The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. P&#233;bay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. P&#233;bay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. P&#233;bay); Australian Research Council Future Fellowship (A. P&#233;bay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.

جمع عينة شعر الإنسان من الأفراد يتطلب موافقة أخلاقية من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في المؤسسات المضيفة وينبغي أن يتم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. 1. عزل الخلايا الكيراتينية من الشعر التقطه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد خارج الخلية مصفوفة (ECM) حل (أي Matrigel) على الجليد O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نصائح ماصة قبل المبردة، إضافة 200 ميكرولتر حل ECM إلى 12 مل من المبرد المتوسطة DMEM / F12. معطف لوحة 12-جيدا مع 1 مل من محلول ECM المخفف في كل بئر. احتضان لوحة المغلفة O / N عند 37 درجة مئوية. غسل لوحة مغطاة قبل تحسنت DMEM / F12 المتوسطة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الشعر البشري الأساسي من رأس الفرد عن طريق وضع الأصابع على مقربة من جذور الشعر ونتف الشعر في حركة واحدة سريعة وسلسة. تحقق للتأكد من أن كل شعرة جمعت يحتوي على بصيلات الشعر سليمة وتحديد مرحلة النمو للأمم المتحدة الشعردير مجهر تشريح (الشكل 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10/5 الشعر طور التنامي من كل فرد لاستخراج الخلايا الكيراتينية. التقطه عملية الشعر في أقرب وقت ممكن لضمان نجاح الاشتقاق من الخلايا الكيراتينية. ملاحظة: يوضح الشكل 1 مورفولوجية الشعر في مراحل مختلفة من دورة النمو. الشعر طور التنامي في مرحلة النمو، مع طبقة خارجية واضحة على البشرة المحيطة طول الشعر، والمعروفة باسم ORS. من ناحية أخرى، والشعر تساقط الشعر يمثل الشعر في طور الراحة وليس لديها ORS مرئية، ولكن لديه الكرة واضحة من الخلايا التي تغطي جذور الشعر، والمعروفة باسم انتفاخ تساقط الشعر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عينات الشعر في طبق بتري تحتوي على 10 مل من المضادات الحيوية ميكس لغسل لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص معقم وملقط، وقطع المفرط عمود الشعر، وترك جزء الشعر مع بصيلات الشعر سليمة وحول 0،5-1 سم من جذع الشعرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيئة تنظيم الاتصالات بعنايةnsfer جزء 1 الشعر في كل بئر من لوحة المغلفة ECM باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة 1 مل، إضافة حوالي 3 قطرات من خروج المغلوب المصل استبدال (KSR) متوسطة (~ 100-200 ميكرولتر) للعينات الشعر. ملاحظة: حافظ على شظايا الشعر على اتصال وثيق على سطح لوحة للسماح للمرفق واللاحقة كيراتينية ثمرة. إضافة وسائل الإعلام المفرط في هذه الخطوة قد يسبب شظايا الشعر لتطفو ويقلل من فرصة للنجاح المرفق الشعر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عينات الشعر في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ والسماح للبصيلات الشعر إرفاق O / N. في اليوم التالي، إضافة بلطف 3 قطرات أخرى من KSR المتوسطة (~ 100-200 ميكرولتر) للحفاظ على عينات الشعر رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة عينات الشعر يوميا للتأكد من أن بصيلات الشعر وقد أرفقت بنجاح. عموما الحجز على بصيلات الشعر هو واضح في غضون 1-3 أيام. الشعر الكثيف وعادة ما تكون أسهل إرفاق بالمقارنة مع الشعر الجميلة، والشعر الجميلة لديها أعلىاتجاه لتعويم التي تعيق عملية الحجز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن تعلق على الشعر للوحة المغلفة، إضافة 500 ميكرولتر من KSR المتوسطة إلى البئر. اتخاذ مزيد من الحذر عند إضافة المتوسطة كعينات الشعر ربما لم ترتبط بقوة. من هذه النقطة، وتغيير وسائل الاعلام كل يوم 2. ملاحظة: يجب أن يكون الامتداد الكيراتينية مرئية من المنطقة ORS من شظية الشعر بعد 3-7 أيام (الشكل 2A-B). السماح للالكيراتينية لتنمو لتصل إلى 14 يوما قبل الركض الخلايا كما هو موضح في المقطع التالي. </li></ol></li></ol> 2. صيانة والركض من الخلايا الكيراتينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل معطف لوحة 6 جيدا باستخدام أدوات طلاء مصفوفة. إضافة 680 ميكرولتر من المتوسطة التخفيف من عدة إلى كل بئر، تليها 6.8 ميكرولتر من محلول طلاء مصفوفة. يهز