The authors wish to thank Harene Ranjithakumaran and Stacey Jackson for technical support. This work was supported in part by grants from the National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. P&#233;bay), the University of Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. P&#233;bay) and the Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. P&#233;bay); Australian Research Council Future Fellowship (A. P&#233;bay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramural funding from the National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) and operational infrastructure support from the Victorian Government.

La collection de l&#39;échantillon de cheveux humains de personnes nécessite l&#39;approbation éthique par le comité d&#39;éthique de la recherche humaine dans les établissements d&#39;accueil et doit être fait en conformité avec les directives institutionnelles. 1. Isolement de kératinocytes à partir de pileux épilé <ol><li> Thaw matrice extracellulaire (ECM) (c.-à-Matrigel) sur la glace O / N. </li><li> En utilisant des pointes de pipette pré-réfrigérés, ajouter 200 solution ECM ul à 12 ml de milieu DMEM réfrigérés / F12. Manteau une plaque de 12 puits avec 1 ml de solution d&#39;ECM dilué dans chaque puits. Incuber la plaque O / N couché à 37 ° C. Laver la plaque revêtue avec / milieu F12 DMEM préchauffé avant utilisation. </li><li> Recueillir cheveu humain primaire à partir de la tête de l&#39;individu en plaçant les doigts à proximité de la racine des cheveux et plumer les cheveux dans un mouvement rapide et lisse. Vérifiez pour confirmer que chaque cheveux collectés contient un follicule pileux intacts et déterminer la phase de l&#39;ONU de cheveux de croissanceder un microscope à dissection (figure 1). <ol><li> Recueillir 5-10 poils anagène de chaque individu pour extraire les kératinocytes. Processus arraché les poils dès que possible pour assurer la dérivation réussie de kératinocytes. Remarque: La figure 1 illustre la morphologie des poils dans les différentes phases du cycle de croissance. Cheveux anagène se trouve dans la phase de croissance, avec une couche extérieure visible de l&#39;épithélium entourant la longueur des cheveux, connu sous le nom de SRO. D&#39;autre part, les cheveux télogène représente cheveux en phase de repos et ne pas avoir un ORS visibles, mais il a une boule claire de cellules couvrant la racine des cheveux, connu sous le renflement télogène. </li></ol></li><li> Placez les échantillons de cheveux dans une boîte de Pétri contenant 10 ml de mélange antibiotique se laver pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Avec des ciseaux et des pinces stérilisées, couper l&#39;arbre de cheveux excessive, laissant un fragment de cheveux avec un follicule pileux intacts et autour de 0,5 à 1 cm de tige du cheveu. </li><li> Tra attentivementnsfer fragment 1 de cheveux dans chaque puits de la plaque revêtue de l&#39;ECM en utilisant une pince. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une pipette de 1 ml, ajouter environ 3 gouttes de sérum Knockout remplacement (KSR) moyen (~ 100 - 200 pi) à des échantillons de cheveux. Remarque: Gardez les fragments de cheveux en contact étroit avec la surface de la plaque pour permettre l&#39;attachement et kératinocytes ultérieure excroissance. Ajout de médias excessive à cette étape peut provoque les fragments de cheveux flotter et diminue la chance de l&#39;attachement de cheveux réussie. </li><li> Incuber les échantillons de cheveux dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 et de permettre aux follicules pileux pour attacher O / N. Le jour suivant, ajouter doucement 3 gouttes d&#39;un autre moyen KSR (~ 100 - 200 pi) pour maintenir les échantillons de cheveux humide. </li><li> Respecter les échantillons de cheveux tous les jours pour confirmer que les follicules pileux ont attaché avec succès. Généralement attachement des follicules pileux est apparente dans les 1-3 jours. Poils épais sont généralement plus facile à fixer par rapport à poils fins, comme les poils fins ont élevétendance à flotter qui entravent le processus de fixation. <ol><li> Une fois que les cheveux ont fixé à la plaque revêtue, ajouter 500 ul de milieu KSR au puits. Redoublez de prudence lors de l&#39;ajout du milieu comme des échantillons de cheveux peuvent ne pas avoir attachée fermement. De