المنوع </td><td> Macherey ، ناجل ، الجزء # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen كوانت BR - IT dsDNA الفحص كيت </td><td> Invitrogen ، الجزء # Q32853 </td></tr><tr><td> أنابيب Invitrogen و qubit مقايسة </td><td> Invitrogen ، الجزء # Q32856 </td></tr><tr><td> 40 ٪ زائد الأكريلاميد N 1 ٪ ، N&#39; - الميثيلين مكرر الأكريلاميد ، 37.5:1 </td><td> بيو راد ، الجزء # 161-0148 </td></tr><tr><td> قاعدة تريس </td><td> سيغما ، الجزء # T1503 - 1KG </td></tr><tr><td> حمض البوريك </td><td> سيغما ، الجزء # B6768 - 500G </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> Teknova ، الجزء # E0306 </td></tr><tr><td> الأمونيوم بيرسلفات </td><td> سيغما ، الجزء # A3678 - 25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop ، الجزء # TEM001.25 </td></tr><tr><td> إيثيديوم بروميد الحل </td><td> Bioshop ، الجزء # ETB444.10 </td></tr><tr><td> خلات الأمونيوم 0.5M </td><td> Teknova ، الجزء # A2000 </td></tr><tr><td> 10MM tetrahydrate المغنيسيوم خلات </td><td> سيغما ، الجزء # M0631 - 100G </td></tr><tr><td> 1MM EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 </td><td> انظر 0.5M EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0 </td></tr><tr><td> الإيثانول </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> خلات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 5.2 </td><td> Teknova ، الجزء # S0297 </td></tr><tr><td> سرعة فراغ </td><td> مختلف </td></tr><tr><td> واحدة للقراءة مجموعة الكتلة الجيل </td><td> البورشيد ، الجزء # GD - 300 - 1001 </td></tr><tr><td> 36C تسلسل مجموعة V4 </td><td>البورشيد ، الجزء # FC - 104 - 4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> 10X TBE صفة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المبالغ </td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> 108 غرام </td><td> قاعدة تريس </td></tr><tr><td> 55 غراما </td><td> حمض البوريك </td></tr><tr><td> 40mL </td><td> 0.5M EDTA (الرقم الهيدروجيني 8.0) </td></tr><tr><td colspan="2"> إضافة درهم 2 O للاحتفال 1L </td></tr></tbody></table> 12 ٪ هلام بولي أكريلاميد صفة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مجلدات </td><td> الكواشف </td></tr><tr><td> 5.8 مل </td><td> 40 ٪ زائد الأكريلاميد N 1 ٪ ، N&#39; - الميثيلين مكرر الأكريلاميد ، 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 مل </td><td> DH 2 O </td></tr><tr><td> 2 مل </td><td> 10X TBE </td></tr><tr><td> 140 ميكرولتر </td><td> 10 ٪ الأمونيوم بيرسلفات </td></tr><tr><td> اجمالى حجم : 20ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag مزيج التمهيدي : Resuspend Uptag وBuptagkanmx4 في كل DDH 2 O عند 100 ميكرومتر ، ثم في مزيج نسبة 1:1 لتركيز النهائي من 50 ميكرومتر لكل منهما. المحل في -20 درجة مئوية. Downtag مزيج التمهيدي : Resuspend Dntag وBdntagkanmx4 في كل DDH 2 O عند 100 ميكرومتر ، ثم في مزيج نسبة 1:1 لتركيز النهائي من 50 ميكرومتر لكل منهما. المحل في -20 درجة مئوية. [أليغنوكليوتيد] مختلطة : Resuspend كل من oligos الثمانية التالية (معيار المحلاة) في DDH 2 O عند 100 ميكرومتر : Uptag ، Dntag ، Uptagkanmx ، Dntagkanmx ، Uptagcomp ، Dntagcomp ، Upkancomp ، Dnkancomp. مزيج حجم مساو من [أليغنوكليوتيد] ثمانية لتركيز النهائي من 12.5 ميكرومتر لكل منهما. 12X زارة التربية والعلم المخزون : لمدة 10 مل ، ويحل 0،7 ز MES مونوهيدرات حامض الحرة والصوديوم 1.93 غ من الملح زارة التربية والعلم في 8 مل البيولوجيا الجزيئية المياه الصف. بعد مزجها جيدا ، والتحقق من ضبط درجة الحموضة وإذا دعت الحاجة إلى 6،5-6،7 درجة الحموضة. يضاف الماء إلى وحدة تخزين ما مجموعه 10 مل. فلتر تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية محمية من الضوء (على سبيل المثال ، التفاف الأنبوب في احباط). إذا حل محل يصبح أصفر واضح أو بعد 6 أشهر. 2X تهجين العازلة : لمدة 50 مل ، ومزيج من 8.3 مل 12X زارة التربية والعلم المخزون (من 2.9.14) ، 17.7 مل من كلوريد الصوديوم M 5 ، 4.0 مل من EDTA M 0.5 ، 0.1 مل من 10 ٪ توين 20 (المجلد / المجلد) ، و 19.9 مل تصفيتها DDH 2 O. فلتر تعقيم. غسل ج : ميكس 300 مل 20X SSPE ، 1 مل توين 10 ٪ (المجلد / المجلد) ، 699 مل DDH 2 O. فلتر تعقيم. يغسل ب : ميكس 150 مل 20X SSPE ، 1 مل توين 10 ٪ (المجلد / المجلد) و 849 مل DDH 2 O. فلتر تعقيم. الاشعال الباركود التسلسل في متواليات التمهيدي UP - علامة ذيل 5 &#39;(جريئة) ومحول البورشيد متواليات محددة تدمج التمهيدي F و R. تسلسل متغير (مائل) يمثل علامة الفهرسة 5 مير المستخدمة في مضاعفة / مؤشر إلى القراءة. الذيل 3 &#39;(تحتها خط) يمثل التمهيدي مشتركة تطوق الباركود uptag ومطلوب لتضخيم الباركود الخميرة. في علامة - DOWN التمهيدي تسلسل 5 &#39;الذيل مطابقة لل5&#39; ذيل UP - العلامة الاشعال (تسلسل معين البورشيد) ، ومع ذلك ، يتم استبدال الذيل 3 &#39;(تحتها خط) مع الاشعال الشائعة التي تستخدم لتضخيم - DOWN علامة الباركود.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

