نشكر الدكتور كليمنس تتكرم Wendtner لتوفير tmuCD40 - يجند الحله خط الخلية.

ينقسم بروتوكول لجيل من الفئران خلايا B - CD40 تنشيط (mCD40B) من splenocytes إلى جزأين : الجزء ألف يوضح إعداد يجند CD40 الفئران (CD40L) معربا عن خلايا هيلا (tmuCD40L هيلا) ، والتي سوف تستخدم لوحة ، كما منضم الخلايا المغذية. الجزء باء يصف الفعلية الفئران CD40 - B الثقافة. A. إعداد الخلايا المغذية (tmuCD40L هيلا) وهيلا tmuCD40L هو ملتصق الإنسان خط الخلايا الظهارية ، والتي لا ينبغي أبدا أن تصبح متكدسة تماما. وبالتالي فإن الخلايا splitted مرتين في الأسبوع. لا ينصح زراعة على مدى أكثر من 6 أسابيع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة القديمة من ثقافة الأولية مع ماصة معقمة وغسل الخلايا مع 10 مل من 1X PBS. نضح في برنامج تلفزيوني بعد الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مل من التربسين 1X / EDTA في قارورة 75 2 سم لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. استخدام التنصت لطيف لفصل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من النوع المتوسط ​​البرية ودوار لوقف بلطف مع الهضم التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق الخلية في أنبوب 50 مل مع ماصة معقمة وتدور الخلايا في أسفل 265 x ج لمدة 7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وطاف resuspend الكرية خلية في المتوسط ​​10 مل من نوع البرية. حساب عدد الخلايا من قسامة لتعليق الخلية وإعداد ثلاث أنابيب 50 مل مع عدد مناسب من الخلايا : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 × 10 6 خلايا لثقافة فرعية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.4 × 10 6 خلية / جيد لاستخدام أشعة لثقافة الفئران خلايا CD40 - B </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبقى لتجميد (عند الحاجة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا في أسفل 265 x ج لمدة 7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لsubculturing : resuspend 2.5 × 10 6 خلايا في المتوسط ​​10 مل التحديد في 75 سم 2 خلية قارورة الثقافة (2.5 × كثافة الخلية 10 5 خلية / مل) ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. انقسام الخلايا مرتين في الأسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للثقافة الفئران الخلايا CD40 - B : تحتاج 2.4 × 10 6 خلايا لوحة 6 - جيدا واحدة. Resuspend في tmuCD40L خلايا هيلا في المتوسط ​​النوع البري في مناطق ذات كثافة تبلغ 0.2 X 6 10 الخلايا / مل ، وأشرق لهم في 78 غراي. لوحة 2 مل من تعليق خلية في كل بئر واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. استخدام هذه اللوحات المعدة لتنشيط خلايا B عندما tmuCD40L خلايا هيلا هي ملتصقة (على الأقل 4 ساعات : التحقق من الالتزام باستخدام المجهر ، لا تنتظر أكثر من 24 ساعة لبدء الخلية B - التحفيز). (متابعة باء) </li></ol></li></ol> باء الفئران CD40 - B خلية ثقافة أولا إعداد splenocytes لتحفيز - CD40 (يوم 0) : يرجى ملاحظة : قبل متابعة التأكد من أن الخلايا المغذية هي ملتصقة. دائما إضافة حلول جديدة من الفئران على الفور انترلوكين 4 ، β المركابتويثانول والسيكلوسبورين ألف للمتوسط ​​النمو قبل الاستخدام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الطحال لتستكمل C57BL / 6 الفئران (النمط الفرداني H - 2B) وغسله مرتين في DMEM 10-20 مل مع الجنتاميسين [15μg/mL] من قبل نقله مع طرف ماصة 10ML من أنبوب واحد إلى آخر. تجنب نقل الملوثات (مثل الشعر) من الفأرة. فرم الطحال بتمريرها من خلال مصفاة الخلية (100μm) وشطف مصفاة أخرى مع 10 مل من المتوسط. تدور في أسفل splenocytes 265 x ج لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ولهم في resuspend 7mL muCD40 - B المتوسطة الخلية ، والخلايا الليمفاوية منفصلة بواسطة الطرد المركزي Ficoll الكثافة. للقيام بذلك طبقة الخلايا في 5 مل الماوس Pancoll (مسخن في درجة حرارة الغرفة) في أنبوب مل 15 و 450 جهاز طرد مركزي في XG لمدة 30 دقيقة بدون فرامل في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم قبالة معظم الطبقة العليا ، وترك طبقة دون عائق لمفاوية في الواجهة. نقل طبقة الخلايا اللمفاوية لأنبوب جديد 50 مل ، ويغسل مرة واحدة مع DMEM 30mL مع الجنتاميسين [15μg/mL] من الغزل إلى أسفل في 265 x ج لمدة 7 دقائق لإزالة الخلايا الأخرى. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 10 مل من mCD40 - B المتوسطة الغسيل. تحديد عدد الخلايا في قسامة لتعليق الخلية. تحديد عدد الخلايا التي قسامة دون حساب لتعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار على المبلغ المطلوب من الخلايا في 265 x ج لمدة 7 دقائق. لوحة 6 - جيدا 5 × 10 6 خلية / كذلك هناك حاجة ، وبالتالي 30 × 10 6 خلية لكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف وإزالة الخلايا الليمفاوية في resuspend 1.25 × 6 10 خلايا / مل في mCD40 - B مستنبت استكملت حديثا مع 1 يو / مل من 4 انترلوكين مثل عامل النمو ، و 100 ميكرومتر β - المركابتويثانول و 0.63 ميكروغرام / مل السيكلوسبورين A لمنع ثمرة من خلايا تي (تركيزات نظرا تشير إلى واحد مل مستنبت!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف من لوحة 6 - جيدا قبل المحتضنة مع خلايا هيلا tmuCD40L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 4 مل من تعليق لمفاوية (1.25 × 10 6 خلية / مل) على كل جانب من لوحة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 reculture الخلايا (متابعة II.1). </li></ol> II. ثقافة فرعية من الخلايا mCD40B (يوم 3 ثم مرتين في الأسبوع) : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا العنقودية التي mCD40B pipetting بقوة صعودا ونزولا مع ماصة 10 مل وتجمع لهم في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في اسفل 265 x ج لمدة 7 دقائق واستبدالها تماما طاف مع mCD40 - B المتوسطة الغسيل. في حين عد كمية من الخلايا قسامة ، وتدور الخلايا في أسفل 265 x ج لمدة 7 دقائق. Resuspend الخلايا mCD40B في mCD40 - B مستنبت بتركيز 0.75 X الخلايا 6 10 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حلول جديدة من الفئران انترلوكين 4 في تركيز 1 U / مل و 100 ميكرومتر المركابتويثانول - β و 0.63 ميكروغرام / مل السيكلوسبورين ألف للمتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف من لوحة 6 - جيدا قبل المحتضنة مع خلايا هيلا tmuCD40L المشع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 4 مل من تعليق خلية mCD40B (0.75 × 10 6 خلية / مل) على كل جانب من لوحة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى فرعية الخلايا كل 3-4 أيام في نهاية المطاف مع نقية للغاية الفئران خلايا B - CD40 تفعيلها بعد ما مجموعه 14 يوما. </li></ol> جيم حل المشاكل : ماذا لو CD40 - B الخلايا لا تنمو؟ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هل راجعت للتعبير يجند CD40 الخلايا المغذية؟ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي الخلايا المغذية لوحة محددة تستخدم لتحفيز كبار السن من 24H؟ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هل هناك تلوث مع الميكوبلازما؟ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كان الحل انترلوكين - 4 المستخدمة لإذابة مكملات طازجة وأنه لم يكون النشاط المناسب البيولوجي؟ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكان β - المركابتويثانول السيكلوسبورين وإضافة في التركيز الصحيح؟ </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="الشكل 1 (أ)" /> الشكل 1A. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="الشكل 1 ب" /> الشكل 1B. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="الشكل 1 د" /> الرقم 1D. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2.

