This research was supported in part by a National Research Service Award (T32GM07616) from the National Institute of General Medical Sciences.

1. الإعداد التجريبي وإعداد نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال microtoroids باستخدام الطباعة الحجرية والحفر، وإجراء ذوبان كما هو موضح سابقا 6. افتعال microtoroids على رأس رقاقة السيليكون (رقاقة) التي عادة ما يكون قطرها كبير من 80-100 ميكرون، وقطرها صغير من 2 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرخاء ما يقرب من متر من الألياف البصرية أحادية النمط (125 ميكرون الكسوة، 4.3 ميكرون وضع قطر الميدان) من بكرة الألياف لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في منتصف الجزء المساس بها من الألياف البصرية، تجريد شريحة صغيرة (2.5 سم) من طلاء البوليمر حول الألياف الضوئية باستخدام تقشير الأسلاك. ملاحظة: هذا هو جزء من الألياف الضوئية التي سيتم استخدامها لevanescently ضوء زوجين في microtoroid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الألياف جردت مع الكحول الأيزوبروبانول والوبر مجانا القضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد هذا الجزء من الألياف في مكانها باستخدام حامل الألياف المصنوعة من المشابك المغناطيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقيقة الألياف جردت إلى ~ 500 نانومتر meltinز وسحب باستخدام شعلة الهيدروجين واثنين من المحركات السائر تتحرك في اتجاهين متعاكسين في 60 ميكرون / دقيقة. ضع الألياف البصرية داخل الجزء العلوي من اللهب، التي ينبغي أن تكون ~ 10 مم طويل القامة. وقف سحب الألياف عندما انتقال العدوى عن طريق الألياف يتوقف المتقلبة، والتي يمكن رصدها إما بصريا (من خلال مشاهدة الضوء الذي تنتشر أفقيا من وميض الألياف داخل وخارج) أو عن طريق توصيل الألياف إلى الثنائي الضوئي وهو يعلق على الذبذبات . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلتصق طرف واحد من الألياف الضوئية وأدخله محول الألياف العارية. ضع هذه الغاية من الألياف في مدخلات photoreceiver. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زوجين من الألياف الطرف الآخر من بكرة الألياف ليزر باستخدام مقرنة الألياف البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة microtoroid على رأس صاحب العينة (الفولاذ المقاوم للصدأ، 37.8 مم × 6.4 مم × 3.2 مم) باستخدام الايبوكسي أو الشريط مزدوجة من جانب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل صاحب العينة على رأس مرحلة تحديد المواقع التي تضم من 3 محاور النانو لتحديد المواقع (نanocube) مرحلة (انظر قائمة المعدات) على رأس ميكرومتر 3 محاور. أداء جميع التجارب على طاولة البصرية معزولة بالهواء المضغوط لتقليل الاهتزازات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف خشن رقاقة عينة باستخدام ميكرومتر 3 محاور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة رقاقة بالتوازي التي تحتوي على microtoroid إلى الألياف الضوئية باستخدام النانو مناور. ملاحظة: محاذاة microtoroid على مسافة من طول موجي واحد من الضوء المدخلات (~ 633 نانومتر). لرؤية هذه العملية استخدام عمودين التصوير (أنبوب مع عدسة موضوعية وكاميرا، انظر قائمة المعدات) وضعه على رأس وعلى جانب من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين استقطاب ضوء الليزر الموجهة من خلال الألياف البصرية باستخدام وحدة تحكم الاستقطاب في خط (انظر قائمة المعدات) مع مقبض لضبط الاستقطاب. ملاحظة: يتم تحقيق الاستقطاب الأمثل عندما يظهر تراجع ملموس في انتقال الألياف البصرية أضيق. ملاحظة هذا الانخفاض على الذبذبات (راجع الخطوة 2.2 لمزيد من التفاصيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناءغرفة العينة epoxying ساترة الزجاج على مرحلة العينة باستخدام شريحة المجهر والزجاج كفاصل. ملاحظة: A الضميمة زجاجي يغطي كامل الإعداد قد تكون مفيدة للتقليل من التيارات الهوائية. يجب أن تترك فتحة صغيرة للسماح الحل ليتم ضخها في استخدام الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن حراريا تعليق الجسيمات أو المحاليل المائية جزيء واحد ل≥ 1 ساعة في حمام مائي RT (~ 500 مل). ملاحظة: يتم تخفيفه عينات إلى التركيز المطلوب في أنابيب microcentrifuge باستخدام مخازن المرتبطة المحددة من الشركة المصنعة، على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني أو HEPES. إذا تم الكشف عن أية