بفضل التقدم في تقنيات الجيل القادم التسلسل ، علينا الوصول إلى تسلسل الجينوم جديدة يوميا تقريبا. وتيرة هذا التقدم يتسارع ، واعدا بمزيد من العمق والاتساع. في ضوء هذه التطورات غير العادية ، والحاجة إلى أساليب وسريع مواز لتحديد وظيفة الجين يصبح أكثر أهمية من أي وقت مضى. مجموعة من المسوخ الحذف الجينوم واسعة في الخمائر وهاء. القولونية كانت بمثابة حقوله المنتجة لتوصيف وظيفي لوظيفة الجينات ، ولكن هذا النهج ليس للتحجيم ، حذف الحالي الجينات النهج يتطلب كل واحد من آلاف الجينات التي تشكل الجينوم المراد حذفه والتحقق منها. يمكن فقط بعد اكتمال هذا العمل نسعى عالية الإنتاجية phenotyping. على مدى العقد الماضي ، وحسنت مختبرنا مجموعة من المنافسة ، المنمنمة الجينوم على نطاق عالية الإنتاجية ، المقايسات التي يمكن القيام بها بشكل متواز. هذه الموازاة ممكن لأن لإدراج &#39;علامات&#39; الحمض النووي ، أو &quot;الباركود&quot; في كل متحولة ، مع الباركود بمثابة وكيل لطفرة واحدة ويمكن قياس وفرة الباركود لتقييم اللياقة البدنية متحولة. في هذه الدراسة ، ونحن نسعى لملء الفجوة بين تسلسل الحمض النووي ومجموعات متحولة barcoded. لإنجاز هذا نقدم مجتمعة ينقول تعطل - المتوازية النهج الذي يفتح المقايسات الباركود موازية لمتسلسلة حديثا ، ولكن تتميز سيئة الميكروبات. لتوضيح هذا النهج الذي يقدم مجموعة جديدة المبيضات البيض تعطل barcoded وتصف كيف يمكن استخدام كلا ميكروأري القاعدة والجيل القادم التسلسل المنصات المرتكزة إلى جمع 10000 -- 1000000 الجينات الوراثية والجينات المخدرات التفاعلات في تجربة واحدة.

Watch this Scientific Journal Video about Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries at JoVE.com

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

قمنا بتطوير شامل وغير متحيز الجينوم واسعة لفهم الجينات شاشات المخدرات وتفاعلات الجينات والبيئة. وتعرض وسائل للكشف عن هذه المجموعات متحولة.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

competitive-genomic-screens-of-barcoded-yeast-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  University of Toronto. قمنا بتطوير شامل وغير متحيز الجينوم واسعة لفهم الجينات شاشات المخدرات وتفاعلات الجينات والبيئة. وتعرض وسائل للكشف عن هذه المجموعات متحولة.

Video: Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

تظاهرة فنية من الجامعة التهجين الجينومي المقارن صفيف الجينوم

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

مكتبة كبيرة إدراج الجينوم البيئية الإنتاج

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

تطوير التصوير والتحليل الآلي للشاشات الكيميائية الزرد.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

الجينومية MRI -- وهو من الموارد العامة للدراسة أنماط تسلسل الحمض النووي داخل الجينوم

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

الجينومية التحول من Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...