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells.">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li><li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+CD40-activated+B+cells.">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li><li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+Ligand-activated,+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides.">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. S. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li></ol>

وأجريت التجارب وفقا لمبادئ توجيهية وطنية وأوروبية لحفظ الحيوانات المختبرية. وكانت تسيطر عليها إحالة قانون الرفق بالحيوان الالمانية الحيوانات بشكل منتظم من قبل السلطات المختصة.

إدخال تعديلات على هذا البروتوكول أمر ممكن ، وخصوصا فيما يتعلق أصل التحفيز CD40 ونوع السلالة الماوس المستخدمة ، مما أسفر أيضا في توليد خلايا الفئران كفاءة B - CD40 تفعيلها. الأحمدي وآخرون. وقد أظهرت نتائج مماثلة بالنسبة لالليفية الماوس transfected مع الفئران CD40 - يجند. ويمكن في ه...

A. إعداد وسائل الإعلام : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> التغذية المتوسطة الخلية نوع البرية </td><td> اختيار الخلية المتوسطة المغذية </td><td></td></tr><tr><td> الكاشف </td><td> تركيز </td><td> الكاشف </td><td> تركيز </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> 300 ميكروغرام / مل </td><td> L - الجلوتامين </td><td> 300 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10 ٪ </td><td> FBS </td><td> 10 ٪ </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 ملي </td><td> HEPES </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td> الجنتاميسين </td><td> 15 ميكروغرام / مل </td><td> الجنتاميسين </td><td> 15 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td></td><td></td><td> هيغروميسين B </td><td> 0.2 ملغ / مل </td></tr></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> mCD40 B غسل المتوسطة </td><td> mCD40 B - مستنبت </td></tr><tr><td> الكاشف </td><td> تركيز </td><td> الكاشف </td><td> تركيز </td></tr><tr></tr><tr><td> D - MEM </td><td> </td><td> D - MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> 580 ميكروغرام / مل </td><td> L - الجلوتامين </td><td> 580 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> 4.5 ملغ / مل </td><td> جلوكوز </td><td> 4.5 ملغ / مل </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 ملي </td><td> HEPES </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td> الجنتاميسين </td><td> 15 ميكروغرام / مل </td><td> الجنتاميسين </td><td> 15 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0.1mM (1X) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10 ٪ </td></tr></tbody></table> B. متنوعة الكواشف : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> الكاشف </td><td> شركة </td><td> لكي لا </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D - MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10X) </td><td> PAA </td><td> القط لا H15 - 011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> حدد الدلتا </td><td> الفن لا يوجد 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> القط لا DE14 - 802C </td></tr><tr><td> HEPES العازلة </td><td> PAA </td><td> القط لا S11 - 001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> هيغروميسين B </td><td> PAA </td><td> القط لا P02 - 015 </td></tr><tr><td> المؤتلف الفئران إينترليوكين - 4 </td><td> Immunotools </td><td> القط لا 12340045 </td></tr><tr><td> السيكلوسبورين A </td><td> شركة نوفارتيس </td><td> القط لا 0078-0109-01 NDC </td></tr><tr><td> التربسين / EDTA (10X) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> جيم لوازم متنوعة : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الكاشف </td><td> شركة </td><td> لكي لا </td></tr><tr><td> ماصة معقمة نصائح </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 كذلك لوحة </td><td> نونك </td><td> القط لا 140675 </td></tr><tr><td> 50mL أنبوب مخروطي </td><td> دينار بحريني فالكون ™ </td><td> القط لا 352070 </td></tr><tr><td> نسيج الثقافة القارورة </td><td> Sarstedt </td><td> القط لا 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