لوحة لضمان توزيع موحد من الحل مصفوفة طلاء على لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لوحة المغلفة لاحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. إزالةالحل طلاء مصفوفة قبل الطلاء من الخلايا الكيراتينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا الكيراتينية في تعليق خلية واحدة مع 500 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين لكل بئر لمدة 2-5 دقيقة عند 37 ° C. إبطال نشاط التربسين مع 500 ميكرولتر من مصل (على سبيل المثال، الجنين مصل بقري (FBS) المتوسطة) وجمع في أنبوب معقم 15 مل. إزالة شظية الشعر باستخدام ملقط معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا التي تحصد باستخدام haemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا لمدة 3 دقائق في 200 ز س. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتكرار الطرد المركزي. نضح في برنامج تلفزيوني و resuspend بيليه خلية في المتوسط ​​الطازجة الكيراتينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة أسفل 4 × 10 4 الخلايا الكيراتينية في بئر واحدة من لوحة المغلفة ECM في وجود الكيراتينية المتوسطة. الحفاظ على الخلايا الكيراتينية في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 (الشكل 2C). تغيير وسائل الاعلام كل يوم ومرور الخلايا عندما الثقافة ~ 80٪ متموجة، مبادرة الخوذ البيضاءالفصل قد يستغرق حوالي 2-7 أيام اعتمادا على عدد مرور وانتشار نسبة الخلايا الكيراتينية. ينبغي توسيع الخلايا الكيراتينية المشتقة لتوليد الأسهم المجمدة كافية باستخدام أساليب التجميد البطيء القياسية الحفظ بالتبريد 16. ملاحظة: شروط الثقافة وصفه تدعم التوسع في عدد السكان متجانسة من الخلايا الكيراتينية مع نموذجي الحصوه التشكل (الشكل 2C). في بعض الأحيان، عدد قليل من الخلايا الكيراتينية متباينة، مع التشكل كبيرة ومسطحة وفقدوا إمكانية الاستنساخ، يمكن ملاحظة في الثقافة. توصيف الخلايا القرنية يمكن أن يؤديها المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد cytokeratin 14 كما سبق وصفه (17). وينبغي أيضا أن يتم اختبار خطوط الخلايا الكيراتينية التي أنشئت لالميكوبلازما بعد 1-3 المقاطع باستخدام عدة متاحة تجاريا. </li></ol> 3. توليد hiPSCs من الخلايا الكيراتينية عن طريق Episomal المتجهات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل معطف لوحة 6 جيدا مع0.1٪ الجيلاتين (2 مل / جيد). السماح الجيلاتين لمعطف لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجربة برمجة، الكيراتينية استخدام في موعد أقصاه مرور 6. فصل الخلايا الكيراتينية في تعليق خلية واحدة مع 1 مل من 0.25٪ التربسين لكل بئر لمدة 2-5 دقيقة عند 37 ° C. تعطيل التربسين مع 1 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل (على سبيل المثال، وسائل الإعلام FBS) وجمع في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 x ج و resuspend الخلايا الكيراتينية في المتوسط. لوحة 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 الخلايا الكيراتينية لكل بئر في لوحة مهيلم O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي (يوم 0)، والتحقق من لوحة لضمان الخلايا هي 50-60٪ متموجة. ملاحظة: إذا الكيراتينية أقل من 50٪ ~ متكدسة أنها قد لا تنمو بشكل جيد بعد ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 0، نفذ ترنسفكأيشن من ناقلات episomal إعادة برمجة على الخلايا الكيراتينية، وذلك باستخدام نسبة من 8 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن إلى 2 ميكروغرام مجموع DNA البلازميد.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ 0.5 ميكروغرام لكل من 4 البلازميدات (pCXLE-EGFP، pCXLE-hOct3 / 4-shP53F، pCXLE-HSK، pCXLE-الهول) وتمييع في 100 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل (على سبيل المثال، OPTI-MEM). ملاحظة: يتم استخدام البلازميد pCXLE-EGFP لمراقبة الكفاءة ترنسفكأيشن في الخلايا الكيراتينية وليس مطلوبا لإعادة البرمجة الناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 8 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى DNA المخفف. مزيج عبها الأنبوب. السماح للمزيج رد فعل DNA للراحة دون عائق في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة الكيراتينية مع المتوسط ​​الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إضافة مزيج رد فعل الحمض