אנו מודים לבני זוג. מרקוס מנז ואירווינג וייסמן למתן חומרים כימיים. אנחנו גם מכירים את השירות הניתן על ידי Cytometric ניתוח הזרימה ותא מתקן המיון Core הראשון והמעבדה הליבה השנייה בלאומית טייוואן אוניברסיטת קולג &#39;של בית חולים לרפואה וNTU, בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (רוב 102-2,320-B-002-030-MY3) ומכוני מחקר הבריאות הלאומי, טייוואן (NHRI-EX102-10256SI וNHRI-EX103-10256SI).

/ 6 עכברי wild-type C57BL נרכשו מהמרכז הלאומי בעלי החיים במעבדה (NLAC), טייוואן. כל העכברים התרבו וכל זמן תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים. פרוטוקולים ונהלי שימוש בבעלי החיים היו נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של לאומית טייוואן המכללה לרפואה של האוניברסיטה (הרשאה מס &#39;: 20,120,075). בנוסף, חוקרים עשו כל מאמץ כדי לצמצם את הפוטנציאל לכאב, לסבל, או מצוקה בבעלי החיים בעת ביצוע ניסויים. כל ההליכים המתוארים בוצעו ב RT בכפפות. 1. הכנת AC-6 תאי מזין הערה: AC-6.21 (AC-6 בקיצור) שורת תאי סטרומה 18 (המסופקת על ידי י &#39;וייסמן, אוניברסיטת סטנפורד) יש לשמור בRPMI בתוספת 15% בסרום חום מומת שור עוברי (FBS). לשמש כתאים מזינים, AC-6 תאים עם 3,000 rad (30Gy) יום אחד לפני שיתוף התרבות למניעת תפוצתם מוקרן γ. ה הערהבAC-6 תאים נוטים לאבד את היכולת לתמוך ב- ההתמיינות שלהם אם נותרו צפוף בתחזוקה, או אם מספר המעבר שלהם הוא מעל 20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף AC-6 תאים פעם אחת עם 1 מיליליטר פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) ולהסיר DPBS על ידי שאיפה. פנק את AC-6 תאים עם 0.8 מיליליטר פתרון טריפסין (טריפסין 0.05% ו -0.5 מ&quot;מ EDTA בDPBS) במשך 3-5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן לעצור את התגובה על ידי דילול זה עם 10 כרכים של מדיום תרבות להפוך את ההשעיה תא בודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע AC-6 תאים ב5.9x10 4 תאים / גם לתוך 12 גם צלחות ולדגור על 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2 O / N. הערה: הצפיפות של AC-6 תאים היא מאוד חשובה כמו צפיפות נמוכה תעדיף דור ה- CDC. זריעה בצפיפות של 5.9x10 4 תאים / גם יאפשר AC-6 כדי להגיע confluency ידי למחרת, שהוא אופטימלי לגזירה של pDCs מCLPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר את AC-6 תאים ב3,000 רד (30 Gy) באמצעות γ-irradiator. הערה: המינון שניתן ללהקרין AC-6 הוא מותאם כדי למנוע את התאים ממתרבים ועדיין לשמור אותם קיימא מספיק זמן כדי לספק את ציטוקינים ומגע תאי תאים דרושים להתמיינות של DCs מCLPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב ולהחליף עם 1 מיליליטר מלא RPMI (RPMI עם FBS מומת חום 10%, 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin וβ-mercaptoethanol 50 מיקרומטר). </li></ol> 2. תאים בודד בע&quot;מ מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים על ידי CO 2 מחנק ונקע בצוואר הרחם. מניחים את העכברים על מגש לנתיחה ולעקר עם 70% אתנול. עושה חתך באמצע הבטן-ולהסיר את העור מחלקו האחורי של העכבר כולל העור מכסה את הגפיים התחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עכברים במכסת מנוע חצי סטרילי. כדי לשחרר את עצם הירך וtibiae, קליפ עצם הירך מעל ומתחת tibiae מפרק הברך. לנתק את השרירים מהעצמות באמצעות מספריים ולמקם את העצמות בצלחת פטרי 6 סנטימטר המכילה 5 מ&quot;ל להשלים RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למכסת מנוע תרבות סטרילית. ממלאי מזרק 3 מיליליטר מחובר למחט 27G עם RPMI השלם. חותך את שני הקצוות של העצמות באמצעות מספריים, ולהכניס את מחט 27G כדי לשטוף את מוח מהעצמות בעדינות על ידי הזרקת RPMI השלם פעם אחת מכל קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה תא בודדת על ידי pipetting העדין התאים למעלה ולמטה 3-5 פעמים בצלחת התרבות באמצעות המזרק ללא המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים 5 דקות בXG 500 ולמזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי דם אדום Lyse עם חיץ 1 מיליליטר ACK (150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3, 0.1 מ&quot;מ EDTA) דוגרים דקות 1 ולעצור את התגובה על ידי דילול עם 10 כרכים של RPMI השלם. לאפשר לתאים לעמוד במשך 5 דקות כדי גלולה למטה גושי תאים מתים ופסולת רקמות על ידי כוח הכבידה. הערה: אל תעמוד יותר מ 5 דק &#39;כמו זה יגרום באובדן תא עקב שיקוע של תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant המכיל תא לאט