أحداث ملزمة، وزيادة تركيز الملح المخزن المؤقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الجسيمات تحتوي على حلول (1 مل) لفترة وجيزة ل~ 2 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الجسيمات تحتوي على حلول في حجرة العينة في 1 مل / دقيقة باستخدام 1 مل ضخ حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن شغل حجرة العينة، إيقاف ضخ حقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 30 ثانية قبل تسجيل البيانات للحد منآثار الاهتزازات الميكانيكية الناجمة عن تدفق السوائل التي يمكن أن تؤثر على القياس. </li></ol> 2. تردد قفل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الزوجين حلقي إلى الألياف البصرية عن طريق تحريك صاحب العينة مع nanopositioner، لأنه سيتم بالانزعاج اقتران نظرا لحقن السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الطول الموجي صدى من microtoroid عن طريق مسح الكمبيوتر التي تسيطر عليها إدخال الليزر من خلال مجموعة متنوعة من الأطوال الموجية. تنفيذ هذه الخطوة عن طريق إرسال إشارة الثلاثي الموجي الجهد لعنصر كهرضغطية داخل وحدة تحكم الليزر الذي ينظم الطول الموجي لليزر. إجراء تجارب باستخدام الضوء المرئي (635 نانومتر ± 2.5 نانومتر) كما أن هناك انخفاض امتصاص الضوء في الماء عند هذا الطول الموجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس انتقال الضوء من خلال الألياف البصرية عن طريق توصيل إخراج الألياف البصرية إلى photoreceiver السيارات متوازنة. سد العجز الناتج من photoreceiver إلى الذبذبات باستخدام كابل BNC. مراقبة سن الذبذبات أنه في الطول الموجي صدى من microtoroid، انتقال العدوى عن طريق الألياف البصرية قطرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق إخراج photoreceiver إلى المدخل الرئيسي للتردد قفل تحكم ردود الفعل (انظر قائمة المعدات) عن طريق كابل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل التردد قفل تحكم ردود الفعل في وضع القفل الآلي باستخدام أعلى من الذروة قفل مع تردد ارتجف من 2 كيلو هرتز واتساع موجة التذبذب من 19 وزير الخارجية. ضبط تجريبيا الإعدادات يتناسب-يتجزأ المشتقة في إطار البرنامج باستخدام زيغلر-نيكولز ضبط القواعد 14. ملاحظة: هذه القيم تحتاج إلا أن تكون مجموعة مرة واحدة في بداية كل التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصناعة السيارات في قفل الطول الموجي لليزر لطول الموجة صدى من microtoroid. تنفيذ هذه الخطوة بعد ملء حجرة العينة. ملاحظة: إذا كان التحول الطول الموجي هو كبير جدا، ثم وحدة تحكم ردود الفعل سوف تفقد القفل وستتحول تلقائيا إلى وضع المسح الضوئي من أجل تحديد موقع صدى الطول الموجي. هذا OCالأوغاد لطول موجة التحولات أكبر من ما يقرب من linewidth (لا يقل عن 600 وزير الخارجية لجميع أنظمة التحقيق هنا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل الإخراج من وحدة تحكم ردود الفعل في 20 كيلو هرتز باستخدام 24 بت بطاقة الحصول على البيانات. تصدير البيانات كملف نصي عبر برنامج الحصول على البيانات. </li></ol> 3. تجهيز وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل فورييه البيانات في MATLAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المنخفضة تمرير البيانات باستخدام &quot;الطوب الجدار&quot; مرشح مع قطع في 1 كيلو هرتز لإزالة التردد ارتجف المفروضة من 2 كيلو هرتز (انظر الرمز التكميلي ملف شاشة 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشق حسابيا تصفية البيانات باستخدام حجم نافذة 16 هرتز. ملاحظة: يتم ذلك لإزالة المصادر المعروفة للضجيج، في هذه الحالة، 60 هرتز الضوضاء خط الالكترونية والتوافقيات، وكذلك 100 هرتز (قادمة من سائق ليزر) والتوافقيات (انظر الرمز التكميلي ملف شاشة 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فورييه العكسي تحويل البيانات مرة أخرى إلى المجال الزمني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرشح متوسط ​​البيانات باستخدام نافذةحجم 1001 عينات (انظر الرمز التكميلي ملف لقطة 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد التغييرات خطوة في الطول الموجي صدى باستخدام خوارزمية تقصي خطوة من Kerssemakers وآخرون. 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد رسوم بيانية للسعة كل خطوة ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب حجم الجسيمات باستخدام المعادلة. (1) (انظر مناقشة). </li></ol>