النووي للثقافة الكيراتينية واحتضان في الحاضنة 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 4 ساعة. ملاحظة: لا ينصح لأداء لفترات طويلة ترنسفكأيشن O / N في القرنية لأنها تظهر بقاء منخفض بعد ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 4 ساعات بعد ترنسفكأيشن، استبدل المتوسطة الكيراتينية مع المتوسط ​​الطازجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 1 (1 يوم آخر العابرالخمج (العدوى))، وتغيير المتوسطة الخلايا الكيراتينية وتحقق كفاءة ترنسفكأيشن من خلال تقدير النسبة المئوية للخلايا إيجابية EGFP تحت المجهر الفلورسنت. وعادة ما يلاحظ&gt; 60-70٪ كفاءة ترنسفكأيشن لالكيراتينية الأولية باستخدام هذا البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 2، وتكرار ترنسفكأيشن كما هو موضح في الخطوة 3.5. أن اثنين transfections التوالي عادة تحقيق&gt; 90٪ كفاءة ترنسفكأيشن. ثقافة الكيراتينية عادة ما تصل التقاء بحلول نهاية ترنسفكأيشن الثاني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق 10 سم من الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEF) المغذية لكل رد فعل برمجة. إعداد مغذيات MEF المعطل ميتوتيكلي كما هو موضح سابقا (18). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل معطف طبق 10 سم مع 5 مل من 0.1٪ الجيلاتين لمدة 20 دقيقة على الأقل. لوحة 4 × 10 6 MEF المعطل ميتوتيكلي في صحن 10 سم في FBS المتوسطة. السماح للخلايا لتسوية وإرفاق O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3، هارسترة الخلايا الكيراتينية مع 0.25٪ التربسين كما هو موضح في الخطوة 3.2 و 3.3. Resuspend والخلايا الكيراتينية في KSR المتوسطة وصفيحة 90٪ من الخلايا الكيراتينية من 1 بئر من لوحة 6 جيدا في صحن 10 سم المغذية MEF مع KSR المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من يوم 4 وما بعده، تغيير المتوسطة KSR كل يوم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك بعد يوم 18، واستبدال مستنبت كل يوم الثاني على التوالي. ملاحظة: سوف الكيراتينية غير برمجتها تتوقف عن التكاثر، في حين المستعمرات hiPSC مع حدود المعرفة التي تشبه الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) ستخرج من يوم 14-21. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل المستعمرات hiPSC عن طريق تشريح اليدوي من يوم 21 وما بعده. تجنب المستعمرات hiPSC أن تتجمع معا بشكل وثيق وفقط اختيار المستعمرات hiPSC التي تكون مفصولة بشكل واضح من الآخرين. ملاحظة: المستعمرات hiPSC يمكن التقاطها في وقت سابق، ولكن المستعمرة مع حدود محددة قد لا يكون واضحا في نقطة زمنية سابقة نظرا لحجم مستعمرة صغيرة. قد تختلف كفاءة إعادة برمجة بين فرقويتأثر المريض erent في الخلايا الكيراتينية، وأيضا بسبب عوامل أخرى مثل عدد مرور أو معدل انتشار الخلايا الكيراتينية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتشريح اليدوي للمستعمرات hiPSC، استخدام إبرة 26G لخفض المستعمرات hiPSC تحت المجهر تشريح. قطع مستعمرة hiPSC إلى قطع صغيرة حول 300-600 ميكرون في الطول. نقل القطع من أحد hiPSC مستعمرة في لوحة التغذية MEF الجديدة (2.5 × 10 4 MEF / سم 2) لإنشاء خط نسيلي من hiPSCs. في البداية، ثقافة كل سطر نسيلي hiPSC في بئر واحدة من 12 لوحة أو ثقافة الجهاز أطباق جيدا، ثم توسع إلى 6 شكل لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خطوط نسيلي المعمول بها hiPSCs في KSR المتوسطة على مغذيات MEF. وبمجرد أن تصل إلى ثقافة 70-80٪ confluency مع المستعمرات hiPSC ~ 1.5 مم في القطر، hiPSCs مرور باستخدام الأساليب القياسية الأنزيمية الركض (Accutase، Dispase أو كولاجيناز IV) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تميز تأسيس خط hiPSCالصورة لتأكيد تعدد القدرات وقدرتها على التمايز إلى ممثل خلايا الطبقات الجرثومية الثلاث في المختبر و / أو في الجسم الحي 13،19. أيضا، خطوط hiPSC بشكل روتيني التجريبى أنشئت لالميكوبلازما باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا للتأكد من أنها خالية من مسببات الأمراض. مراقبة روتينية الاستقرار الجيني خطوط hiPSC التي كتبها تنميط نووي أو المستندة إلى مجموعة التباين في عدد النسخ (CNV) التحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, U141-U141 (2008).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells.">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine.">Generation of induced pluripotent stem cells from urine.