ce point, changer de support tous les 2 jours. Remarque: excroissances kératinocytes doivent être visibles de la région ORS du fragment de cheveux après 3-7 jours (Figure 2A-B). Autoriser les kératinocytes de croître jusqu&#39;à 14 jours avant repiquage des cellules comme décrit dans la section suivante. </li></ol></li></ol> 2. Maintenance et repiquage des kératinocytes <ol><li> Pré-enduire une plaque de 6 puits en utilisant le kit de revêtement Matrix. Ajouter 680 ul de milieu de dilution de la trousse à chaque puits, suivis par 6,8 ul de solution de revêtement Matrix. Agiter la plaque pour assurer une distribution uniforme de la solution de matrice de revêtement sur la plaque. </li><li> Laisser la plaque revêtue à incuber pendant 30 min à température ambiante. Supprimerla solution de revêtement matrice avant le placage des kératinocytes. </li><li> Dissocier les kératinocytes dans une suspension cellulaire unique avec 500 pi de trypsine à 0,25% par puits pour 2-5 min à 37 ° C. Inactiver la trypsine avec 500 ul de milieu contenant du sérum (par exemple, sérum bovin fœtal (FBS) Moyen) et recueillir dans un tube de 15 ml stérile. Retirer le fragment de cheveux à l&#39;aide des pinces stérilisées. </li><li> Déterminer le nombre de cellules récoltées à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 3 minutes à 200 x g. Laver les cellules avec du PBS et centrifugation répétition. Aspirer le PBS et remettre le culot de cellules dans un milieu de kératinocytes frais. </li><li> Plate baisse de 4 × 10 4 kératinocytes dans un puits de la plaque d&#39;ECM-revêtue de la présence d&#39;un milieu de kératinocytes. Garder les kératinocytes dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 (figure 2C). Changer de support tous les cellules de jour et de passage lorsque la culture est ~ 80% de confluence, WHIch peut prendre environ 2-7 jours en fonction du nombre de passage et la prolifération des kératinocytes taux. Les kératinocytes dérivés devraient être élargis pour générer des stocks congelés suffisant en utilisant les méthodes de cryoconservation congélation lente standards 16. Remarque: Les conditions de culture décrites soutenir l&#39;expansion de la population homogène de kératinocytes avec la morphologie typique pavée (figure 2C). Parfois, quelques kératinocytes différenciés, avec une morphologie large et plat et ont perdu potentiel réplicatif, peuvent être observées dans la culture. Caractérisation des kératinocytes peut être effectuée par immunocoloration en utilisant des anticorps contre la cytokératine 14 17 comme décrit précédemment. Des lignées cellulaires de kératinocytes établis doivent également être testés pour mycoplasmes après 1-3 passages en utilisant le kit disponible dans le commerce. </li></ol> 3. Génération de hiPSCs de kératinocytes Utilisation épisomique Vecteurs <ol><li> Pré-enduire une plaque de 6 puits avec0,1% de gélatine (2 ml / puits). Autoriser la gélatine pour enrober pendant au moins 20 min à température ambiante. </li><li> Pour l&#39;expérience de reprogrammation, utilisation kératinocytes plus tard passage 6. Dissocier les kératinocytes dans une suspension cellulaire unique avec 1 ml de trypsine à 0,25% par puits pendant 2-5 min à 37 ° C. Inactiver la trypsine avec 1 ml de milieu contenant du sérum (par exemple, les médias FBS) et recueillir dans un tube de 15 ml. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 3 min à 200 cellules XG et remettre en suspension dans un milieu de kératinocytes. Planche 1 × 10 × 10 5 -1.5 5 kératinocytes par puits dans une plaque O / N gélatinisé. </li><li> Le jour suivant (jour 0), vérifier la plaque pour assurer cellules sont 50-60% de confluence. Remarque: Si les kératinocytes sont moins de ~ 50% de confluence ils pourraient ne pas bien grandir après la transfection. </li><li> Le jour 0, effectuer la transfection des vecteurs épisomiques de reprogrammation sur les kératinocytes, en utilisant un rapport de 8 pi de réactif de transfection à 2 pg d&#39;ADN de plasmide totale.