murine model of cd40-activation of b cells

وقد أظهرت البحوث على الخلايا البائية أن التنشيط CD40 يحسن قدرتها على تقديم المستضد. عندما حفز مع وانترلوكين 4 - CD40 يجند (CD40L) ، يمكن توسيع خلايا B الإنسان دون صعوبات من كميات صغيرة من الدم المحيطي في غضون 14 يوما لكميات كبيرة جدا من خلايا CD40 - B نقية عالية (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; خلايا لكل مريض) من المتبرعين الأصحاء فضلا عن مرضى السرطان<sup&gt; 1-4</sup&gt;. CD40 - B المهم التعبير عن جزيئات الخلايا اللمفاوية صاروخ موجه ، ويمكن أن تجذب الخلايا التائية<em&gt; في المختبر</em<sup&gt; 5</sup&gt;. وعلاوة على ذلك أنها تأخذ بكفاءة أعلى ، والعملية الحالية لمستضدات الخلايا التائية<sup&gt; 6،7</sup&gt;. عرضت CD40 - B الخلايا ليست فقط ساذجة الوزراء ، وإنما أيضا توسيع الخلايا التائية الذاكرة<sup&gt; 8،9</sup&gt;. ولذلك قد درست CD40 تنشيط خلايا B (CD40 - B الخلايا) كمصدر بديل للالمناعية تنشيطية مستضد تقديم الخلايا (APC) لخلية مقرها immunotherapy1 ، 5،10. من أجل مزيد من الدراسة ما إذا كانت الخلايا CD40 - B تحفز الاستجابات فعالية الخلايا التائية في الجسم الحي ، ودراسة الآلية الكامنة أنشأنا نظاما ثقافة الخلية لتوليد خلايا الفئران B - CD40 تفعيلها. كانوا يستخدمون splenocytes أو تنقيتها من خلايا الفئران C57BL B / 6 ، لتفعيل CD40 ، حددت الظروف المثلى على النحو التالي : يتم تنقيتها ابتداء من splenocytes من C57BL / 6 الفئران (النمط الفرداني H - 2B) الخلايا الليمفاوية بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة وشارك في تربيتها مع هيلا خلايا الفئران معربا عن المؤتلف CD40 يجند (tmuCD40L هيلا)<sup&gt; 11</sup&gt;. هي خلايا recultured كل 3-4 أيام والمكونات الرئيسية مثل CD40L ، انترلوكين 4 - المركابتويثانول ويتم تجديد السيكلوسبورين A. في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية الحصول على تفعيلها بشكل كامل الفئران CD40 - B الخلايا (mCD40B) مع APC - مماثل النمط الظاهري لخلايا CD40 - B الإنسان (الشكل 1A ، ب). CD40 - يؤدي إلى تحفيز نمو السريع والتوسع في نقية للغاية (&gt; 90 ٪) CD19 خلايا B + في غضون 14 يوما من زراعة الخلايا (الشكل 1C ، د). لتجنب التلوث مع المنظمات غير transfected الخلايا ، والتعبير ليجند CD40 الفئران على transfectants يجب أن يكون للرقابة بشكل منتظم (الشكل 2). ويمكن استخدام الفئران CD40 تنشيط خلايا B لدراسة الخلية B - التنشيط والتمايز ، وكذلك للتحقيق إمكاناتها لتؤدي وظيفة APC في المختبر والمجراة. وعلاوة على ذلك ، لأنها تمثل أداة واعدة لإقامة التطعيم علاجية أو وقائية ضد الأورام وسوف تساعد على الإجابة عن الأسئلة المتعلقة بالسلامة واستمناع هذا النهج<sup&gt; 12</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model of CD40-activation of B cells at JoVE.com

Murine Model of CD40-activation of B cells

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح اجراءات التنشيط CD40 ، والتوسع في خلايا الفئران B من splenocytes من C57BL / 6 الفئران ، والتي يمكن استخدامها بوصفها خلية مستضد تقديم نموذج (APC) لدراسة تحريض الحصانة.

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.5K Views.  University Hospital of Cologne. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح اجراءات التنشيط CD40 ، والتوسع في خلايا الفئران B من splenocytes من C57BL / 6 الفئران ، والتي يمكن استخدامها بوصفها خلية مستضد تقديم نموذج (APC) لدراسة تحريض الحصانة.

Video: Murine Model of CD40-activation of B cells

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

الاستقراء والتقييم من فئة التوحد التبديل في تنقية خلايا الفئران B

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

المؤتلف إنتاج فيروسات الرجعية والعدوى من خلايا B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

الفئران نموذج من الربو المستحثة مسببات الحساسية

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

كشف صحيح فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن ماوس B خلايا سلالته

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

نموذج الفئران من المجموعة الثانية<em&gt; العقدية</em&gt; المهبلية الاستعمار

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

تحليل القص الناجمة عن تدفق الهجرة من المنطقة الهامشية الفاري ب الخلايا في المختبر

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or mucosa and ensure humoral immunity. Due to their low frequency and location, the study of PCs is difficult in human. We reported a B to PC in vitro differentiation model using selected combinations of cytokines and activation molecules that allow to reproduce the sequential cell differentiation occurring in vivo. In this in vitro model, memory B cells (MBCs) will differentiate into pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), early PCs and finally, into long-lived PCs, with a phenotype close to their counterparts in healthy individuals.&#160;We also built an open access bioinformatics tools to analyze the most prominent information from GEP data related to PC differentiation. These resources can be used to study human B to PC differentiation and in the current study, we investigated the gene expression regulation of epigenetic factors during human B to PC differentiation.

Using multi-step culture systems, we report an in vitro B cell to plasma cell differentiation model.

في المختبر التمايز نموذج الذاكرة البشرية العادية ب الخلايا إلى خلايا البلازما المعمرة

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

عزل الخلايا أحادية اللامينا بروبريا أحادية النونافة من القولون المورين باستخدام Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...