</a> J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).</li><li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Peters, A., Zambidis, E., Ye, K., Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16.+Generation+of+nonviral+integration-free+induced+pluripotent+stem+cells+from+plucked+human+hair+follicles.">Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles.</a> Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks. , 203-227 (2012).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratching+the+surface+of+skin+development.">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li><li>Limat, A., Noser, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+cultivation+of+single+keratinocytes+from+the+outer+root+sheath+of+human+scalp+hair+follicles.">Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).</li><li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors.">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).</li><li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+hair+follicle+dermal+papilla+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells.</a> J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).</li><li>Muchkaeva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Hair+Follice+Dermal+Papilla+Cells.">Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells.</a> Acta naturae. 6, 45-53 (2014).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen. , (2013).</li><li>Sporl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+membrane+cholesterol+reveals+new+insights+into+epidermal+differentiation.">Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).</li><li>Conner, D. A., et al., Ausubel, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryo+fibroblast+(MEF)+feeder+cell+preparation.">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Current protocols in molecular biology. 23, Unit 23 22 (2001).</li><li>Pebay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+sphingosine-1-phosphate+and+platelet-derived+growth+factor+in+the+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells.">Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).</li><li>Myung, P., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+bulge+in+hair+regeneration.">Dissecting the bulge in hair regeneration.</a> J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hair+cycle.">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy.">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li><li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives:+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper.">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).</li><li>McKernan, R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+point+of+large-scale+collections+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).</li><li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells.">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, U1145-U1112 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+rate+of+somatic+cells+affects+reprogramming+efficiency.">Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency.</a> J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+passage+human+fibroblasts+induced+to+pluripotency+are+capable+of+directed+neuronal+differentiation.">Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation.</a> Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).</li><li>Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+genetic+variation+in+somatic+human+tissues.">Extensive genetic variation in somatic human tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).</li><li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells.">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li></ol>