<ol><li> Prenez 0,5 pg pour chacun des 4 plasmides (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) et diluer dans 100 pi de milieu de sérum réduit (par exemple, OPTI-MEM). Remarque: Le plasmide pCXLE-eGFP est utilisé pour surveiller l&#39;efficacité de transfection dans les kératinocytes et est pas nécessaire pour la reprogrammation de succès. </li><li> Ajouter 8 ul de réactif de transfection de l&#39;ADN dilué. Mélanger en tapotant le tube. Laisser le mélange réactionnel reposer à l&#39;ADN intact à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Remplacez le support des kératinocytes avec du milieu frais. </li><li> Ajouter doucement le mélange de réaction de l&#39;ADN à la culture des kératinocytes et incuber dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 4 heures. Remarque: Il est recommandé de ne pas effectuer la transfection prolongée O / N dans les kératinocytes comme ils présentent une faible survie post-transfection. </li><li> Après 4 heures post-transfection, remplacer le milieu des kératinocytes avec du milieu frais. </li></ol></li><li> Le Jour 1 (1 jour post-transfection), changer le milieu de kératinocytes et de vérifier l&#39;efficacité de transfection en estimant le pourcentage de cellules positives eGFP sous un microscope à fluorescence. Typiquement&gt; 60-70% d&#39;efficacité de transfection est observée pour les kératinocytes primaires en utilisant ce protocole. </li><li> Le jour 2, répéter transfection comme décrit dans l&#39;étape 3.5. Deux transfections consécutifs seraient typiquement atteindre&gt; 90% d&#39;efficacité de transfection. culture de kératinocytes atteint généralement confluence avant la fin de la seconde transfection. <ol><li> Préparer un plat de 10 cm de la souris fibroblastes embryonnaires (MEF) chargeur pour chaque réaction de reprogrammation. Préparer mangeoires MEF mitotiquement inactivés comme décrit précédemment 18. </li><li> Pré-couche d&#39;un plat de 10 cm avec 5 ml de 0,1% de gélatine pendant au moins 20 min. Planche 4 × 10 6 MEF mitotiquement inactivé par boîte de 10 cm dans un milieu FBS. Laisser les cellules se déposer et se fixent O / N dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Le Jour 3, haracquises les kératinocytes avec 0,25% de trypsine comme décrit dans l&#39;étape 3.2 et 3.3. Reprendre les kératinocytes dans un milieu KSR et de la plaque de 90% de kératinocytes à partir de 1 puits d&#39;une plaque à 6 puits dans un plat d&#39;alimentation MEF 10 cm avec un milieu KSR. </li><li> Partir du jour 4., changer le milieu KSR chaque jour. <ol><li> Alternativement après Jour 18, remplacer le milieu de culture tous les deux jours. Remarque: les kératinocytes non reprogrammé cesseront de proliférer, alors que les colonies hiPSC avec limite définie qui ressemblent à des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) apparaîtront à Jour 14 - 21 ans. </li></ol></li><li> Isoler colonies hiPSC par dissection manuelle de Jour 21 partir. Évitez les colonies hiPSC qui sont étroitement regroupés ensemble et ne ramassent colonies hiPSC qui sont clairement séparés des autres. Note: colonies de hiPSC peuvent être récupérés plus tôt, mais la colonie avec des frontières définies pourraient ne pas être évidente à des moments antérieurs étant donné la petite taille de la colonie. l&#39;efficacité de reprogrammation peuvent varier entre les différents kératinocytes du patient, et est aussi influencée par d&#39;autres facteurs tels que le nombre de passage ou le taux de kératinocytes de prolifération. <ol><li> Pour la dissection manuelle de colonies hiPSC, utiliser une aiguille de 26G à couper colonies hiPSC sous un microscope de dissection. Couper une colonie hiPSC en petits morceaux autour de 300 à 600 mm de longueur. Transférer les morceaux d&#39;une colonie hiPSC dans une nouvelle plaque d&#39;alimentation MEF (2,5 × 10 4 MEF / cm 2) pour établir une ligne clonale de hiPSCs. Initialement, la culture de chaque lignée clonale hiPSC dans un puits d&#39;une plaque de 12 plats ou de la culture d&#39;organes ainsi, puis développez à 6 format de plaque bien. </li><li> Maintenir lignées clonales de hiPSCs établies en milieu KSR sur mangeoires MEF. Une fois la culture atteindre 70 à 80% de confluence avec des colonies hiPSC ~ 1,5 mm de diamètre, hiPSCs de passage en utilisant des procédés enzymatiques standards de passages (Accutase, la dispase ou la collagénase IV) selon les instructions du fabricant. </li></ol></li><li> Caractériser ligne hiPSC établis pour confirmer la pluripotence et leur capacité à se différencier en cellules représentatives des trois feuillets embryonnaires in vitro et / ou in vivo 13,19. En outre, les lignes hiPSC analysent l&#39;régulièrement établis pour mycoplasmes en utilisant des kits disponibles dans le commerce pour assurer qu&#39;ils sont exempts de pathogènes. Surveiller régulièrement la stabilité du génome de lignes hiPSC par caryotype ou basée sur la baie nombre de copies variation (CNV) analyse. </li></ol>