למזוג לפסולת צינור עוזבת חדשהמאחורי בצינור המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 500 לגלולת התאים, ולאחר מכן להסיר ולבטל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כולל תאים בע&quot;מ (בדרך כלל 4-6 x 10 7 BM תאים מתקבלים מעכבר אחד) ב -100 μl חיץ FACS (1x PBS + 2% + 1 המ&quot;מ EDTA FBS). </li></ol> 3. FACS ניתוח ומיון של CLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אנטי-CD16 / 32 (2.4G2 שיבוט supernant hybridoma, 50 μl / תגובה או 1-2 מיקרוגרם / תגובה) לתאים במאגר FACS (שלב 2.9) במשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc. הערה: אנטי-CD16 / 32 גם נקרא בלוק FC, אשר מתווסף למניעה מחייבת הלא ספציפית של נוגדנים לתאים לבטא קולטנים Fc כוללים גרנולוציטים, מונוציטים, ולימפוציטים מסוג B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל להכתים תאים עם הנוגדנים הבאים ניאון שכותרתו צבע (ל4x10 7 תאים) במשך 15 דקות על קרח, הימנעות אור הסביבה. נוגדנים: סמני שושלת PE-מצומדת (0.2 מיקרוגרם לכל אחד) כולל אנטי-CD3 (17 א2), אנטי-CD8 (53-6.7), אנטי-B220 (RA3-6B2), אנטי-CD19 (eBio1D3), אנטי-CD11b (M1 / 70), אנטי-Gr-1 (RB6-8C5), אנטי Thy1.1 (HIS51), אנטי-NK1.1 (PK136), אנטי-TER119 (TER-119), ואנטי-MHC-II (נימר-4), 0.2 מיקרוגרם אנטי-ג-קיט-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 מיקרוגרם אנטי SCA-1-FITC (D7), 0.4 מיקרוגרם אנטי-M-CSFR-APC (AFS98), ושל 0.2 מיקרוגרם אנטי-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאים עם FACS חיץ 3 מיליליטר, וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 300 FACS μl חיץ ותאי סינון דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הצינור עם חיץ FACS 100 μl נוסף להתאושש כל תאים הנותרים ולסנן לFACS סטרילי מיון צינור תוך שימוש באותה מסננת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח התזרים cytometric מייד לאחר הצביעה באמצעות מסננים ומתחים מתאימים לגילוי אות. השתמש 488 ננומטר לייזר כדי לזהות את הנוגדנים שכותרת PerCP-Cy5.5 FITC-,, 561 ננומטר לייזר כדי לזהות פטרוביץ, ונוגדני PE-labelded-Cy7 ואס 633 ננומטראה לזהות את הנוגדן שכותרתו APC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את CLPs פי הסמנים הבאים לין - SCA-1 int M-CSFR int c-kit - IL-7Rα + (כמוכתם בשלב 3.2) באמצעות סדרן תא. לאסוף תאים הממוינים בצינור 15 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של RPMI מלא ככרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים, כפי שמוצג על ידי סדרן התא בסוף הריצה. בדרך כלל, ניתן להשיג 5x10 4 CLPs מBM של עכבר אחד. </li></ol> 4. CLPs וCoculture AC-6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים הממוינים מצעד 3.7 במשך 10 דקות ב 500 XG, להסיר את supernatant וresuspend התא גלולה עם מספיק RPMI השלם כדי להשיג צפיפות תאים סביב 5x10 מיליליטר / 4 תאים. תאי זרע 500 / גם לתוך הצלחת 12-המכילה גם תאים מזינים מוכנים בשלב 1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 ng / ml FL 19 (הו-Flt3L איג שנוצר בבית באמצעות מערכת ביטוי הניתנת על ידי מ &#39;מנז, Universiטאי החולים ציריך, שווייץ) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם ניטור חזותי תקופתי של פיתוח DC תחת מיקרוסקופ. הערה: FL האנושי רקומביננטי ניתן להשיג בחנויות או עכבר פלורידה יכולה לשמש כתחליף לhu-Flt3L איג לתמוך בפיתוח DC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים בsupernatant ביום 12 ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 0.5 מ&quot;ל להשלים בינוני RPMI שילוב supernatants וכתוצאה מכך. הוסף 0.5 מיליליטר בינוני טרי וגרוטאות התאים חסיד עם מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדיום המכיל תאים משני החלקים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי supernatant ו resuspend למזוג במאגר FACS 50 μl. להוסיף אנטי-CD16 supernatant 50 μl / 32 hybridoma דגירה במשך 1-2 דקות כדי לחסום קולטני Fc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנות ולהכתים את כל התאים עם הנוגדנים הבאים (0.05 מיקרוגרם לכל אחד) נגד CD11c-APC (N418), אנטי-CD11b-FITC, ואנטי-B220-PE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ו צנטריפוגות התאים כמו לתארד בשלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 100 μl FACS חיץ, שער ב+ CD11c ולנתח לcDCs (CD11c + CD11b + B220 -) וpDCs (CD11c + CD11b - + B220) 17. </li></ol>