The authors have no conflict of interest.

جيل من hiPSCs المريض محددة يقدم نهجا فريدا لدراسة المرضية في أنواع الخلايا المريضة في المختبر، ويوفر أيضا منصة لفحص المخدرات للتعرف على الجزيئات الجديدة التي يمكن انقاذ الظواهر المرض. هذا النهج النمذجة المرض باستخدام hiPSCs قد حقق نتائج واعدة لمجموعة متنوعة من الأمر...

اكتشاف الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) قد أحدثت ثورة في مجال الطب التجديدي، وتوفير وسيلة عملية لتوليد الخلايا الجذعية المريض محددة 1-3. وقد ولدت hiPSCs بنجاح من مختلف أنواع الخلايا الجسدية، بما في ذلك الخلايا الليفية 4،5، 6،7 الخلايا المكونة للدم والخلايا الظهارية الكلوية من البول (8) والخلايا الكيراتينية 9،10. حتى الآن، الخلايا الليفية الجلد والخلايا المكونة للدم تمثل مصادر الخلايا الأكثر استخداما لتوليد iPSCs المريض محددة. يمكن القول، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن خزعات الجلد وجمع الدم هي الإجراءات الطبية الروتينية والمصارف البيولوجية كبيرة من المرضى عينات الدم أو الجلد وأنشئت في كثير من البلدان هذه. وعلى النقيض من خلايا الدم والخلايا الليفية الجلدية التي تتطلب أساليب الاستخراج الغازية، الكيراتينية تمثل نوع من الخلايا يمكن الوصول إليه بسهولة لتوليد hiPSC. Keratinocytوفاق هي خلايا الكيراتين الغنية الظهارية التي تشكل حاجز البشرة الخارجية للجلد وتوجد أيضا في الأظافر والشعر 11. على وجه الخصوص، الكيراتينية ويمكن الاطلاع على غمد الجذر الخارجي (ORS) من بصيلات الشعر، وهي طبقة الخلايا الخارجية التي يغطيها جذع الشعرة مع غمد الجذر الداخلية (IRS) خلايا (12، الشكل 1). كما جمع الشعر هو إجراء بسيط لا يتطلب المساعدة من العاملين في المجال الطبي، فإنه يوفر فرصة للمرضى لجمع وإرسال عينات من الشعر الخاصة للمختبرات، والتي من شأنها أن تسهل إلى حد كبير جمع عينات من المرضى لتوليد hiPSC. يكون الكيراتينية البشرة أيضا أعلى كفاءة إعادة برمجة وحركية إعادة برمجة أسرع مقارنة مع الخلايا الليفية، إضافة إلى مزايا استخدام الخلايا الكيراتينية كما الخلايا تبدأ لتوليد hiPSC 9،13. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تتولد hiPSCs استخدام السكان الخلية الآخرين داخل بصيلات الشعر،بما في ذلك خلايا الجلد حليمة التي تقع في قاعدة 14،15 بصيلات الشعر. التقارير السابقة للجيل التوجيهية باستخدام الخلايا المشتقة من الشعر غالبا ما تستخدم أساليب برمجة فيروسات أو القائم على lentiviral 9،14،15. ومع ذلك، وهذه الأساليب الفيروسية إدخال التكامل الجيني غير مرغوب فيه من الجينات المحورة الخارجية خلال إعادة برمجة. في المقارنة، واستخدام ناقلات episomal يمثل ممكنا، طريقة إعادة برمجة غير الفيروسي لتوليد iPSCs خالية من التكامل 4. لقد سبق وضعت لذلك، طريقة بسيطة فعالة من حيث التكلفة وغير فيروسية لإعادة برمجة الخلايا الكيراتينية في hiPSCs باستخدام ناقلات episomal 13 بكفاءة. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لتوليد hiPSCs المستمدة من الخلايا الكيراتينية، بما في ذلك اشتقاق الخلايا الكيراتينية من التقطه الشعر، وتوسيع وصيانة الخلايا الكيراتينية وإعادة برمجة لاحقة لتوليد hiPSCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic Mix:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ng/ml Antimycotic amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942-20ml</td>
			<td>Antibiotic mix is made up in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR) medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% knockout serum replacement (KSR)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; MEM non-essential amino acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.5&#215; Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;bFGF (10 ng/ml, added fresh)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;EpiLife with 60&#160;&#181;M Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M-EPI-500-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Human keratinocyte growth supplement (HKGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE)&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5&#215; Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mM L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Matrix (ECM):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354234</td>
			<td>Aliquot Matrigel stock and store in -80&#176;C following manufacturer&#8217;s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200&#181;l matrigel for coating a 12-well plate (~150&#181;g/well).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Matrix Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R-011-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td rowspan="5">Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-eGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent Fugene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td>Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Serum medium: OPTI-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN2613R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Use at 10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
			<td>Use at 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-160 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4360</td>
			<td>Use at 5&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5279</td>
			<td>Use at 5&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td>Use at 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Detection kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of integration-free human induced pluripotent stem cells using hair-derived keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