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The authors have no conflict of interest.

Génération de hiPSCs spécifiques au patient offre une approche unique pour l&#39;étude de la pathogenèse dans les types de cellules malades in vitro, et fournit également une plate-forme pour le criblage de médicaments pour identifier de nouvelles molécules qui peuvent sauver les phénotypes de la maladie. Cette approche de modélisation de la maladie en utilisant hiPSCs a donné des résultats prometteurs pour une variété de maladies, y compris le syndrome du QT long, la maladie de Huntington, la mal...

La découverte de cellules souches pluripotentes humaines induites (de hiPSCs) a révolutionné le domaine de la médecine régénérative, fournissant une méthode possible pour la production de cellules souches spécifiques à des patients 1-3. hiPSCs ont été générés avec succès à partir de divers types de cellules somatiques, y compris des fibroblastes, des cellules hématopoïétiques de 4,5 à 6,7, les cellules epitheliales rénales à partir de l&#39;urine et des kératinocytes 8 9,10. À ce jour, les fibroblastes de la peau et des cellules hématopoïétiques représentent les sources de cellules les plus couramment utilisés pour générer des CSPi spécifiques au patient. Sans doute, cela est dû au fait que les biopsies de la peau et de la collecte de sang sont des procédures médicales de routine et de grandes biobanques d&#39;échantillons de sang ou de la peau des patients ont été établis dans de nombreux pays. Contrairement aux cellules sanguines et les fibroblastes de la peau qui exigent des méthodes d&#39;extraction envahissantes, les kératinocytes représentent un type cellulaire facilement accessible pour la génération hiPSC. Keratinocytes sont des cellules épithéliales de kératine riche qui forment la barrière épidermique extérieure de la peau et l&#39;on retrouve également dans les ongles et les cheveux 11. En particulier, les kératinocytes peuvent être trouvés sur la gaine externe de la racine (SRO) des follicules pileux, une couche externe cellulaire qui couvrait la tige du cheveu avec la gaine intérieure de racine (IRS) des cellules (12, figure 1). Comme la collecte de cheveux est une procédure simple qui ne nécessite pas l&#39;assistance du personnel médical, il fournit une occasion pour les patients de recueillir et d&#39;envoyer leurs propres échantillons de cheveux pour les laboratoires, ce qui faciliterait grandement la collecte des échantillons de patients pour la génération hiPSC. kératinocytes épidermiques ont également une efficacité de reprogrammation ultérieure et cinétique rapide de reprogrammation par rapport à des fibroblastes, en ajoutant aux avantages de l&#39;utilisation des kératinocytes comme cellules de départ pour la production hiPSC 9,13. En outre, hiPSCs peut également être générée à l&#39;aide d&#39;autres populations de cellules au sein du follicule pileux,y compris les cellules de papilles dermiques situés à la base de la 14,15 du follicule pileux. Les rapports précédents de génération iPSC utilisant des cellules de cheveux dérivé utilisent souvent des méthodes de reprogrammation rétroviraux ou à base de lentivirus 9,14,15. Cependant, ces procédés introduisent intégration génomique virale de transgènes étrangers indésirables lors de la reprogrammation. En comparaison, l&#39;utilisation de vecteurs épisomiques représente un procédé de reprogrammation est possible, non viral pour générer iPSCs libre rapprochement 4. Nous avons déjà mis au point une méthode simple, rentable et non virale pour reprogrammer efficacement kératinocytes en hiPSCs utilisant des vecteurs épisomiques 13. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la génération de hiPSCs de kératinocytes dérivés, y compris la dérivation de kératinocytes à partir de cheveux pincées, l&#39;expansion et le maintien des kératinocytes et la reprogrammation ultérieure de générer hiPSCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibiotic Mix:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ng/ml Antimycotic amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942-20ml</td>