<ol>
	<li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation.">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li><li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+cell+lineage:+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting.">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li><li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets.">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li><li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections,+autoimmunity,+and+tolerance.">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li><li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPC:+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors.">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li><li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+homeostasis.">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li><li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells.">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li><li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3++lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3++dendritic+cells+in+vivo.">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li><li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors.">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li><li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3.">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li><li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+differentiation:+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells.">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li><li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin.">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li><li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells:+recent+progress+and+open+questions.">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo.">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors.">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule.">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li><li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development.">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li><li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells.">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li><li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines:+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024.">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential.">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21.">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li><li>Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand.">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

כאן אנו מתארים מערכת במבחנה תרבות לדור החזקה של DCS, וpDCs בפרט, ממספר קטן של CLPs. ייחודה של מערכת זו התרבות הוא עקב השימוש של AC-6 תאים, שורת תאי סטרומה, כהאכלה. גישה זו הוכחה לספק לא רק ציטוקינים, כגון IL-7, SCF, M-CSF ופלורידה 20, אלא גם את קשר תאי תאים 21 הדרוש כדי לתמ...

תאים דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן מקצועיים שמשחקים תפקיד חשוב בשליטה על תגובות 1 חיסונית. בעוד DCs הוא הטרוגנית, הם יכולים להיות מסווגים באופן כללי לשתי אוכלוסיות, DCS קונבנציונלי (cDCs) וDCs plasmacytoid (PDC) 2,3. בנוסף לאיברי הלימפה, cDCs וpDCs נמצאים גם ברקמות כוללים סרטן ריאות, מעי, ועור 2. המורפולוגיה של cDCs וpDCs שונה, עם cDCs מציג תחזיות כמו דנדריט-והצורה של pDCs להיות כמו תא-יותר פלזמה. בנוסף, סמן העכבר הנפוץ DC, CD11c, באה לידי ביטוי גבוה יותר על cDCs מאשר על pDCs. יתר על כן, cDCs ניתן לחלק עוד יותר לתוך CD11b + CD24 - cDCs וCD11b - CD24 + cDCs, אשר שניהם מבטאים רמות גבוהות יותר של כיתת MHC II ומולקולות costimulatory מאשר לעשות pDCs 2. pDCs מבוגרים, לעומת זאת, הוכח להביע Siglec-H וBST2 4 סלקטיבי. Functionally, cDCs הוא אנטיגן טוב יותר מאשר הצגת תאי pDCs; עם זאת, pDCs יכול לייצר כמות עצומה של סוג אני אינטרפרון על זיהום בנגיף או גירוי דלקתי 5. cDCs וpDCs שניהם קצרים, ולכן, חייב להתחדש כל הזמן מאבות במח העצם (BM) 6,7. העברת מאמצת של אבות משותפים מיאלואידית (CMPS) ואבות הלימפה נפוצים (CLPs) לעכברים קטלני-המוקרנים מוכיחה כי יכולים להיות שנוצרו cDCs וpDCs משני השושלות 