<ol>
	<li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities.">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li><li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators.">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li><li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single molecule biology. , (2009).</li><li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology.">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whispering-gallery-mode+biosensing:+label-free+detection+down+to+single+molecules.">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li><li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip.">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li><li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+microcavities.">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li><li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption.">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li><li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode.">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li><li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers.">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li><li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity.">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li><li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform.">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li><li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators.">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li><li>&#197;str&#246;m, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Feedback systems : an introduction for scientists and engineers. , (2008).</li><li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution.">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li><li>Su, T. -. T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

كما يربط جسيم، والطول الموجي صدى (λ) للزيادات حلقي. إذا unbinds جسيم، والطول الموجي صدى النقصان تبعا ل(أ الحدث خطوة لأسفل). يمكن تحديد قطرها الجسيمات (د) عن طريق رسوم بيانية للسعة كل خطوة الطول الموجي. يختلف ارتفاع كل خطوة الطول الموجي نظرا لاختلاف حجم الجسيمات مل...

واحدة من التجارب الكشف عن جزيء مفيدة لتقليل كمية الحليلة المستخدمة في أجهزة الاستشعار، للكشف المبكر عن المرض، ودراسة الخصائص الأساسية للجزيئات 3. وعادة ما يتم إجراء مثل هذه التجارب باستخدام تسميات، ولكن التسميات ليست دائما ممكنة للحصول على بروتين معين، وزيادة التكاليف، ويمكن التشويش على الأحداث التي تجري دراستها، ويمكن أن تكون مزعجة، خاصة في الوقت الحقيقي في الموقع تجارب أو نقطة من- التشخيص الرعاية. المعيار الذهبي الحالي لتسمية خالية biosensing هو سطح مأكل بالرنين 4، ولكن النظم التجارية مأكل سطح الرنين وعادة ما يكون الحد الأدنى نموذجي للكشف على ترتيب نانومتر. في الآونة الأخيرة، ظهرت المرنانات البصرية وتكنولوجيا واعدة لتسمية خالية جزيء واحد biodetection 5. العمل مرنانات بصري على أساس طويل الأجل (م) الحبس الضوء 6،7. الضوء هو evanescentlyبالإضافة إلى هذه الأجهزة عادة عن طريق الألياف البصرية. عندما الطول الموجي للضوء يمر الألياف يطابق الطول الموجي صدى مرنان، وعلى ضوء كفاءة الأزواج إلى مرنان. على ضوء هذا بالإضافة يعكس داخليا تماما داخل تجويف مرنان لتوليد حقل زائل في المنطقة المجاورة للمحيط مرنان. كما جزيئات تدخل مجال زائل وربط للمرنان، والطول الموجي صدى التغييرات مرنان بما يتناسب مع حجم الجسيمات 8. من حيث القدرة على الكشف، وقد استخدمت في وقت سابق المرنانات microsphere للكشف عن أنفلونزا A احد جزيئات الفيروس (100 نانومتر) 9،10. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت المرنانات البصرية المحسنة plasmonically-microsphere للكشف عن المصل البقري واحد الألبومين جزيئات 11 و [أليغنوكليوتيد 8 مير 12، ولكن هذا النهج يحد من مجال التقاط الجسيمات إلى 0.3 ميكرون 2 في دينائب. أكبر أجهزة الاستشعار التقاط منطقة مثالية لتحقيق أقصى قدر من فرصة للكشف عن الجسيمات. تم التكنولوجيات القائمة على حل الحالية خالية من التسمية biosensing مع (&gt; 100 ميكرون 2) المناطق القبض كبيرة تقتصر على الكشف عن جزيئات البوليستيرين ≥ 25 نانومتر. قمنا بتطوير نظام biosensing خالية من التسمية على أساس تكنولوجيا مرنان البصرية المعروفة باسم التردد قفل البصرية يهمس زائل الرنان (زهرة) 13 (الشكل 1) التي هي قادرة على الكشف عن وقت حل للجزيئات واحدة في الحل. يستخدم FLOWER عمر الفوتون طويل من المرنانات البصرية microtoroid جنبا إلى جنب مع تردد تأمين مراقبة ردود الفعل، والكشف عن متوازن، والتصفية الحسابية للكشف عن جزيئات صغيرة وصولا الى جزيئات البروتين واحدة. استخدام قفل تردد يسمح للنظام لتتبع دائما صدى التحول من microtoroid كما ربط جزيئات، من دون الحاجة إلى كنس أو مسح الليزر الطول الموجي أكثرنطاقات واسعة. مبادئ FLOWER يمكن أن تستخدم لتعزيز قدرات الكشف عن تقنيات أخرى بما في ذلك تعزيز plasmonic. في ما يلي، ووصف الإجراءات لأداء FLOWER.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="396">
	<tbody>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Tunable diode laser</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">TLB-6300</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Laser controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">TLB-6300-LN</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Frequency locking feedback controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Toptica Photonics</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Digilock 110</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Auto-balanced photoreceiver</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Model 2007</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">In-line polarization controller</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">General Photonics</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">PLC-003-S-90</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">24-bit data acquisition card</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">National Instruments</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">NI-PCI-4461</td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl63" height="60" style="height:45.0pt;width:99pt" width="132">Recombinant human interleukin-2</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Pierce Biotechnology</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">R201520</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">20 nm polystyrene beads</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">3020A</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">NanoCube XYZ Piezo Stage</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Physik Instrumente</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">P-611.3</td>
		</tr>
		<tr height="20" style="height:15.0pt">
			<td class="xl63" height="20" style="height:15.0pt;width:99pt" width="132">Optical table</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Newport</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">VH3660W-OPT</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Objective lens for imaging column</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Navitar Machine Vision</td>
			<td class="xl64">1-60228</td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl63" height="40" style="height:30.0pt;width:99pt" width="132">Imaging column (adaptor tube)</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Navitar Machine Vision</td>
			<td class="xl65">1-60228</td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl63" height="60" style="height:45.0pt;width:99pt" width="132">High-Res CCD camera for imaging column</td>
			<td class="xl63" style="width:99pt" width="132">Edmund Industrial Optics</td>
			<td class="xl64">NT39244</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators

الكشف عن تركيزات صغيرة من الجزيئات وصولا الى حد جزيء واحد له تأثير على مجالات مثل الكشف المبكر عن المرض، والدراسات الأساسية على سلوك الجزيئات. تقنيات الكشف عن جزيء واحد تستخدم عادة تسميات مثل العلامات الفلورية أو النقاط الكمومية، ومع ذلك، والعلامات غير متوفرة دائما، وزيادة التكلفة والتعقيد، ويمكن التشويش على الأحداث التي تجري دراستها. ظهرت المرنانات البصرية كوسيلة واعدة للكشف عن جزيئات واحدة دون استخدام التسميات. حاليا أصغر الجسيمات الكشف عنها بواسطة المحسن plasmonically وعدم العارية نظام مرنان البصرية في حل هو 25 نانومتر البوليسترين المجال 1. قمنا بتطوير تقنية تعرف باسم التردد قفل البصرية يهمس زائل الرنان (زهرة) التي يمكن تجاوز هذا الحد وتحقيق الكشف عن جزيء واحد خالية من التسمية في محلول مائي 2. كما موازين قوة الإشارة مع حجم الجسيمات، يمثل عملنا ل&gt; 100X تحسينهالإقليم الشمالي في إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) على الدولة الراهنة للفن. هنا يتم عرض الإجراءات وراء FLOWER في محاولة لزيادة استخدامه في هذا المجال.

الجسيمات الأحداث ملزم يتم رؤيتها بوضوح عن التغيرات خطوة تشبه في الطول الموجي صدى من microtoroid على مر الزمن (الشكل 2A). وتظهر مرتفعات الخطوات كما رسم بياني في الشكل 2B. أرقام 2-4 تظهر آثار تمثيلية من الربط من exosomes (nanovesicles)، وحبات السيليكا 5 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators at JoVE.com

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.1K Views.  California Institute of Technology. We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented. 

Video: Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

أ ف التوحد لجنة المساواة العرقية ، السلمون المدخن النهج للكشف عن خلية الانصهار في فيفو</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

كشف البصري<em&gt; E. القولونية</em&gt; البكتيريا عن طريق أجهزة الاستشعار السيليكون Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

وبيوشيب الكهروكيميائية استنادا ميكروفلويديك لتسمية خالية تحليل الحمض النووي التهجين

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...