			<td>Antibiotic mix is made up in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR) medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>KSR medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) before use. bFGF is added fresh to the media before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% knockout serum replacement (KSR)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; MEM non-essential amino acid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.5&#215; Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;0.1 mM &#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;bFGF (10 ng/ml, added fresh)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;EpiLife with 60&#160;&#181;M Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M-EPI-500-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215; Human keratinocyte growth supplement (HKGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) medium:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FBS medium is filtered using Stericup (Millipore, #SCGPU05RE)&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5&#215; Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mM L-glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Matrix (ECM):</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354234</td>
			<td>Aliquot Matrigel stock and store in -80&#176;C following manufacturer&#8217;s instructions. Stock concentration of Matrigel varies slightly from batch to batch (~9mg/ml). We recommend to use 200&#181;l matrigel for coating a 12-well plate (~150&#181;g/well).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating Matrix Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R-011-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids:&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td rowspan="5">Note that pCXLE-eGFP is only used for monitoring transfection efficiency and is not required for reprogramming.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-eGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27077</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hSK</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27078</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; pCXLE-hUL</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>27080</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent Fugene HD</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td>Make up 0.1% gelatin in distilled water. Autoclave before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced Serum medium: OPTI-MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6964-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MEF can be inactivated by mitomycin C treatment or irradiation as described previously 16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN2613R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish (tissue culture treated)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Use at 10mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
			<td>Use at 1mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRA-160 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB4360</td>
			<td>Use at 5&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5279</td>
			<td>Use at 5&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1997</td>
			<td>Use at 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Detection kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of integration-free human induced pluripotent stem cells using hair-derived keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

Les cheveux passe par trois phases différentes de cycle de croissance: anagène (phase de croissance), catagène (phase de régression) et télogène (phase de repos) 20,21. Le follicule pileux anagène contient de multiples couches de l&#39;épithélium; ces couches comprennent les SRO, IRS et l&#39;arbre des cheveux (Figure 1). Cheveux anagène finalement subit une transition à la phase catagène, qui est marquée par l&#39;apoptose des SRO et la cessation de la différenciation de l&#39;...

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Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Génération de l&#39;intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.4K vues.  University of Melbourne. This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors. 