8-10. עם זאת, יש קבוצת משנה של pDCs המבטא RAG1 / 2 ויש מגזרי DJ מחדש במוקד IGH 11,12. תאים אלה גם לשתף דמיון מולקולרי עם לימפוציטים מסוג B, כוללים ביטוי של סמן B220, קולטני חישת חומצות גרעין (TLR7 / TLR9), וגורמי שעתוק (Spib וBcl11a) 13, כולל את כל האמינו להיות חתימות של השושלת הלימפה. לכן, CLPים עשוי להיות בחירה טובה עבור דור במבחנה של pDCs בגלל דמיון שושלת. בעוד התדירות של שני cDCs וpDCs בבני אדם ועכברים היא מאוד נמוכה 6 פלורידה, DCS, במיוחד cDCs, יכול להיות שנוצר במבחנה מBM או אבות בנוכחות ציטוקינים, כגון GM-CSF 11,14 או יגנד FLT3 ( ) באמצעות מערכות ללא מזין 11,15,16. למרבה הצער, עם זאת, לא ניתן לייצר מספר גדול של pDCs במבחנה באמצעות FL 11,15,16. בעבר הראה כי pDCs יכול להיות שנוצר במבחנה ביעילות מCLPs באמצעות מערכת המזין AC-6 17. היתרון של שימוש בקו תא סטרומה AC-6 במערכת התרבות הוא שהיא מספקת מגע תאי תאים והפרשה של ציטוקינים התומכים בדור של מספר הגדול של pDCs מCLPs. למרות שייצור עם מערכת זו הוא די חזק, השכפול זהיר של ההליכים המתוארים להלן נדרש אניכדי n כדי להבטיח דור יעיל של pDCs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108408</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108708</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse&#160; CD11b (PE), cloneM1/70</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101208</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115508</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103208</td>
			<td>linage marker/FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100308</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100707</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107608</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116208</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0900-83</td>
			<td>linage marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135510</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105824</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108106</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135014</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117328</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101206</td>
			<td>FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS sorting tube&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>Flow analysis sofrware</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro generation of murine plasmacytoid dendritic cells from common lymphoid progenitors using the ac-6 feeder system

תאים הדנדריטים Plasmacytoid (PDC) הם סוג חזק אני אינטרפרון תאים (IFN-I) ייצור המופעלים בתגובה לזיהום או בתגובות דלקתיות. למרבה הצער, מחקר של פונקצית PDC מתעכבת לפי התדירות הנמוכה שלהם באיברי הלימפה, ושיטות קיימות במבחנת דור DC בעיקר להעדיף הייצור של cDCs על pDCs. כאן אנו מציגים גישה ייחודית ליצירת יעילות pDCs מאבות הלימפה נפוצים (CLPs) במבחנה. באופן ספציפי, הפרוטוקול מתואר פרטים כיצד לטהר CLPs ממח עצם וליצור pDCs ידי coculturing עם AC-6 תאים מזינים מוקרן γ בנוכחות יגנד FLT3. מאפיין ייחודי של מערכת זו התרבות הוא שCLPs להעביר מתחת לAC-6 תאים ולהפוך לתאי יוצרי שטח מרוצפים, צעד קריטי להרחבת pDCs. DCs מורפולוגית המובהק, כלומר pDCs וcDCs, נוצרו לאחר כ -2 שבועות עם הרכב של 7pDCs 0-90% בתנאים אופטימליים. בדרך כלל, מספר pDCs שנוצר בשיטה זו הוא בערך פי 100 ממספר CLPs זרע. לכן, מדובר במערכת חדשנית שבה ליצירה וחסונה המספר הגדול של pDCs הנדרש כדי להקל על מחקרים נוספים להתפתחות והתפקוד של תאים אלה.

כולל של 4-6x10 7 תאים BM מבודדים בדרך כלל מעצמות ירך וtibiae של C57BL / 6 עכבר אחד 6-8 WK-ישן, wild-type. כדי למיין את CLPs, הכולל תאי BM מגואלות נוגדני PE מצומדות נגד סמני שושלת (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, וMHC-II), אנטי -c-קיט-PerCP / Cy5.5, אנטי SCA-1-FITC, אנטי-M-CSFR-APC ואנטי-IL-7Rα-PE / Cy7, ניתחו ומסודרי...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System at JoVE.com

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

8.3K Views.  National Taiwan University College of Medicine. In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. 

Video: In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

וגם בידוד Immunostaining ימפוציטים ותאי דנדריטים מהתיקונים של Peyer Murine

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...