الشعر يمر عبر 3 مراحل مختلفة من دورة النمو: طور التنامي (مرحلة النمو)، فترة التراجع (مرحلة الانحدار) وتساقط الشعر (مرحلة الراحة) 20،21. بصيلات الشعر الشعرالمتنامي يحتوي على طبقات متعددة من ظهارة. وتشمل هذه الطبقات على ORS، IRS ورمح الشعر (الشكل 1). طور التنامي ا...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes at JoVE.com

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

جيل من التكامل خالية الإنسان المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية عن طريق الشعر المستمدة من الخلايا الكيراتينية

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K Views.  University of Melbourne. This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors. 

Video: Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من المجمدة بافي معاطف استخدام غير دمج-Episomal البلازميدات

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الإنسان الطرفية T الخلايا باستخدام سينداي الفيروسات في ظروف خالية من الطاعم

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated induced-Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from various somatic cell types by transducing four Yamanaka transcription factors: Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. The study of iPSCs remains at the cutting edge of biological and clinical research. In particular, patient-specific iPSCs can be used as a pioneering tool for the study of disease pathobiology, since iPSCs can be induced from the tissue of any individual. Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease, classified by the destruction of cartilage and bone structure in the joint. Synovial hyperplasia is one of the major reasons or symptoms that lead to these results in RA. Fibroblast-like Synoviocytes (FLSs) are the main component cells in the hyperplastic synovium. FLSs in the joint limitlessly proliferate, eventually invading the adjacent cartilage and bone. Currently, the hyperplastic synovium can be removed only by a surgical procedure. The removed synovium is used for RA research as a material that reflects the inflammatory condition of the joint. As a major player in the pathogenesis of RA, FLSs can be used as a material to generate and investigate the iPSCs of RA patients. In this study, we used the FLSs of a RA patient to generate iPSCs. Using a lentiviral system, we discovered that FLSs can generate RA patient-specific iPSC. The iPSCs generated from FLSs can be further used as a tool to study the pathophysiology of RA in the future.

Here we describe a protocol for generating human induced-pluripotent stem cells from patient-derived fibroblast-like synoviocytes, using a lentiviral system without feeder cells.

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة-المحفزة عن طريق Synoviocytes الخلايا الليفية مثل المعزولة من المفاصل من التهاب المفاصل الروماتويدي المرضى

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

جيل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من سرطان الجلد البشري الخلايا اللمفاوية-التسلل الورم

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

الناجم المحفزة الجيل الخلايا الجذعية من خلايا الدم عن طريق سينداي الفيروسات والطرد المركزي

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

جيل من التكامل خالية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى عن طريق Episomal المتجهات

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

محددة وقابلة للتطوير الجيل من الخلايا تشبه الكبدية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

التكامل الانشطار الحرة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان المستحث باستخدام مصفوفة لامينين 521

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

استخدام الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة مثل تتمثل الخلايا لاكتشاف المخدرات

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...